专利名称：一种快速、高效提取水稻组织总rna的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域水稻组织总RNA的提取方法。
背景技术：
近年来，随着生物技术的进步和发展，基因的克隆和表达研究，需要从植物材料中 提取高纯度的RNA。尽管RNA的提取已经成为很成熟的技术，但在实际研究中经常很难做到 顺利获得质量好的RNA。这归咎于很多因素(如材料的保存不合理、器具不洁净、操作不严 等)造成RNA的降解。而且提取不同植物材料中RNA的最适宜条件及其相应方法也不尽相 同。目前市面上出售的植物总RNA提取试剂盒众多，但均存在一定的缺陷，如提取时间长， 提取所需的条件较为苛刻，提取率低，提取的总RNA完整性较差等缺点。然而RNA质量的好、 坏决定着实验结果的可信度高、低。因此获取一种快速、高效的植物组织RNA提取方法具有 重要的作用。2002年12月水稻基因组测序成功完成，共测定碱基对3亿6千600万个，精确度 达到99. 99%，并预测遗传基因62435个。此后国内外众多学者将水稻作为一种重要的模式 植物对体内的代谢、致病等基因进行研究。然而这些研究的基础都建立在总RNA提取的基 础上，因此提取获得一个完整性较好的总RNA是学者们研究的重要前提。因此本发明提出 了一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法。以期为水稻基因组学研究奠定重要的工作 ■石出。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高效的水稻组织RNA提取方法。本发明的技术方案在于一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在 于按以下步骤进行(1)称取水稻组织IOOmg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨 时间控制在Imin之内；(2)将研磨后的勻浆倒入1. 5ml EP管中，后加入Iml的Trizol，充分混勻后15s， 加0. 2ml氯仿溶液充分混勻15s ；(3) 12000g离心lOmin，取上层水相转入新的1. 5ml PE管中，加0. 5ml异丙醇，于 20°C下静置 20min ；(4) 12000g离心lOmin，倒掉上层清液，加Iml现配的75%的乙醇洗涤沉淀二次，取 沉淀物置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。使用工具的前处理1.5ml PE 管和 1. 5πι1、200μ 1、10μ 1 的枪头用 0. 的 DEPC 浸泡 12 小时，然后 120°C高压蒸汽灭菌20min。0. 1% DEPC、玻璃试剂瓶120°C高压蒸汽灭菌20min。水稻组织RNA的提取称取水稻组织IOOmg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，液氮中迅速研磨(Imin内)，倒A 1. 5ml EP管中，后加入lml的Trizol，充分混勻后15s，加0. 2ml氯仿溶液充分混勻15s。 12000g离心lOmin，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0. 5ml异丙醇，于_20°C下静置 20min, 12000g离心lOmin，倒掉上层清液，加lml现配的75%的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀 置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。整个提取过程在45min内完成。运用紫外分光光度 法检测样品RNA的纯度，或以的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳的电压 120V，电流80mA，采用稳压电源，缓冲液为的TAE。本发明的优点在于1、提取时间短，整个提取操作流程在45min内完成。2、提取总RNA完整性好，水稻根部总RNA溶液在紫外吸收波长260nm和280nm下 的吸光度比值为2. 03，其中5s，18s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近 2 ；水稻叶部总RNA溶液在紫外吸收波长260nm和280nm下的吸光度比值为2. 05，其中5s， 16s, 18s, 25s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近2 ；。3、提取效率高，lOOmg的水稻根可提取总RNA量为22. 8825 u g，100mg的叶可提取 的总 RNA 量为 51. 0642 iig。
图1为本发明实施例一的RNA电泳检测图。图2为本发明实施例二的RNA电泳检测图。
具体实施例方式为充分公开本发明的一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，以下结合方法 验证和实施实例加以说明。实施例一 水稻根部组织总RNA的提取称取三叶一芯其水稻根部组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，液氮中迅速研 磨(lmin内)，倒入1. 5ml EP管中，后加入lml的Trizol，充分混勻后15s，加0. 2ml氯仿溶 液充分混勻15s。12000g离心lOmin，取上层水相转入新的1. 5ml PE管中，加0. 5ml异丙 醇，-20°C中静置20min，12000g离心lOmin，倒掉上清，加lml现配的75%的乙醇洗涤沉淀 二次，取沉淀置超净工作台吹干，加30iU 0. 1% DEPC水溶解。水稻根部组织总RNA的纯度检测运用美国瓦里安Cary50紫外分光光度计检测检测RNA溶液的纯度。取上述DEPC 水溶解的RNA溶液1 ii 1，稀释50倍，测定其在230nm、260nm、280nm、320nm下的吸光度。以 0D260nm/0D280nm的比值计算RNA纯度。结果0D260nm/0D280nm= 2. 03水稻根部组织总RNA的提取量的计算根据RNA浓度的换算公式RNA ( U g/ U L) = 0D260 X 40 X稀释倍数/1000由此可得，提取的RNA浓度为0. 76275 ug/uL,提取RNA的量为22. 8825 u g。水稻根部组织总RNA的完整性检测以1 %的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取1 P LRNA溶液，4 y 1DEPC 水，liiL 6XLoading buffer，上样。电泳检测条件，电压120V，电流80mA，稳压，缓冲液为
