一种假俭草总dna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种假俭草总DNA的提取方法，涉及分子生物学领域中植物提取总DNA的技术。其主要步骤是:向研磨成细粉状的假俭草叶片中加入细胞核提取缓冲液，经硅珠进行DNA吸附、洗脱及DNA纯化，析出。本发明使用硅珠，能有效吸附出DNA，去除多糖、多酚、色素和蛋白质等次生代谢物质，提取得到高质量的假俭草总DNA。本发明能从低温保存的假俭草组织和新鲜组织中提取高质量的假俭草总DNA。本发明适用于假俭草高质量总DNA的提取。
【专利说明】一种假俭草总DNA提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于草业学科中的分子生物学领域，特别涉及一种假俭草总DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]假俭草(Eremochloaophiuroides (Munr0.)Hack.)，又称百足草、娱蚁草，为禾本科蜈蚣草属多年生宿根性优良草坪植物，也是蜈蚣草属中唯一可用作草坪草的物种。假俭草除在东南亚有很少量分布外，在我国长江流域及以南地区的丘陵山地、平原以及各类湿地广泛分布，是国外公认的起源于中国的最好的暖季型草坪草，所以称之为“中国草坪草”。该草以耐瘠薄、病虫害少及养护要求低而著称，所以国外又称之为“懒人草”。此外，假俭草有非常好的耐酸性，其耐酸性是禾本科中最强的，可以在江西等强酸性红壤地区生长繁殖，这在草类物种中也非常少见。假俭草可广泛用于庭院草坪、休憩草坪及护坡草坪的建植，特别适合于水土保持和大面积景观建设，是世界三大暖季型草坪草之一。假俭草不仅可以用作草坪草，也是很好的牧草，为牛羊等草食动物喜食。随着全球水资源和能源的日益紧张以及人们环保意识的不断增强，选择质地适中、适应性强及养护要求低的草种已是草坪草品种选育的主要目标，而假俭草非常符合这一发展趋势。因此，在国内外假俭草越来越广泛地应用于草坪生产和环境绿化。
[0003]总DNA的提取是分子生物学实验的非常关键的一个环节，其质量直接影响分子生物学实验中与DNA有关的后续实验的进行。假俭草是一种富含次生代谢物质的一个物种，传统的DNA提取方法不易提取得到高质量的总DNA。由于次生代谢产物的种类及其复杂，不同物种，同一物种不同季节，不同年龄的叶片之间的次生代谢产物也有较大区别。因此，一种植物的总DNA提取方法往往不能很好的应用于另一种植物总DNA的提取。
【发明内容】
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[0004]本发明为了克服现有技术的不足，提供一种可分离出纯度高，完整性好的假俭草总DNA提取方法。
[0005]本发明是通过以下技术方案得以实现的:
[0006]一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:具体操作步骤如下:
[0007](I)称取0.2g假俭草，置于液氮研磨机中研磨，磨细后的假俭草转移至2mL的离心
管中；
[0008](2)在2ml离心管中加入0.7mL的CTAB提取缓冲液和14 μ L β -巯基乙醇，盖上离心管盖，混合均匀，在65°C水中温浴30min，期间颠倒混匀5_6次；
[0009](3)将温浴后的样品取出，冷却至室温，向2ml离心管中加入0.7mL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，盖上离心管盖，上下颠倒充分混匀，置于离心机，在转速IlOOOrpm离心15min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中；
[0010](4)在1.5mL离心管中加入150 μ L硅珠悬浮液，用涡旋震荡器混匀，室温静止IOmin后，在涡旋震荡器上涡旋震荡5s，再置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；
[0011](5)将步骤(4)得到硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液,充分混勻，置于离心机在转速8000rpm离心15s,倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；
[0012](6)重复步骤(5) 一次；
[0013](7)将步骤(6)得到的硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋分散，力口入lmL70%酒精将硅珠-核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次后，将硅珠-核酸复合物自然风干；
[0014](8)向装有步骤(7)得到的硅珠-核酸复合物的离心管中加入IOOyL TE缓冲液，并在涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使之充分分散，在56°C水中温浴IOmin后，置于离心机在转速IlOOOrpm离心5min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中，得到分离物娃珠和
