一种高效提取烟草成熟叶片总rna的方法
【专利摘要】目前报道的烟草总RNA提取方法均是以烟草幼叶为材料，而关于烟草成熟衰老的叶片总RNA提取方法还未见报道。本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门设计的一种高效提取烟草成熟叶片总RNA的方法，通过本发明所述方法所提取的RNA产量最高，条带清晰明亮，纯度好，更适用于烟草成熟叶片总RNA的提取。
【专利说明】一种高效提取烟草成熟叶片总RNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物学领域，具体涉及一种高效提取烟草成熟叶片总RNA的方法。
【背景技术】
[0002]烟草是一种重要的经济作物，且其作为一种模式植物，在植物分子生物学中具有重要作用。提取完整性好、纯度高的高质量RNA是进行Northern杂交、cDNA文库构建、反转录、转录组分析等分子生物学研究工作的基础。烟草叶片中存在大量的次生代谢物质，如多糖、多酚、烟碱和蛋白等物质，它们易与RNA共沉淀，对RNA的提取和纯化有干扰作用，影响总RNA的产量和质量。随着叶片的成熟衰老，大量的多糖、烟碱、酚类化合物和某些尚无法确定的次生代谢产物在叶片中积累，这些物质的含量远高于幼嫩叶片，严重影响了总RNA的提取，是技术上的一个难点。某些研究工作(如分析不同发育时期植株基因转录水平差异)又必须以成熟衰老的组织为研究对象。因此，应用适当的方法在富含多糖和次生代谢物的成熟衰老组织中提取高质量的RNA显得尤为重要。
[0003]目前报道的烟草总RNA提取方法均是以烟草幼叶为材料，而关于烟草成熟衰老的叶片总RNA提取方法还未见报道。幼嫩叶片总RNA提取方法很多，主要有异硫氰酸胍法、CTAB法、酚-SDS法、商品化Trizol及RNAiso方法。朱晓宇等(2010)以烟草旺长期中部叶为材料比较了 CTAB法，酚-SDS法和Trizol法等5种提取RNA的方法，结果表明CTAB法、Trizol法、RNAiso法均能得到质量较高的RNA，其中RNAiso法所提取的RNA产量最高，条带清晰明亮，纯度好，更适用于烟草叶片总RNA的提取。由于成熟叶片中多糖等次生代谢物质含量远远高于幼嫩叶 片，采用上述方法均不能获得理想的效果，主要提取后的RNA沉淀中仍有大量的多糖等成分无法去除，过多的多糖所形成的粘稠胶状物随RNA —起沉淀下来，使后续操作无法进行。
【发明内容】
[0004]本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门设计的一种高效提取烟草成熟叶片总RNA的方法，包括以下步骤:
(1)样品收集:分别选取不同成熟时期的烟草上、中、下部叶若干片，以主叶脉为界剪取一半迅速液氮速冻后-80°C保存；
(2)取同一成熟时期相同叶位的5-8个叶片在大研钵中液氮混合研磨至粗粉末后，取一部分转入小研钵液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2g-0.4g的粉末迅速转移至液氮预冷的15mL离心管中，加入5mL提取缓冲液，充分混匀；
(3)再加入2M醋酸钠ρΗ4.0,充分混匀；
(4)加入5mL水饱和酚，颠倒混匀后再加入ImL氯仿，充分颠倒混匀，室温静置lOmin，
4。。，10000 Xg 离心 IOmin ；
(5)将步骤(4)收集的上清转至新15mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，_20°C沉淀至少Ih ；(6)4°C，3000 Xg离心10min，，弃上清，得到RNA粗提物；
(7)用2mLCES溶液重悬所得沉淀，用移液枪轻轻的吹打直至沉淀完全溶解；
(8)加入2mL氯仿，上下充分颠倒混匀再次抽提，室温静置10min，4°C，3000Xg离心IOmin ；
(9)将步骤(8)所收集的上清液转移至新15mL离心管中，加入1/10体积的2M醋酸钠溶液pH5.0和等体积的异丙醇，室温静置lOmin, 4°C，10000 X g离心10min ；
(10)弃上清，用ImL75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH20溶解，DNaseI37°C下消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA ；
(11)消化结束后，加入ImL无水乙醇_20°C沉淀20min,4°C, 10000Xg离心10min ；
(12)弃上清，用ImL75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH20溶解，液氮速冻后_80°C保存备用；
所述CES缓冲液为:10mM柠檬酸钠，ImM乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基磺酸钠；
所述提取缓冲液的配方为:4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1M β-巯基乙醇。
[0005]上述所有步骤 中，RNA提取所用的试剂和耗材均用DEPC进行处理。
[0006]一种高效提取烟草成熟叶片总RNA提取试剂盒，所述试剂盒包括:RNA提取缓冲液，2M醋酸钠pH4.0, 2M醋酸钠溶液pH5.0，水饱和酚，氯仿，CES缓冲液，DEPC ddH20。
[0007]本发明采用低pH值的醋酸钾来去除多糖，酚/氯仿和氯仿反复抽提去除蛋白，DNaseI去除DNA等操作步骤，实现从成熟烟草叶片中获得高质量的RNA。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为用RNAiso方法提取烟草成熟衰老叶片RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
[0009]图2为用本发明所述方法提取烟草成熟衰老叶片RNA的琼脂糖凝胶电泳图。
