一种甘蓝叶片小rna的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物小RNA的提取方法，具体涉及一种甘蓝叶片小RNA的提取方 法，属于小RNA提取技术领域。
【背景技术】
[0002] 小RNA (small RNA)是一类长20-30个核苷酸的非编码RNA分子，它一般通过与 mRNA结合，在转录后水平上调控靶基因的表达，进而参与调控植物的生长发育。小RNA普 遍存在于动植物中，数量较多，按照其生物合成特点，植物小RNA可以分为两类：微小RNA (microRNA，miRNA)和小干扰 RNA (small interfering RNA，siRNA)两大类型。
[0003] miRNA是第一类被发现并具有重要功能的小RNA，其长度为20-23核苷酸。miRNA 在不同物种中广泛分布，其数量因物种不同而存在差异。植物miRNAs经转录、DCL酶剪切 后，形成miR/miR*双链复合体，随后miR*链降解，另一条成熟miRNA与AGO蛋白结合，构成 RNA诱导的沉默复合体（RISC)，这个复合体能与编码蛋白的靶基因 mRNA结合，并在适当的 位置对mRNA进行剪切或抑制翻译，从而对靶基因的表达进行调控。相关研究表明，miRNA在 植物的生长、发育及胁迫响应中发挥重要的调控作用，因而越来越受到研究者的关注。
[0004] 而高质量的小RNA是开展miRNA相关研究的重要前提。虽然提取小RNA的方法已 有研究报道，例如Trizol、LiCl沉淀等，但是这些方法一般所需步骤繁琐，导致部分小RNA 丢失，而且小RNA会伴有蛋白、糖类等污染。近年来，随着高通量测序技术的发展与应用，植 物miRNA研究发展迅速，目前已经在拟南芥、水稻、杨树等模式植物上开展，而其他世界性 植物(如甘蓝）miRNA研究才刚刚起步。
[0005] 结球甘蓝（Brassica oleracea var. capitata L.)简称甘蓝，属十字花科芸薹属 甘蓝种。甘蓝是一种重要的世界性蔬菜，在60° N以南，60° S以北的广大区域均有分布。 在我国，甘蓝被广泛栽培种植，是蔬菜周年供应中的一种重要叶菜类蔬菜。甘蓝营养丰富， 经常食用能提高人体免疫力、延缓衰老，此外还具有一定的抗癌功效，深受消费者喜爱。因 此，甘蓝是备受研究者关注的蔬菜作物之一。关于甘蓝的研究报道较多，但内容多偏向于栽 培技术、植物生理等方面，虽然分子生物学方面的研究工作已开展，但多集中在基因克隆、 功能验证方面，miRNA研究才刚刚起步，因而开展甘蓝miRNA研究具有较大的研究空间，且 具有重要研究意义。而获得高质量的小RNA是开展甘蓝miRNA相关研究的重要前提。目前 小RNA提取方法常伴有蛋白、糖类等物质污染，小RNA浓度低等问题。
【发明内容】
[0006] 解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种甘蓝叶片小RNA 的提取方法，在浸提之前增加了样品裂解步骤，以保证样品裂解充分，克服现有小RNA提取 方法常伴有蛋白、糖类等物质污染，小RNA浓度低等问题。
[0007] 技术方案：本发明提供的一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其包括如下步骤： 步骤一、采集甘蓝叶片(甘蓝幼叶或者甘蓝老叶)，立即于液氮中速冻，之后放于-80°C 冰箱待用； 步骤二、取步骤一处理过的甘蓝叶片，置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，并向粉末中 加入CTAB裂解液于离心管，混勾，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4°C，离心 5~10min ;所述CTAB裂解液与甘蓝叶片的质量比为5:1 ; 步骤三、取步骤二离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入小RNA 提取液（RNAiso for Small RNA)，混勾，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4°C， 离心5~10min ;所述小RNA提取液与步骤二所述CTAB裂解液的质量比为1:1 ; 