上层清液；
[0015](9)将步骤(8)中得到的硅珠置于涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使硅珠和残留的核酸充分分散，再向其加入IOOyL TE缓冲液，置于涡旋震荡器中进行充分涡旋震荡后，在56°C温浴IOmin,置于离心机在转速12000rpm离心5min,吸取上层清液,装入步骤(8)中上层清液的1.5ml离心管；将该离心管置于离心机在转速12000rpm离心lOmin，吸取上层清液，并加入400 μ L TE缓冲液，充分混匀，得到混合液；
[0016](10)向装有步骤(9)的混合液的离心管中加入600 μ L含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，混匀；置于离心机在轾速_12000rpm离心IOmin ;吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中；`
[0017](11)重复步骤(10)—次；
[0018](12)向装有步骤(11)得到的上层清液的离心管中加入3M，pH为5.2的60 μ LNaAC,再加入600 μ L在_20°C预冷的异丙醇，置于离心机在转速IOOOOrpm离心15min ;倒掉上层清液，得到下层的DNA;
[0019](13)在步骤(12)中得到的DNA，加入700 μ L体积浓度70%的酒精洗DNA，置于离心机在转速IOOOOrpm离心5min,倒掉上层清液,得到下层的DNA ；
[0020](14)重复步骤(13)两次；
[0021](15)向步骤(14)中得到的DNA加入700 μ L无水乙醇，进行清洗，置于离心机在较il_10000rpm离心5min，倒掉上层清液，并用黄枪头吸干酒精，得到纯化DNA ；
[0022](16)将步骤(15)得到的纯化DNA置于室温自然风干，然后向其加入200μ L TE缓冲液溶解，保存在_20°C冰箱中。
[0023]以上所述的CTAB 提取缓冲液成分为:2%CTAB, IOmM Tris-HCl, 8mM EDTA, 1.4MNaCl，5%PVP, pH 值为 8.0。
[0024]以上所述的TE 溶液成分为:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8.0。
[0025]以上所述的硅珠悬浮液是将1.2g硅珠粉加入IOmL已灭菌的超纯水中，混合均匀--? 。
[0026]以上所述的漂洗液是IOOmL的pH为6.4的100mM/L Tris-HCl溶解120g异硫氰酸胍(GuSCN)所得漂洗液。[0027]以上步骤(4)所述的上层清液用硅珠悬浮液按步骤(4)用来进行多次提取硅珠-核酸复合物。
[0028]工作原理:
[0029]经液氮研磨的假俭草叶片在65°C CTAB提取液中裂解细胞，再经过氯仿:异戊醇(24:1)萃取，离心分离后转移上清，得到絮状的DNA沉淀，DNA经硅珠吸附，并在较高温度下用低盐溶液洗脱，再利用氯仿:异戊醇(24:1)萃取，沉淀，最后利用70%乙醇洗涤DNA沉淀，即可得到高质量的假俭草DNA样品。
[0030]本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果:
[0031]1、本发明中的硅珠悬浮液中的硅珠，能有效的吸附出DNA，同时利用漂洗液可以去除叶片中富含的多糖、多酚、色素和蛋白质等次生代谢物质的干扰，得到多糖、多酚和色素等杂质少的高质量假俭草总DNA。
[0032]2、本发明能从长期低温(_20°C以下)储存的假俭草叶片和新鲜叶片中提取到高质量的总DNA。
[0033]3、本发明适用于基因组测序等方面所需高质量总DNA的提取，能满足分子生物学研究的要求。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为假俭草总DNA质量电泳图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
[0036]实施例1:
[0037]选取假俭草当年生叶片(6月中旬)2份和_70°C保存一个月的样品2份，共4个基因型，使用本发明方法进行下述提取:
[0038]一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:具体操作步骤如下:
[0039](I)称取0.2g假俭草，置于液氮研磨机中研磨，磨细后的假俭草转移至2mL的离心
管中；
[0040](2)在2ml离心管中加入0.7mL的CTAB提取缓冲液和14 μ L β -巯基乙醇，盖上离心管盖，混合均匀，在65°C水中温浴30min，期间颠倒混匀5_6次；其中，CTAB提取缓冲液成分为:2%CTAB, IOmM Tris-HCl, 8mM EDTA, 1.4M NaCl, 5%PVP, pH 值为 8.0 ；
