消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于分子生物学及分子诊断
技术领域：
，具体涉及一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用。【
背景技术：
】[0002]依赖解旋酶恒温扩增技术（helicase-dependentamplification,HDA)是一种有效的指数扩增目标核酸的技术。该技术模拟生物体内核酸复制过程，利用DNA解旋酶在等温条件下解开双链DNA，用单链结合蛋白（single-strandedDNA-bindingprotein)维持DNA单链状态，继而在DNA聚合酶的参与下实现核酸扩增，无需类似于PCR所要求的复杂而精确的热循环（变性一退火一延伸）过程。HDA已被认为是一种强有力的PCR的替代方法，特别是在资源有限的地区和需要实地检测等情况下，HDA展示了卓越的简便性和实用性，如今已被广泛应用于病原体检测和SNP分型。[0003]早期HDA在较低的温度（约37°C)下进行，利用大肠杆菌UvrD解旋酶和另外两种辅助蛋白MutL和单链结合蛋白来实现扩增反应。为了进一步提高HDA的反应效率，许多研究人员作了不懈努力。Kong的课题小组从嗜热厌氧杆菌中克隆和纯化出一种热稳定UvrD解旋酶（thermostableUvrDhelicase)来在更高的温度（60~65°C)下实现HDA反应，在无辅助蛋白体系内实现高效扩增。另外一种HDA改进方法通过使用一种由解旋酶和DNA聚合酶融合而成的双功能蛋白，能成功实现更长片段（2.3kb)的扩增。还有课题小组提出在扩增之前用内切酶处理目标基因组DNA可加快HDA的速度和提高其灵敏度。另外，也有人研究得出：引物的5'端富含A或者C比含T或者G有利于得到更有效的扩增反应。尽管如此，引物二聚体依然存在。这个常见的问题干扰了目标核酸链的特异性积累，产生了错误的检测结果。[0004]最近，Zhang的课题小组报道一个新型的目标转换的HDA检测方法消除了引物二聚体的干扰，实现对转录因子的超灵敏检测。在整个HDA扩增反应中，他们仅使用单个引物，此引物与精心设计的发卡结构模板的茎互补，消除了传统HDA中引物对构成的引物二聚体造成的非特异性扩增。然而，此方法额外使用外切酶完全消化未与目标物结合的发卡模板并需要对外切酶进行加热灭活以防止背景信号产生。再者，由于此方法基于给定的发卡模板，不能用于其他核酸链的扩增以及各种非核酸目标物的检测。[0005]目前为止，还没有简单通用的方法能够完全消除引物二聚体造成的背景。随着HDA应用范围的扩大，亟需发展一种通用而简单的方法来进一步改善HDA的应用。【
发明内容】[0006]为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系及扩增方法和应用，该方法简单实用、通用性强、效果好；该体系能够实现零背景的HDA。[0007]本发明是通过以下技术方案来实现：[0008]本发明公开了一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系，该体系包括：2.5yL的IOX退火缓冲液II，1yL的IOOmMMgS04、2yL的500mMNaCl、lyL的5μΜ反向引物、IyL的5μΜ正向引物、IyL的52.5mMATP溶液、IyL的3.5mMdNTPs、0.75yL的IsoAmpli酶混合物及1μL的5XSYBRGreenI。[0009]优选地，选取40bp的链作为模板链，则以模板链5'端的18个碱基相同的ISbp的链作为正向引物，以与模板链3'端24个碱基互补的24bp的链作为反相引物。[0010]本发明还公开了一种消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，包括以下步骤：[0011]1)根据待扩增的目的片段模板设计引物，包括正向引物和反向引物；[0012]2)构建HDA反应体系，包括：正向引物、反向引物、模板、缓冲液、反应所需的酶以及ATP和dNTPs;[0013]3)将体系中各个反应物混合均匀，进行HDA等温扩增，根据荧光信号检测扩增结果，判断实现零背景旋酶依赖扩增反应。[0014]步骤2)所述的HDA反应体系参照标准的HDA反应体系，对ATP和dNTPs浓度做调低处理。[0015]步骤3)所述的荧光信号检测扩增是采用Light-Cyeteri)96System进行实时荧光检测，每60s测定一次，设定温度为60°C。[0016]所述的模板为合成的单链或经过细胞端粒酶扩增之后的单链。