[0010]图3为用RNAiso方法提取烟草成熟衰老叶片RNA的Agilent 2100 Bioanalyzer分析图(以两个样品为例说明)。
[0011]图4为用本发明所述方法提取烟草成熟衰老叶片RNA的Agilent 2100Bioanalyzer分析图(以两个样品为例说明)。
【具体实施方式】
[0012](I)分别选取不同成熟时期的烟草上、中、下部叶若干片，以主叶脉为界剪取一半迅速液氮速冻后-80°C保存；
(2)取同一成熟时期相同叶位的5-8个叶片在大研钵(直径约25cm)中液氮混合研磨至粗粉末后，取一部分转入小研钵液氮充分研磨至细粉末状(越细越好)，称取0.2g-0.4g的粉末迅速转移至液氮预冷的15mL离心管中,加入5mL提取缓冲液(4M异硫氰酸胍，25mM朽1檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1M β-巯基乙醇)，充分混匀；
(3)再加入2Μ醋酸钠(ρΗ4.0)，充分混匀；
(4)加入5mL水饱和酚，颠倒混匀后再加入ImL氯仿，充分颠倒混匀，室温静置lOmin，4。。，1000OXg 离心 IOmin ；
(5)将步骤(4)收集的上清转至新15mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，-20°C沉淀至少Ih ；
(6)4°C，3000 Xg离心10min，弃上清，得到RNA粗提物；
(7)用2mLCES溶液(IOmM柠檬酸钠，ImM乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基磺酸钠)重悬所得沉淀，用移液枪轻轻的吹打直至沉淀完全溶解；
(8)加入2mL氯仿，上下充分颠倒混匀再次抽提，室温静置10min，4°C，3000Xg离心IOmin ；
(9)将步骤(8)所收集的上清液转移至新15mL离心管中，加入1/10体积的2M醋酸钠溶液(pH5.0)和等体积的异丙醇，室温静置10min，4°C，10000Xg离心10min ；
(10)弃上清，用ImL75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH20溶解，DNaseI (RNase-free) (Takara 2270A) 37°C下消化 30min ;
(11)消化结束后，加入ImL无水乙醇-20°〇醇沉201^11，41:，10000\8离心10min；
(12)弃上清，用ImL75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH20溶解，液氮速冻后-80 °C保存备用。
[0013]对照实施例可参照常规的RNAiso法提取叶片总RNA，提取完成后进行凝胶电泳检测和Agilent 2100 Bioanalyzer分析。通过附图1_4检测表明用本发明所述方法提取的烟草成熟叶片总RNA产 量最高，条带清晰明亮，纯度好，更适用于烟草成熟叶片总RNA的提取。
【权利要求】
1.一种高效提取烟草成熟叶片总RNA的方法，其特征在于能从衰老烟草叶片中获得高质量的RNA,包括以下步骤: (1)样品收集:分别选取不同成熟时期的烟草上、中、下部叶若干片，以主叶脉为界剪取一半迅速液氮速冻后-80°C保存； (2)取同一成熟时期相同叶位的5-8个叶片在大研钵中液氮混合研磨至粗粉末后，取一部分转入小研钵液氮充分研磨至细粉末状，称取0.2g-0.4g的粉末迅速转移至液氮预冷的15mL离心管中，加入5mL提取缓冲液，充分混匀； (3)再加入2M醋酸钠ρΗ4.0,充分混匀； (4)加入5mL水饱和酚，颠倒混匀后再加入ImL氯仿，充分颠倒混匀，室温静置lOmin，4。。，10000 Xg 离心 IOmin ； (5)将步骤(4)收集的上清转至新15mL离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，_20°C沉淀至少Ih ； (6)4°C，3000 Xg离心10min，，弃上清，得到RNA粗提物； (7)用2mLCES溶液重悬所得沉淀，用移液枪轻轻的吹打直至沉淀完全溶解； (8)加入2mL氯仿，上 下充分颠倒混匀再次抽提，室温静置10min，4°C，3000Xg离心IOmin ； (9)将步骤(8)所收集的上清液转移至新15mL离心管中，加入1/10体积的2M醋酸钠溶液pH5.0和等体积的异丙醇，室温静置lOmin, 4°C，10000 X g离心10min ； (10)弃上清，用ImL75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH20溶解，DNaseI37°C下消化30min，去除RNA中少量的基因组DNA ； (11)消化结束后，加入ImL无水乙醇_20°C沉淀20min,4°C, 10000Xg离心10min ； (12)弃上清，用ImL75%乙醇洗涤沉淀一次，在超净工作台干燥，加入DEPC ddH20溶解，液氮速冻后_80°C保存备用； 所述CES缓冲液为:10mM柠檬酸钠，ImM乙二胺四乙酸，0.5%十二烷基磺酸钠； 所述提取缓冲液的配方为:4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5%十二烷基肌氨酸钠，0.1M β-巯基乙醇。
2.一种如权利要求1所述方法的RNA提取试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括:RNA提取缓冲液，2M醋酸钠ρΗ4.0, 2Μ醋酸钠溶液ρΗ5.0,水饱和酚，氯仿，CES缓冲液，DEPCddH20。
【文档编号】C12N15/10GK103911369SQ201410134989
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】李伟, 郭永峰 申请人:中国农业科学院烟草研究所