[0041](3)将温浴后的样品取出，冷却至室温，向2ml离心管中加入0.7mL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，盖上离心管盖，上下颠倒充分混匀，置于离心机，在转速IlOOOrpm离心15min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中；
[0042](4)在1.5mL离心管中加入150 μ L硅珠悬浮液，用涡旋震荡器混匀，室温静止IOmin后，在涡旋震荡器上涡旋震荡5s，再置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；其中，硅珠悬浮液是将1.2g硅珠粉加入IOmL已灭菌的超纯水中，混合均匀而成；
[0043](5)将步骤(4)得到硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液，充分混匀，置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；其中，漂洗液是IOOmL的pH为6.4的100mM/LTris-HCl溶解120g异硫氰酸胍(GuSCN)所得漂洗液；
[0044]( 6 )重复步骤(5 ) 一次；
[0045](7)将步骤(6)得到的硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋分散，力口入lmL70%酒精将硅珠-核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次后，将硅珠-核酸复合物自然风干；
[0046](8)向装有步骤(7)得到的硅珠-核酸复合物的离心管中加入IOOyL TE缓冲液，并在涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使之充分分散，在56°C水中温浴IOmin后，置于离心机在转速IlOOOrpm离心5min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中，得到分离物娃珠和上层清液；其中，TE溶液成分为:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8.0 ；
[0047](9)将步骤(8)中得到的硅珠置于涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使硅珠和残留的核酸充分分散，再向其加入100 μ L TE缓冲液，置于涡旋震荡器中进行充分涡旋震荡后，在56°C温浴IOmin,置于离心机在转速12000rpm离心5min,吸取上层清液,装入步骤(8)中上层清液的1.5ml离心管；将该离心管置于离心机在转速12000rpm离心lOmin，吸取上层清液，并加入400 μ L TE缓冲液，充分混匀，得到混合液；
[0048](10)向装有步骤(9)的混合液的离心管中加入600 μ L含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，混匀；置于离心机在转速12000rpm离心IOmin ;吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中；
[0049](11)重复步骤(10)—次；
[0050](12)向装有步骤(11)得到的上层清液的离心管中加入3M，pH为5.2的60μ LNaAC,再加入600 μ L在_20°C预冷的异丙醇，置于离心机在转速IOOOOrpm离心15min ;倒掉上层清液，得到下层的DNA;`
[0051](13)在步骤(12)中得到的DNA，加入700 μ L体积浓度70%的酒精洗DNA，置于离心机在转速IOOOOrpm离心5min,倒掉上层清液,得到下层的DNA ；
[0052](14)重复步骤(13)两次；
[0053](15)向步骤(14)中得到的DNA加入700 μ L无水乙醇，进行清洗，置于离心机在转速IOOOOrpm离心5min，倒掉上层清液，并用黄枪头吸干酒精，得到纯化DNA ；
[0054](16)将步骤(15)得到的纯化DNA置于室温自然风干，然后向其加入200μ L TE缓冲液溶解，保存在_20°C冰箱中。
[0055]实施例2:
[0056]选取假俭草当年生叶片(6月中旬)2份和_70°C保存一个月的样品2份，共4个基因型，使用本发明方法进行下述提取:
[0057]—种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:具体操作步骤如下:
[0058](I)称取0.2g假俭草，置于液氮研磨机中研磨，磨细后的假俭草转移至2mL的离心
管中；
[0059](2)在2ml离心管中加入0.7mL的CTAB提取缓冲液和14 μ L β -巯基乙醇，盖上离心管盖，混合均匀，在65°C水中温浴30min，期间颠倒混匀5_6次；其中，CTAB提取缓冲液成分为:2%CTAB, IOmM Tris-HCl, 8mM EDTA, 1.4M NaCl, 5%PVP, pH 值为 8.0 ；
