一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法与流程

本发明涉及一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法。

背景技术：

细胞是一切生命活动的基本结构和功能单位。动物细胞的基本结构包括细胞质膜，细胞核，细胞质。细胞质膜是指围绕在细胞最外层，由脂质、蛋白质和糖类组成的生物膜，在结构上作为细胞的界限，使细胞具有一个相对稳定的内环境，同时可以介导细胞与环境之间的物质运输、能量转换及信息传递等过程。细胞质是指细胞质膜包围的除核区外的一切半透明、胶状、颗粒状物质的总称，由细胞质基质、内膜系统、细胞骨架和包含物组成，细胞质是生命活动的主要场所。细胞质包括基质、细胞器和后含物，在生活状态下为透明的胶状物。基质是指细胞质内呈液态的部分，是细胞质的基本成分，主要含有多种可溶性酶、糖、无机盐和水等。细胞器是分布于细胞质内、具有一定形态、在细胞生理活动中起重要作用的结构，包括线粒体、质体，内质网、高尔基体、溶酶体、细胞骨架（微丝、微管、中间纤维）、中心粒以及周围物质等。

细胞核是动物细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传与代谢的调控中心。细胞核主要由核被膜、核纤层、染色质、核仁及核体组成。细胞核是遗传信息的储存场所，与细胞遗传及代谢活动密切相关的基因复制、转录和转录初产物的加工过程均在此进行。染色质作为遗传物质的载体，是指间期细胞核内由dna、组蛋白、非组蛋白及少量rna组成的线性复合结构。染色质是细胞遗传与代谢调控中心的最重要成员，几乎所有细胞生命活动都要从染色质开始。与基因组直接相关的细胞活动都是在染色质水平进行，如dna复制、基因转录、同源重组、dna修复，包括转录偶联的修复以及dna和组蛋白的各种修饰。与染色质dna结合的蛋白质负责dna分子遗传信息的组织、复制和阅读。这些dna结合蛋白包括两类：一类是组蛋白，与dna结合但没有序列特异性；另一类是非组蛋白，与特定的dna序列或组蛋白相结合。

目前从组织或细胞全裂解液中分离提取染色质及其相关蛋白比较困难，没有较好的方法，本发明提供了一种能够快速简便提取染色质及其相关蛋白的方法，对于细胞核内各组分重要功能的研究具有重要意义。

技术实现要素：

本发明所提出的一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法，目的在于填补提取染色质及其相关蛋白这一领域的空白。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种提取动物细胞核内染色质及其相关蛋白的方法，包括以下步骤：

a.收集细胞

弃去培养液，使用稀释后的0.25%的胰酶溶液进行常规细胞消化，离心弃上清，保留细胞沉淀，用适量pbs重悬细胞沉淀，离心弃上清，保留沉淀；

b.细胞匀浆裂解

（1）向步骤a所得沉淀中加入buffer1，震荡后冰浴2-5分钟；

（2）将细胞悬液转移到预冷的玻璃匀浆器内，冰上匀浆50-60次左右后冰上静置1-2h；

（3）600-800g，4℃离心5-10分钟，得到的沉淀即粗细胞核组分；

（4）吸取步骤b（3）所得上清，600-800g，4℃，5-10分钟，反复多次离心，直至没有沉淀，最终得到的上清即为胞浆和胞膜的混合组分；

c.细胞核的制备

用适量buffer1重悬步骤b（3）得到的粗核，离心弃上清；重复上述离心过程4-5次，最终得到的沉淀即为完整且纯度较高的细胞核组分；

d.细胞染色质及其相关蛋白的分离

（1）用适量的buffer2溶解细胞核组分，冰浴30-60min，离心，获得沉淀和上清，上清即为核内可溶性组分；

（2）将步骤d（1）得到的沉淀用buffer2重悬，离心，弃去上清，重复离心2-3次，最终得到的沉淀即为细胞核内不溶性的染色质组分；

e.染色质相关蛋白的检测

（1）胞浆和胞膜的混合组分以及核内可溶性组分：根据上清体积加1/3体积的三氯醋酸水溶液，-20℃过夜。第二天取出，4000-5000g，4℃离心5-10分钟，弃上清，冰上干燥后加入1×sds细胞裂解液，4℃裂解蛋白；

（2）细胞核组分以及细胞核内不可溶性的染色质及其相关蛋白组分：直接加入1×sds细胞裂解液，4℃裂解蛋白；

上述组分蛋白裂解后加热变性，测蛋白浓度，进行westernblot检测。

所述步骤a中使用稀释后的0.25%的胰酶溶液进行常规细胞消化，1000rpm，离心5-10分钟后弃上清，保留细胞沉淀，用适量pbs重悬细胞沉淀，800-900g，离心5-10分钟后弃上清，保留沉淀。

所述步骤b（1）中按照每1×10⁷个细胞加500-600μl体积的比例加入适量的buffer1。

所述步骤c中用适量buffer1重悬步骤b（3）得到的粗核，4000-5000g，4℃离心5-10分钟，弃上清；

所述步骤d（1）和d（2）低速离心条件为1700-2000g，5-10分钟，4℃。

本发明获得了如下有益效果：

使用本发明所述方法获得的纯度较高的染色质及其相关蛋白，不含有胞浆和胞膜成分。解决了目前提取染色质及其相关蛋白比较困难的问题，为染色质及其相关蛋白的功能研究提供了实验基础，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实验方法流程图；

图2是westernbloting检测本发明所述方法获得的各组分中内参蛋白表达图。

具体实施方式

为了进一步阐释本发明的技术方案及其所实现的技术效果，以人乳腺癌细胞系mda-mb-231为例，下面将结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明。

