疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物及检测方法
【专利摘要】本发明公开了疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物以及利用疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物对疯草是否被疯草内生真菌感染进行检测的方法，一对特异性分子检测引物包括具有碱基序列的上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR，上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR是在被疯草内生真菌感染的疯草中特异性地扩增出164bp的产物。本发明根据疯草内生真菌的mtSSU编码序列，设计出了一对分子特异性检测引物，该检测引物特异性强、灵敏度好；本发明的检测方法通过对待检疯草的DNA进行扩增，可以得到164bp 的条带，对疯草上其他真菌DNA和疯草本身DNA不能扩增出任何产物，能用来快速、准确、便捷地检测疯草样品中是否被疯草内生真菌感染，特异型强、实用性好，对疯草的防治具有重要的意义。
【专利说明】疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物 及检测方法。
【背景技术】
[0002] 疯草（Iocoweed)是豆科黄苗属（J1SiragaJrW 1S)和棘豆属（有毒植物的 总称，是危害草原畜牧业发展最严重的毒草之一。世界范围内疯草主要分布在美国、加拿 大、墨西哥、俄罗斯、西班牙等国；在我国，疯草主要分布在西部各省区，具体包括甘肃、内蒙 古、宁夏、陕西、四川、青海、西藏和新疆等省区的草原、荒漠和山地。疯草不仅降低草场利用 率，造成家畜疯草中毒，而且会加速草场退化，打破草地生态平衡。
[0003] 研究发现由感染并共生于疯草体内的疯草内生真菌（产 生的苦马豆素（swainsonine)是疯草毒性的主要活性物质。因此，加强疯草内生真菌的检 测是防控疯草的基础工作。而传统通过分离和鉴定来检测疯草是否被疯草内生真菌感染 的方法，存在时间长、操作繁琐的缺点，因此亟需开发出一种能够准确、快速检测疯草是否 被疯草内生真菌感染的分子生物学方法，Cook等2009年利用ITS序列设计了一对引物 ITS5 和 ORl 检测疯草内生真菌（Daniel Cook, Dale R. Gardner, Kevin D. Welch, et al. Quantitative PCR Method To Measure the Fungal Endophyte in Locoweeds[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009,57(14):6050 - 6054.),但该 引物特异性差，不能将疯草内生真菌（你和与其近缘的交链孢霉属 (W teraaria)的多个种区分，同时，PCR扩增完后产物还需限制性内切酶加 al I酶切，繁琐， 费事，成本高。因此，急需开发新的特异性高的引物用于快速检测疯草内生真菌。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术中存在的技术问题，提供能应用于快速检测、 灵敏度好、特异性高的疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物。
[0005] 本发明的另一个目的是为了提供一种利用疯草内生真菌的一对特异性分子检测 引物对疯草是否被疯草内生真菌感染进行检测的方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：疯草内生真菌的一对特异性分子 检测引物，包括具有碱基序列的上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR，其核苷酸序列为： SEQ ID N0:1 (OmtssuF) :5' - CATAGAAAAAAAAATAAACAAACTG -3' SEQ ID N0:2 (OmtssuR) :5' - TGTCTGCCCAGGTTACGG -3' ； 所述上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR是在被疯草内生真菌感染的疯草中特异性 地扩增出164bp的产物。
[0007] 进一步地，所述疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物的获得方法为：通过比 对疯草内生真菌和近缘真菌的线粒体核糖体小亚基编码序列mtSSU，在获得疯草内生真菌 特异mtSSU序列区段的基础上设计引物，获得疯草内生真菌一对特异性分子检测引物序 列。
[0008] 疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物的检测方法，包括以下步骤： A、 利用CTAB法提取待检疯草样品DNA作为模板； B、 利用分子检测特异性引物进行PCR扩增反应：PCR反应的扩增体系20yL包括： IyL DNA 模板，IOuM 上游引物OmtssuF 和下游引物OmtssuR 各0.5 μ L，2XPCR Mix IOuL, 双蒸水8以1^屮0?反应条件为：951：预变性51^11，941：变性458,521：退火458,721：延伸 lmin，进行30个循环，最后72°C延伸5min ; C、 PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在164bp 的DNA条带，则待检样品中含有疯草内生真菌。
[0009] 进一步地，所述步骤C中PCR产物用1. 5%的琼脂糖在I X TAE缓冲液中电泳后， 用溴化乙锭显色拍照。