4的TAE，电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-12C型。水稻根部组织总RNA的电泳图片如图1所示，可见，5s，18s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近2。实施例二水稻叶部组织总RNA的提取称取三叶一芯其水稻叶部组织IOOmg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，液氮中迅速研 磨(Imin内)，倒入1. 5ml EP管中，后加入Iml的Trizol，充分混勻后15s，加0. 2ml氯仿溶 液充分混勻15s。12000g离心lOmin，取上层水相转入新的1. 5ml PE管中，加0. 5ml异丙 醇，-20°C中静置20min，12000g离心lOmin，倒掉上清，加Iml现配的75%的乙醇洗涤沉淀 二次，取沉淀置超净工作台吹干，加30 μ 1 0. 1% DEPC水溶解。水稻叶部组织总RNA的纯度检测运用美国瓦里安Cary50紫外分光光度计检测检测RNA溶液的纯度。取上述DEPC 水溶解的RNA溶液30 μ 1，取1 μ 1稀释50倍，测定其在230nm、260nm、280nm、320nm下的吸 光度。以0D260nm/0D280nm的比值计算RNA纯度。结果0D260nm/0D280nm= 2. 05水稻叶部组织总RNA的提取量的计算根据RNA浓度的换算公式RNA ( μ g/ μ L) = 0D260 X 40 X稀释倍数/1000由此得，提取的RNA浓度为1. 70214 μ g/ μ L，提取RNA量为51. 0642 μ g水稻叶部组织总RNA的完整性检测 以1 %的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。取1 μ LRNA溶液，4ul DEPC 水，IyL 6 X Loading buffer，上样。电泳检测条件，电压120V，电流80mA，稳压，缓冲液为 的TAE，电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYY-12C型。水稻叶部组织总RNA的电泳图片 如图2所示，可见，5s, 16s, 18s, 25s和28s条带清晰，28s条带与18s条带的亮度比值接近 2。 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
权利要求
一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于按以下步骤进行(1)称取水稻组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨时间控制在1min之内；(2)将研磨后的匀浆倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s；(3)12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，于-20℃下静置20min；(4)12000g离心10min，倒掉上层清液，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀物置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。
2.根据权利要去1所述的快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于整个提 取过程在45min内完成。
3.根据权利要求1所述的快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于RNA提 取完成后采用的非变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
4.根据权利要求3所述的快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于电泳电 压为120V，电流为80mA，采用稳压电源，缓冲液为的TAE。
全文摘要
本发明涉及一种快速、高效提取水稻组织总RNA的方法，其特征在于按以下步骤进行称取水稻组织100mg置于陶瓷研钵(未灭菌)中，加入液氮后迅速研磨，研磨时间控制在1min之内；将研磨后的匀浆倒入1.5ml EP管中，后加入1ml的Trizol，充分混匀后15s，加0.2ml氯仿溶液充分混匀15s；12000g离心10min，取上层水相转入新的1.5ml PE管中，加0.5ml异丙醇，于20℃下静置20min；12000g离心10min，倒掉上层清液，加1ml现配的75％的乙醇洗涤沉淀二次，取沉淀物置超净工作台吹干，加DEPC水溶解。本发明水稻组织总RNA的提取方法具有快速、高效、完整性等优点。
文档编号C07H21/02GK101875930SQ20091031060
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月28日 优先权日2009年11月28日
发明者何海斌, 叶陈英, 方长旬, 林志华, 林文雄, 王海斌, 陈荣山 申请人:福建农林大学