一种适用于烟草种子的rna提取方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学【技术领域】，具体是一种从烟草种子中提取RNA的方法，其特征在于：实验中先用物理方法除去脂类物质，之后用醋酸钠和异丙醇重复沉淀RNA，并用DNaseI去除RNA中的基因组DNA；最终得到浓度高、质量好、完整性好的RNA。本发明相比现有技术所具备的优点在于：1.提供了一种适合烟草种子总RNA的提取方法。2.有效去除了脂类物质。3.DNaseI除去提取RNA中的基因组DNA污染。4.用NaAc和异丙醇共沉淀去除多糖类物质。5.异丙醇在室温下沉淀RNA能最大程度的降低盐的共沉淀，减少盐类物质对后续实验的影响。6.可大大节约提取时间，实验效果好。
【专利说明】-种适用于烟草种子的RNA提取方法
[0001]
【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种烟草种子中总RNA提取方法，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0003] 烟草是世界上重要的经济作物之一，也是一种重要的模式作物，其在植物生物学 包括生理学、分子生物学及遗传学研究中具有重要的作用。总RNA的提取技术是烟草分 子生物学的基本实验技术，高质量(纯度高，完整性好）的RNA是进行一些分子生物学实验 包括逆转录、Northern杂交、cDNA文库构建、基因芯片实验及转录组学分析的关键。烟草 成熟种子中富含脂类、蛋白和多糖类物质，其主要的营养贮藏物质是油和脂肪（约占干重 的42%-43%)，其次是蛋白质（约占干重的20%)，多糖类物质的含量也比较多（约占干重的 17%-19%)。这些物质往往会干扰RNA的分离和纯化，能否有效的去除脂类、蛋白质、多糖是 提高RNA质量的关键。但是目前报道的提取RNA方法或者商业化的试剂盒多针对幼嫩的植 株组织或植株，很少有针对种子的RNA提取方法。丁福章等（2007)研究了烟草不同组织总 RNA的提取方法，发现试剂盒法和Trizol法只能提取根、茎、叶、蕾和花的总RNA，并不能提 取种子中总RNA。用CTAB法虽然能从种子中提取RNA，但是也有其自身的缺点。一般CTAB 法提取RNA要用LiCl和异丙醇先后沉淀RNA，虽然能去除蛋白和多糖，但是一般RNA都要沉 淀过夜，且对小分子RNA的沉淀效果不好，另外用异丙醇沉淀RNA则会有基因组DNA污染， 并且最后得到的RNA浓度并不高。
【发明内容】
[0004] 本发明目的正是针对上述现存方法存在的不足而专门设计的高效提取烟草种子 中总RNA的方法，不仅可以有效的去除脂类物质、蛋白质、多糖以及基因组DNA干扰，能得到 纯度高，完整性好的RNA，另外可以大大节约实验时间。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种从烟草种子中提取RNA的方法，依次包括以下步骤： 1) 取适量烟草种子在提前预冷的小研钵中用液氮充分研磨，直至研成细粉末状； 2) 转移至1. 5ml的离心管中，并加入700 μ?的RNA提取缓冲液（65°C温育30min以上， 用之前加入5% V/V的β巯基乙醇）充分混匀，后置于65°C温育lOmin，用灭菌的牙签或枪 头去除脂类物质。
[0006] 3)加入提取缓冲液等体积的等体积的氯仿：异戊醇，氯仿：异戊醇为24 : 1，充分 震荡混勻； 4) 4°C，12000 Xg 离心 10 min,取上清； 5 )所取上清重复3和4步骤，取上清，上清中加入1/10体积的3Mo 1醋酸钠溶液（pH5. 0 ) 和与上清等体积的异丙醇，室温放置15 min沉淀RNA ; 6) 4°C，12000Xg离心20min，弃去上清，会发现RNA以片状沉积在离心管底部； 7) 70%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，无核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因组DNA ; 8) 重复加入RNA水溶液1/10体积的3Mol醋酸钠溶液（pH5. 0)和与RNA水溶液等体积 的异丙醇，室温放置15 min沉淀RNA ; 9) 4°C 12000Xg离心20分钟，弃上清； 10) 70%的乙醇清洗沉淀两次，在超净工作台干燥（时间可适当延长，但是不可过度干 燥)，加入无核酸酶的ddH 20溶解RNA，置于-70°C保存备用。
[0007] 所述烟草种子为成熟的烟草种子。
[0008] 所述 RNA提取缓冲液成分如下：2% 的 CTAB(W/V)，100mMol/L 的 Tris-HCl(pH8. 0)， 2.5 mMol/LEDTA ,2. OMol/L NaCl, 上述所有步骤中用到的试剂和耗材都经过DEPC处理。
[0009] 本发明具有以下优点： 1.提供了一种适合烟草种子总RNA的提取方法。
[0010] 2.该提取方法通过灭菌枪头去除脂类物质。
[0011] 3. DNasel除去提取RNA中的基因组DNA污染。
[0012] 4.用NaAc和异丙醇共沉淀去除多糖类物质。
[0013] 5.异丙醇在室温下沉淀RNA能最大程度的降低盐的共沉淀，减少盐类物质对后 续实验的影响。
[0014] 6.提取的RNA浓度高，质量好，RNA完整性好。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1 CTAB法提取的烟草种子RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
[0017] 图2为本方法提取的烟草种子RNA的琼脂糖凝胶图。
[0018] 图3为CTAB方法提取的烟草种子RNA的Agilent 2100生物分析仪分析图（以 CTAB法提取烟草成熟种子为例说明）。