[0010] 本发明相对现有技术具有以下有益效果：本发明根据疯草内生真菌的mtSSU编码 序列，设计出了包括引物上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR的分子特异性检测引物，该 检测引物特异性强、灵敏度好；本发明的检测方法通过对待检疯草的DNA进行扩增，可以得 到164bp的条带，对疯草上其他真菌DNA和疯草本身DNA不能扩增出任何产物，能用来快 速、准确、便捷地检测疯草样品中是否被疯草内生真菌感染，特异型强、实用性好，对疯草的 防治具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0011] 图1为本发明分子检测引物特异性验证凝胶电泳图； 其中，]\1:10(^口0嫩1^(1(161';1:阴性对照；2-7:你￡///^應.6^_7^?'〇/7/>5〇1^1，以 Oxytropis OKX, U. Oxytropis AV, U. Oxytropis OOY, U. Oxytropis 0G, U. Oxytropis DKT; 8-23: Embellisia astragali MHLZU0408, Alternaria alternate ACCC36171, A. Tenuissima ACCC31729, A. Solani ACCC36023, A. Brassicae ACCC37430, A. Porri ACCC36111, A. triticina CGMCC3. 9868, A. Infectoria CGMCC3. 7808, A. Iongipes ACCC30324, Stemphylium botryosum ACCC36456, Penicillium expansum ACCC30898, Aspergillus avenaceus ACCC30544, Cladosporium herbarum CGMCC3. 9382, Fusarium solani ACCC36234, Rhizopus stolonifer kCCC?,mn, Mucor mucedo ACCC3U77 ] 24: 未感染疯草内生真菌的疯草。
[0012] 图2为本发明特异性分子检测引物检测待测样品DNA扩增后的凝胶电泳图； 其中，M :100bp DNA Ladder ;1:阴性对照；2 :疯草内生真菌基因组DNA ;3-10 :待检疯 草样品DNA。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0014] 菌株选用： 6 株疯草内生真菌 0LJ, K OKX, K M，U. Oxytropis QQY，U. Oxytropis QG, U. OxytropisDKT.,哀它真舊 i Embellisia astragali MHLZU0408, Alternaria alternate ACCC36171, A Tenuissima ACCC31729, A Solan! ACCC36023, A Brassicae ACCC37430, A Porri ACCC36111, A triticina CGMCC3. 9868, A. Infectoria CGMCC3. 7808, A. Iongipes ACCC30324, Stemphylium botryosum ACCC36456， Penicillium expansum ACCC30898, Aspergillus avenaceus ACCC30544, Cladosporium herbarum CGMCC3. 9382, Fusarium solani ACCC36234, Rhizopus stolonifer KOZdQrU, Mucor mucedo ?\￡￡α?4--。
[0015] 疯草：采自甘肃、青海、宁夏等地。
[0016] DNA 提取： 本发明真菌DNA、疯草样品DNA提取方法：取真菌菌丝、疯草组织lg，加入液氮研磨 碎，移入 2ml Eppendorf 管中，加入 500μ1 DNA 提取裂解液（2% CTAB (w/v), 100 mM Tris-HCl (pH 8.5)，20 mM EDTA, I. 4 M NaCl, 1% PVP (v/v))，颠倒充分混匀，65°C水浴 40min，中间颠倒混合数次，12000rpm离心IOmin ;取上清液移入第二支Eppendorf离心管， 再加入500ulTris饱和酚，颠倒充分混勻，室温放置5min, 12000rpm离心IOmin ;取上清液 移入第三支Eppendorf离心管，再加入500ul氯仿，颠倒充分混勻，室温放置5min，12000rpm 离心IOmin ;上清液移入第四支Eppendorf离心管，再加入Iml无水乙醇，颠倒充分混勻，室 温放置5min，12000rpm离心IOmin ;弃上清；沉淀用70%乙醇洗漆，室温放置干燥5-10min， 溶于30 μ L TE缓冲液（pH8. 0)，-20°C保存备用。
[0017] 引物合成： 根据疯草内生真菌的mtssu编码序列，设计上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR。
[0018] 上述特异性分子检测引物的具体序列与序列表中序列对应关系如下表1所示： 表1 :本发明中上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR序列
【权利要求】
1. 疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物，其特征在于：包括具有碱基序列的上游 引物OmtssuF和下游引物OmtssuR，其核苷酸序列为： SEQ ID N0:1 (OmtssuF) ：5, - CATAGAAAAAAAAATAAACAAACTG -3, SEQ ID N0:2 (OmtssuR) :5' - TGTCTGCCCAGGTTACGG -3' ； 所述上游引物OmtssuF和下游引物OmtssuR是在被疯草内生真菌感染的疯草中特异性 地扩增出164bp的产物。
2. 根据权利要求1所述的疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物，其特征在于：所 述疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物的获得方法为：通过比对疯草内生真菌和近缘 真菌的线粒体核糖体小亚基编码序列（mtSSU)，在获得疯草内生真菌特异mtSSU序列区段 的基础上设计引物，获得疯草内生真菌一对特异性分子检测引物序列。
3. 利用权利要求1所述疯草内生真菌的一对特异性分子检测引物的检测方法，其特征 在于：包括以下步骤： A、 利用CTAB法提取检测样品DNA作为模板； B、 利用一对特异性分子检测引物进行PCR扩增反应：PCR反应的扩增体系20 y L包 括：1 ii L DNA 模板，10uM 上游引物 OmtssuF 和下游引物 OmtssuR 各 0? 5 ii L，2 XPCR Mix 10uL，双蒸水L ;PCR反应条件为：95°C预变性5min，94°C变性45s，52°C退火45s，72°C 延伸lmin，进行30个循环，最后72°C延伸5min ; C、 PCR产物经凝胶电泳后用溴化乙锭染色，根据凝胶中条带大小判断：若存在164bp 的DNA条带，则待检样品中含有疯草内生真菌。
4. 根据权利要求3所述的疯草内生真菌的检测方法，其特征在于：所述步骤C中PCR 产物用1.5%的琼脂糖在1XTAE缓冲液中电泳后，用溴化乙锭显色拍照。
【文档编号】C12N15/11GK104498588SQ201410434625
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】李彦忠, 刘建利, 南志标, 崔振 申请人:兰州大学