本发明实验方法流程图参见图1。

一、溶液的配置

（1）buffer1：含10mmhepes（ph为7.9），1.5mmmgcl2，0.34m蔗糖，10%甘油，1mm二硫苏糖醇和磷酸酶抑制剂。

（2）buffer2：含有3mmedta，0.2mmegta，1mm二硫苏糖醇，以及磷酸酶抑制剂。

（3）500mmhepes溶液配方：天平称取hepes粉末5.9575g，溶于40ml的ddw中。再用0.5mnaoh溶液调整ph值至7.9，用ddw定容到50ml即可。使用前稀释到指定浓度。

二、实验方法及结果

使用人乳腺癌细胞系mda-mb-231进行以下实验。人乳腺癌细胞系mda-mb-231构自美国atcc（americantypeculturecollection）细胞库，细胞使用dmem培养基（添加10%的胎牛血清fbs、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素）培养。细胞置于37℃细胞培养箱，5%co2的环境中培养。培养液用量为每10cm培养皿使用10ml含血清培养液。

1.收集细胞

首先弃去培养液，再用常温的pbs溶液清洗培养皿3次，用无菌移液管吸去残留液体。使用稀释后的0.25%的胰酶溶液（优选1：3稀释）进行常规细胞的消化过程，约1分钟。终止细胞细化后，将细胞悬液转移到离心管中，800g离心10分钟。弃去上清，得到细胞沉淀。

2.对细胞进行匀浆裂解

（1）按照每1×10⁷个细胞加500μl体积的比例加入适量的buffer1。首先震荡混合液使得细胞充分重悬，再行冰浴2分钟。

（2）将细胞重悬液转移到冰上预冷的玻璃匀浆器内（2mldounce匀浆器，每个匀浆器最多加500μl悬液），在冰上进行上下方向的手动匀浆约50次左右，之后在冰上静置一小时左右（注意：破碎细胞是提取细胞成分的关键环节，有效的研磨方式是上下方向的推拉研磨）。

（3）将匀浆器内的细胞裂解混合物转移到预冷的1.5mlep管中。再以800g，4℃离心5分钟。此时得到的沉淀则是细胞核的粗制品。

（4）吸取上清并转移到新的预冷ep管中。800g，4℃，5分钟多次离心，直至上清离心后管底无肉眼可见沉淀，此时最终得到的上清则是胞浆和胞膜的混合组分（上清1）。3.细胞核的制备

3.加入与2（1）等量的buffer1于步骤2（3）得到的粗核沉淀中，混合均匀。再以4000g，4℃离心5分钟后，弃上清。重复这一离心过程4-5次，最后离心后上清应清亮。弃去上清，此时得到的沉淀为完整没有破碎的细胞核（沉淀1）。

4.细胞染色质及其相关蛋白的分离

（1）用适量的buffer2溶解细胞核（沉淀1），冰上作用30分钟，再低速离心（1700g，5分钟，4℃）进一步获得沉淀和上清2（核内可溶性组分）。

（2）将步骤4（1）得到的沉淀用buffer2重悬后，离心（1700g，5分钟，4℃），得到沉淀2（核内不溶性染色质组分）。

5.染色质相关蛋白的检测

（1）对于获得的上清1（胞浆和胞膜的混合组分）以及上清2（核内可溶性组分）：需要根据最终获得的上清体积，加1/3体积的三氯醋酸水溶液（30%）混匀，置于-20℃中过夜。第二天取出，5000g，4℃离心10分钟，弃去上清。再打开ep管盖，冰上空气略干约30分钟左右，加适量细胞裂解液（1×sdslysisbuffer），4度裂解蛋白。

（2）对获得的沉淀1（细胞核）以及沉淀2（细胞核内不可溶性的染色质及其相关蛋白组分），直接加入适量的1×sds细胞裂解液，4℃裂解蛋白。

上述组分蛋白裂解后即可加热变性，测蛋白浓度，进行常规westernblot检测即可。

6.westernblot实验

使用上述染色质及其相关蛋白提取方法得到以下各组分，进行蛋白样本制备，进行westernblot实验。

另外pmsf储存浓度为100mm，用前加，添加比例为1:1000。最终定容为10ml。

westernblot实验过程

（1）选择sds-page浓缩上胶浓度为5%，分离下胶浓度为8%。

（2）使用恒流进行电泳分离，样本处于浓缩上胶（一块胶）时使用20ma，浓缩胶30分钟左右的时间。样本开始进入下胶开始分离时，则将电流设置为40ma（相应的电压应该小于110v）。分离过程需要约1.5小时。

（3）使用湿法转膜，恒流250ma转膜3小时。

（4）室温封闭1小时，一抗采用4度过夜孵育，二抗室温孵育50分钟。使用的抗体浓度：

使用胞核表达蛋白histone作为胞核组分的阳性对照，胞浆表达蛋白β-actin作为胞浆组分的阳性对照。

实验结果表明（参见图2）：β-actin（胞浆组分的阳性对照）在胞浆和胞膜的混合组分中有表达，在胞核组分（上清1）、核内不可溶性的染色质及其相关蛋白组分（沉淀2）和核内可溶性组分（上清2）中均无表达；histone（染色质的组成蛋白，属于核内不可溶组分）在胞核组分（上清1）和核内不可溶性的染色质及其相关蛋白组分（沉淀2）中均有表达，而在胞浆和胞膜的混合组分（上清1）和核内可溶性组分（上清2）中无表达。此结果验证了该方法提取的染色质及其相关蛋白没有掺杂胞浆、胞膜组分，提取方法有效。