[0060](3)将温浴后的样品取出，冷却至室温，向2ml离心管中加入0.7mL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，盖上离心管盖，上下颠倒充分混匀，置于离心机，在转速IlOOOrpm离心15min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中；
[0061](4)在1.5mL离心管中加入150 μ L硅珠悬浮液，用涡旋震荡器混匀，室温静止IOmin后，在涡旋震荡器上涡旋震荡5s，再置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；其中，硅珠悬浮液是将1.2g硅珠粉加入IOmL已灭菌的超纯水中，混合均匀而成；该上层清液用硅珠悬浮液进行3次提取硅珠-核酸复合物。
[0062](5)将步骤(4)得到硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液，充分混匀，置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物；其中，漂洗液是IOOmL的pH为6.4的100mM/LTris-HCl溶解120g异硫氰酸胍(GuSCN)所得漂洗液；
[0063]( 6 )重复步骤(5 ) 一次；
[0064](7)将步骤(6)得到的硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋分散，力口入lmL70%酒精将硅珠-核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次后，将硅珠-核酸复合物自然风干；
[0065](8)向装有步骤(7)得到的硅珠-核酸复合物的离心管中加入IOOyL TE缓冲液，并在涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使之充分分散，在56°C水中温浴IOmin后，置于离心机在转速IlOOOrpm离心5min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中，得到分离物娃珠和上层清液；其中，TE溶液成分为:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH8.0 ；
[0066](9)将步骤(8)中得到的硅珠置于涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使硅珠和残留的核酸充分分散，再向其加入IOOyL TE缓冲液，置于涡旋震荡器中进行充分涡旋震荡后，在56°C温浴IOmin,置于离心机在转速12000rpm离心5min,吸取上层清液,装入步骤(8)中上层清液的1.5ml离心管；将该离 心管置于离心机在转速12000rpm离心lOmin，吸取上层清液，并加入400 μ L TE缓冲液，充分混匀，得到混合液；
[0067](10)向装有步骤(9)的混合液的离心管中加入600 μ L含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，混匀；置于离心机在转速12000rpm离心IOmin ;吸取上层清液，转移至新的
1.5mL离心管中；
[0068](11)重复步骤(10)—次；
[0069](12)向装有步骤(11)得到的上层清液的离心管中加入3M，pH为5.2的60μ LNaAC，再加入600μL在-2(rC预冷的异丙醇，置于离心机在转速 IOOOOrpm离心15min ;倒掉上层清液，得到下层的DNA;
[0070](13)在步骤(12)中得到的DNA，加入700 μ L体积浓度70%的酒精洗DNA，置于离心机在转速IOOOOrpm离心5min,倒掉上层清液,得到下层的DNA ；
[0071](14)重复步骤(13)两次；
[0072](15)向步骤(14)中得到的DNA加入700 μ L无水乙醇，进行清洗，置于离心机在较il_10000rpm离心5min，倒掉上层清液，并用黄枪头吸干酒精，得到纯化DNA ；
[0073](16)将步骤(15)得到的纯化DNA置于室温自然风干，然后向其加入200μ L TE缓冲液溶解，保存在_20°C冰箱中。
[0074]结果检测:
[0075]—、用琼脂糖凝胶电泳法检测本方法提取的假俭草总DNA。[0076]如图1，本方法对6月份采集的当年生假俭草叶片新鲜样品(左边)2份和低温储存一个月的假俭草叶片样品(右边)2份，均检测到清晰的电泳条带。说明本方法适合低温保存的假俭草叶片和当年生新鲜叶片的总DNA的提取。
[0077]二、紫外分光光度计法检测本方法提取的假俭草叶片总DNA的质量和产量。
[0078]以本发明提取的假俭草叶片总DNA为例，用紫外分光光度计(HITACHI U-2900)检测其质量和产量。测定DNA在波长260纳米和280纳米的吸光值，并计算A260/A280比值，结果见下表:
【权利要求】