[0017]优选地，消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，包括以下步骤：[0018]1)根据模板序列，设计正向引物和反向引物：[0019]模板序列为：5'-MTCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'；[0020]设计正向引物为：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；[0021]设计反向引物为：5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3'；[0022]2)构建HDA反应体系，包括：2.5yL的IOX退火缓冲液II，IyL的IOOmMMgS04、2yL的500mMNaClUyL的5μΜ反向引物、IyL的5μΜ正向引物、IyL的52.5mMATP溶液、1μL的3.5mMdNTPs、0.75μL的IsoAmp?酶混合物及1μL的5XSYBRGreenI;[0023]3)将体系中各个反应物混合均匀，进行HDA等温扩增，根据荧光信号检测扩增结果，判断实现零背景旋酶依赖扩增反应。[0024]本发明还公开了上述消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖体系在检测细胞端粒酶活性中的应用。[0025]与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：[0026]本发明针对HDA体系中引物二聚体造成的假阳性信号，通过使用适当低浓度的ATP和dNTPs来消除体系中的引物二聚体，得到简单而通用的零背景HDA检测方法。此方法无需增加额外的加热灭活步骤或者额外的酶，也无需精心设计的结构特殊的引物，只需要适当降低原体系中ATP和dNTPs的浓度即可完全消除引物二聚体引起的假阳性背景，具有简单方便，通用性强，效果好等优点。具体优势如下：[0027]1、本发明解决了传统HDA技术中常见的由引物二聚体引发的非特异性扩增造成的假阳性问题，消除了引物二聚体的扩增背景；[0028]2、本发明相比于一些只是减少引物二聚体扩增背景的技术，彻底消除了引物二聚体的扩增背景，彻底解决引物二聚体引发的问题；[0029]3、本发明相比于需要添加特殊酶、需要特殊结构的引物或需要增加额外的酶灭活步骤的其他HDA改良技术来说，仅需在原HDA体系中适当降低ATP和dNTPs的浓度，即可实现零背景的HDA，无需额外步骤，额外成本，且具有通用性，效果更好。【附图说明】[0030]图1为本发明的方法流程示意图；[0031]图2为不同ATP浓度下HDA的实时荧光曲线图；[0032]图3为不同dNTPs浓度下的HDA的实时荧光曲线图；[0033]图4为零背景HDA对端粒酶活性的检测原理图；[0034]图5为在零背景HDA中添加或者不添加HeLa提取物的荧光实时曲线图；[0035]图6为在零背景HDA中加入不同数量细胞端粒酶扩增产物的实时荧光曲线图；[0036]图7为细胞数量的对数和荧光强度的线性关系；[0037]图8为零背景HDA对不同细胞系的端粒酶活性的检测结果。【具体实施方式】[0038]下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。[0039]参见图1，本发明的消除引物二聚体的零背景解旋酶依赖扩增方法，包括以下步骤：[0040]1)根据待扩增的目的片段模板设计引物，包括正向引物和反向引物；[0041]2)构建HDA反应体系，包括：正向引物、反向引物、模板、缓冲液、反应所需的酶以及ATP和dNTPs;[0042]3)将体系中各个反应物混合均匀，进行HDA等温扩增，根据荧光信号检测扩增结果，判断实现零背景旋酶依赖扩增反应。[0043]实施例1[0044]分别以三条合成的链作为模板，正向引物和反向引物[0045]1)模板，正向引物和反向引物的设计[0046]模板序列为：5'-MTCCGTCGAGCAGAGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3'；[0047]正向引物为：5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'；[0048]反向引物为：5'-CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA-3'；[0049]以合成的40bp链为模版，以与模板链5'端前18个碱基相同的18bp的链为正向引物，以与模板链3'端24个碱基互补的24bp的链作为反向引物，这时这一对引物会有两个碱基互补，极可能发生引物二聚体非特异性扩增，通过实验证明引物二聚体引发的非特异性扩增的确产生了。[0050]2)零背景HDA的实施当前第1页1 2