步骤四、取步骤三离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入上清液 体积1/5的氯仿和异戊醇混合液，混勾，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4°C， 离心 15~20min ; 步骤五、取步骤四离心所得液体的上清液放于新的离心管中，并加入与上清液等体 积的异丙醇，混匀，放于-20 °C冰箱中静置l~2h，之后于离心机上12000rpm，4 °C，离心 10~15min ； 步骤六、弃步骤五离心所得上清液，留沉淀，并用800~1500 μ L75%乙醇溶液清洗沉淀； 室温晾干，再用30~50 μ L的RNase free CldH2O溶解沉淀，即得到甘蓝叶片小RNA。
[0008] 所述 CTAB 裂解液配方为：4M 异硫氰酸胍，2% (W/V ) CTAB，IOOmM Tr i s-HCL (pH 8.5)(RNase free CldH2O 配制），20mM EDTA，1.4M NaCl，2% (W/V) PVP，2% (V/V) β-巯基 乙醇。
[0009] 所述75%乙醇溶液由无水乙醇和RNase free ddH20按体积3 :1配制。
[0010] 所述氯仿和异戊醇混合液由氯仿和异戊醇按体积比24 :1配制。
[0011] 有益效果：本发明操作步骤简便，利用含有异硫氰酸胍的CTAB裂解液对植物样品 进行预处理以保证样品充分裂解，再用浸提液提取小RNA，该方法可有效降低小RNA中DNA、 蛋白、糖类等物质的污染，同时还减少了小RNA的丢失，为miRNA相关研究的开展提供了高 质量的小RNA，可以满足小RNA文库的构建，qRT-PCR等的需求，能够很好地用于后续的分子 生物学实验研究。
【附图说明】
[0012] 图1是甘蓝叶片小RNA电泳图，其中1为仅用浸提液提取甘蓝幼叶小RNA图，2为 仅用浸提液提取甘蓝老叶小RNA图，3是甘蓝幼叶小RNA图，4是甘蓝老叶小RNA图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施例仅用 于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中小RNA提取液（RNAiso for Small RNA提取液）均购买自宝生物工程(大连）有限公司。
[0014] 实施例1 甘蓝幼叶小RNA的提取 步骤一、取甘蓝幼叶，放于铝箱纸中，并立即放于液氮中速冻，之后放于_80°C冰箱待 用； 步骤二、取步骤一处理的幼叶0. 2g，置于研钵中用液氮研磨成粉末，并向粉末中加入 1000 yL CTAB裂解液，混勾，室温放置5 min，之后于离心机上12000rpm，4°C，离心5 min; 步骤三、取步骤二离心所得液体的上清，将其转移至新的离心管中，并向其中加入1ml 小RNA提取液（RNAiso for Small RNA)，混勾，室温放置5min，之后于离心机上12000rpm， 4。。，离心 5 min ; 步骤四、取步骤三离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入上清液 体积1/5的氯仿和异戊醇混合液，混勾，室温放置5min，之后于离心机上12000rpm，4°C，离 心 15min ; 步骤五、取步骤四离心所得液体的上清液放于新离心管中，并加入与上清液等体积的 异丙醇，混匀，放于_20°C冰箱中静置lh，之后于离心机上12000rpm，4°C，离心10min ; 步骤六、弃步骤五离心所得上清液，留沉淀，并用lmL75%乙醇清洗沉淀；室温晾干，再 用30 μ L的RNase free CldH2O溶解沉淀，即得到甘蓝幼叶小RNA。
[0015] 以直接用提取液（RNAiso for Small RNA)提取幼叶小RNA的作为对照，提取步骤 同上。
[0016] 实施例2 甘蓝老叶小RNA的提取 采用的植物组织为甘蓝老叶，提取步骤同实施例一，同样以直接用提取液（RNAiso for Small RNA)提取老叶小RNA的作为对照。