[0019] 图4为CTAB方法提取的烟草种子RNA的Agilent 2100生物分析仪分析图（以 CTAB法提取烟草露白种子为例说明）。
[0020] 图5为本发明方法提取的烟草种子RNA的Agilent 2100生物分析仪分析图（以实 施例1中的样品为例说明）。
[0021] 图6为本发明方法提取的烟草种子RNA的Agilent 2100生物分析仪分析图（以实 施例2中的样品为例说明）。
【具体实施方式】
[0022] 本发明将结合实施例作进一步的描述，但并不是限制本发明。
[0023] 实施例1 :从烟草红花大金元成熟种子中提取RNA 1)取适量成熟干燥的种子在提前预冷的小研钵中用液氮充分研磨，直至研成细粉末 状； 2) 转移至1. 5ml的离心管中，并加入700 μ?的RNA提取缓冲液（65°C温育30min以上， 用之前加入5% V/V的β巯基乙醇）充分混匀，后置于65°C温育lOmin，可用灭菌的枪头或 牙签剔除漂浮的脂质； 3) 加入提取缓冲液等体积的氯仿：异戊醇（24 : 1)，充分震荡混匀； 4) 4°C，12000 Xg 离心 10 min,取上清； 5 )所取上清重复3和4步骤，取上清，上清中加入1/10体积的3Mo 1醋酸钠溶液（pH5. 0 ) 和与上清等体积的异丙醇，室温放置15 min沉淀RNA ; 6) 4°C，12000Xg离心20min，弃去上清，会发现RNA以片状沉积在离心管底部； 7) 70%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，无核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因组DNA ; 8) 重复加入RNA水溶液1/10体积的3Mol醋酸钠溶液（pH5. 0)和与RNA水溶液等体积 的异丙醇，室温放置15 min沉淀RNA ; 9) 4°C 12000Xg离心20分钟，弃上清。
[0024] 10)70%的乙醇清洗沉淀两次，在超净工作台干燥(时间可适当延长，但是不可过度 干燥)，加入无核酸酶的ddH 20溶解RNA，置于-70°C保存备用。
[0025] 实施例2 : 取适量萌发过程中露白的种子，采用本方法提取RNA。
[0026] 提取完成后进行凝胶电泳检测和用Agilent 2100生物分析仪进行分析（图2 :1、 2代表成熟种子，3、4代表露白的种子；图5、6 :分别抽取成熟种子和露白种子的RNA进行 分析)，对照实施例可参照常规的CTAB法提取叶片中总的RNA (图1 :1、2代表成熟种子，3 和4分别代表露白的种子；图3、4 :分别抽取成熟种子和露白种子的RNA进行分析)，通过比 较发现，CTAB法提取的RNA通过琼脂糖凝胶电泳并没有发现5S RNA条带（图1)，Agilent 2100生物分析仪分析结果显示RNA浓度较低，且28S/18S的比值明显大于2. 0,说明所提取 的RNA完整性不好。本发明方法提取的烟草种子的总RNA的5S条带清晰可见（图2)，进一 步经Agilent 2100生物分析仪分析发现RNA浓度较高，28S/18S的比值在2. 0左右，说明 所提取RNA完整性好，本发明方法提取的RNA质量优于CTAB法提取的RNA。
【权利要求】
1. 一种从烟草种子中提取RNA的方法，其特征在于：依次包括以下步骤： 1) 取适量烟草种子在提前预冷的小研钵中用液氮充分研磨，直至研成细粉末状； 2) 转移至1. 5ml的离心管中，并加入700 μ?的RNA提取缓冲液充分混匀，后置于65°C 温育lOmin，剔除漂浮的脂质； 3) 加入提取缓冲液等体积的氯仿/异戊醇溶液，氯仿：异戊醇为24 : 1，充分震荡混 匀； 4) 4°C，12000 Xg 离心 10 min,取上清； 5) 所取上清重复3和4步骤，取上清，上清中加入1/10体积的3Mol醋酸钠溶液和与上 清等体积的异丙醇，室温放置15 min沉淀RNA ; 6) 4°C，12000Xg离心20min，弃去上清，会发现RNA以片状沉积在离心管底部； 7) 70%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，无核酸酶的ddH20溶解，加入DNasel 37°C消化20 min，去除RNA中少量的基因组DNA ; 8) 重复加入RNA水溶液1/10体积的3Mol醋酸钠溶液和与RNA水溶液等体积的异丙 醇，室温放置15 min沉淀RNA ; 9) 4°C 12000Xg离心20分钟，弃上清； 10) 70%的乙醇清洗沉淀两次，在超净工作台干燥，加入无核酸酶的ddH20溶解。
2. 根据权利要求1所述的从烟草种子中提取RNA的方法，其特征在于：所述烟草种子 为成熟的烟草种子。
3. 根据权利要求1所述的从烟草种子中提取RNA的方法，其特征在于：在步骤2)中是 用灭菌的牙签或枪头剔除脂类物质。
4. 根据权利要求1所述的从烟草种子中提取RNA的方法，其特征在于：所述RNA提取 缓冲液成分如下：2% 的 CTAB (W/V)，100mMol/L 的 Tris-HCl 其 ρΗ8· 0,2· 5 mMol/L EDTA， 2. OMol/L NaCl。
5. 根据权利要求1或4所述的从烟草种子中提取RNA的方法，其特征在于：所述RNA提 取缓冲液使用时应65°C温育30min以上，用之前加入5% V/V的β巯基乙醇。
【文档编号】C12N15/10GK104152439SQ201410434938
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月30日 优先权日:2014年8月30日
【发明者】武明珠, 李锋, 罗朝鹏, 王燃, 魏攀, 金立锋, 翟妞, 杨军, 林福呈 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院