1.一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:具体操作步骤如下: (1)称取0.2g假俭草，置于液氮研磨机中研磨，磨细后的假俭草转移至2mL的离心管中； (2)在2ml离心管中加入0.7mL的CTAB提取缓冲液和14 μ L β -巯基乙醇，盖上离心管盖，混合均匀，在65°C水中温浴30min，期间颠倒混匀5_6次； (3)将温浴后的样品取出，冷却至室温，向2ml离心管中加入0.7mL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，盖上离心管盖，上下颠倒充分混匀，置于离心机，在转速I IOOOrpm离心15min，吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中； (4)在1.5mL离心管中加入150 μ L硅珠悬浮液，用涡旋震荡器混匀，室温静止IOmin后，在涡旋震荡器上涡旋震荡5s，再置于离心机在转速8000rpm离心15s，倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物； (5)将步骤(4)得到硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋，使其完全分散，然后加入0.7mL漂洗液,充分混勻，置于离心机在转速8000rpm离心15s,倒出上层清液后，得到下层的硅珠-核酸复合物； (6)重复步骤(5)—次; (7)将步骤(6)得到的硅珠-核酸复合物置于涡旋震荡器中进行充分涡旋分散，加入ImL 70%酒精将硅珠-核酸复合物漂洗两次，再用无水乙醇漂洗一次后，将硅珠-核酸复合物自然风干； (8)向装有步骤(7)得到的硅珠-核酸复合物的离心管中加入IOOyLTE缓冲液，并在涡旋震荡器中进行涡旋震荡 ，使之充分分散，在56°C水中温浴IOmin后，置于离心机在转速IlOOOrpm离心5min,吸取上层清液,转移至新的1.5mL离心管中，得到分离物娃珠和上层清液； (9)将步骤(8)中得到的硅珠置于涡旋震荡器中进行涡旋震荡，使硅珠和残留的核酸充分分散，再向其加入100 μ L TE缓冲液，置于涡旋震荡器中进行充分涡旋震荡后，在56°C温浴IOmin,置于离心机在转速12000rpm离心5min,吸取上层清液,装入步骤(8)中上层清液的1.5ml离心管；将该离心管置于离心机在转速12000rpm离心lOmin，吸取上层清液，并加Λ 400 μ L TE缓冲液，充分混匀，得到混合液； (10)向装有步骤(9)的混合液的离心管中加入600μL含有氯仿与异戊醇比例为24:1的混合液，混匀；置于离心机在转速12000rpm离心IOmin ;吸取上层清液，转移至新的1.5mL离心管中； (11)重复步骤(10)一次； (12)向装有步骤(11)得到的上层清液的离心管中加入3M，pH为5.2的60 μ L NaAC,再加入600 μ L在_20°C预冷的异丙醇，置于离心机在转速IOOOOrpm离心15min ;倒掉上层清液，得到下层的DNA; (13)在步骤(12)中得到的DNA，加入700μ L体积浓度70%的酒精洗DNA，置于离心机在转速IOOOOrpm离心5min,倒掉上层清液,得到下层的DNA ； (14)重复步骤(13)两次； (15)向步骤(14)中得到的DNA加入700μ L无水乙醇,讲行清洗，置于离心机在转谏IOOOOrpm离心5min，倒掉上层清液，并用黄枪头吸干酒精，得到纯化DNA ；(16)将步骤(15)得到的纯化DNA置于室温自然风干，然后向其加入200 μ L TE缓冲液溶解，保存在_20°C冰箱中。
2.根据权利要求1所述的一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:所述的CTAB提取缓冲液成分为:2%CTAB, IOmM Tris-HCl, 8mM EDTA, 1.4M NaCl, 5%PVP, pH 值为 8.0。
3.根据权利要求1所述的一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:所述的TE溶液成分为:10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH 8.0。
4.根据权利要求1所述的一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:所述的硅珠悬浮液是将1.2g硅珠粉加入IOmL已灭菌的超纯水中，混合均匀而成。
5.根据权利要求1所述的一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:所述的漂洗液是IOOmL的pH为6.4的100mM/L Tris-HCl溶解120g异硫氰酸胍(GuSCN )所得漂洗液。
6.根据权利要求1所述的一种假俭草总DNA提取方法，其特征在于:步骤(4)所述的上层清液用硅珠悬浮液按步骤 (4)用来进行多次提取硅珠-核酸复合物。
【文档编号】C12N15/10GK103436525SQ201310358777
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月16日 优先权日:2013年8月16日
【发明者】王鹏良, 杨利平, 覃子海, 吴幼媚, 陈晓明, 陈博雯, 刘海龙, 蔡玲, 韦颖文, 黄金使, 黄宏喜 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院