[0017] 取上述实施例1-2提取的甘蓝幼叶、老叶以及各自对照的小RNA，利用0. 8%琼脂糖 凝胶电泳对其质量进行检测，结果表明（图1 )，提取的小RNA条带清晰，未见DNA、蛋白、糖等 物质的污染，在紫外可见光光度计（Eppondorf )检测发现，本发明所述方法提取的小RNA浓 度在410-440 ug/mL，这说明小RNA质量较高，可用于后续miRNA研究；表1是甘蓝叶片小 RNA浓度对照表(对应图1)。
[0018] 表1甘蓝叶片小RNA浓度对照表
【主权项】
1. 一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤一、采集甘蓝叶片，立即于液氮中速冻，之后放于_80°C冰箱待用； 步骤二、取步骤一处理过的甘蓝叶片，置于液氮预冷的研钵中研磨成粉末，并向粉末中 加入CTAB裂解液于离心管，混勾，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4°C，离心 5~10min;所述CTAB裂解液与所述甘蓝叶片的质量比为5:1 ; 步骤三、取步骤二离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入小RNA提取液，混勾，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4°C，离心5~10min;所述小RNA 提取液与步骤二所述CTAB裂解液的质量比为1:1 ; 步骤四、取步骤三离心所得液体的上清液，转移至新的离心管中，并向其中加入上清液 体积1/5的氯仿和异戊醇混合液，混勾，室温放置3~5min，之后于离心机上12000rpm，4°C， 离心 15~20min; 步骤五、取步骤四离心所得液体的上清液放于新的离心管中，并加入与上清液等体 积的异丙醇，混匀，放于-20 °C冰箱中静置l~2h，之后于离心机上12000rpm，4 °C，离心 10~15min； 步骤六、弃步骤五离心所得上清液，留沉淀，并用75%乙醇溶液清洗沉淀；室温晾干，再 用RNase freeCldH2O溶解沉淀，即得到甘蓝叶片小RNA。2. 根据权利要求1所述的一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其特征在于所述甘蓝叶片 为甘蓝幼叶或甘蓝老叶。3. 根据权利要求1所述的一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其特征在于步骤二所述 CTAB裂解液配方为：4M异硫氰酸胍，2%(W/V)CTAB，IOOmM Tris-HCL，20mM EDTA，1.4M NaCl， 2% (W/V) PVP，2% (V/V) 0-巯基乙醇。4. 根据权利要求1所述的一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其特征在于所述75%乙醇 溶液由无水乙醇和RNase free ddH20按体积3:1配制。5. 根据权利要求1所述的一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，其特征在于所述氯仿和异 戊醇混合液由氯仿和异戊醇按体积比24:1配制。
【专利摘要】本发明公开了一种甘蓝叶片小RNA的提取方法，包括以下步骤：甘蓝叶片采集，液氮速冻，-80℃保存待用；液氮研磨甘蓝叶片至粉末状，加入裂解液进行样品预处理；离心取上清，并加入裂解液等体积小RNA提取液，震荡混匀后室温静置5min；离心取上清，并加入1/5上清体积的氯仿和异戊醇混合液抽提；离心取上清，加入与上清等体积的异丙醇沉淀，放于-20℃沉淀1h；离心弃上清，沉淀用75%乙醇清洗，干燥后，用适量RNase？free？ddH2O溶解沉淀，得到甘蓝叶片小RNA。本发明先对样品进行预处理，再以RNAiso？for？Small？RNA为提取液，对小RNA进行提取，获得了高质量的小RNA，为加速甘蓝小RNA研究奠定基础，而且本发明具有快速、稳定、操作简便等特点，具有广泛的应用前景。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105176973
【申请号】
【发明人】曹雪, 戴忠良, 秦文斌, 潘跃平, 孙国胜, 张振超, 孙春青, 姚悦梅, 肖燕
【申请人】镇江瑞繁农艺有限公司
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年8月31日