专利名称：小分子rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种小分子RNA的提取方法，具体地，本发明涉及无酚/氯仿抽提的小分子RNA的提取方法。
背景技术：
由于小分子RNA可能参与分化、发育、组织生长、脂肪代谢等生理过程，在不同的组织和发育阶段的表达水平有所不同，进一步了解小分子RNA的生物功能具有重要意义。微小RNA(microRNA，简称miRNA)是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控， 导致mRNA的降解或翻译抑制。由于微小RNA存在的广泛性和多样性，提示微小RNA可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对微小RNA的研究还处于初级阶段，据推测微小RNA在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要并可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。对一部分微小RNA的研究分析提示微小RNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育，细胞增殖，细胞凋亡，细胞死亡，脂肪代谢和细胞分化以及和癌症的发生发展密切相关。可见，对小分子RNA的研究日益受到重视。然而，进行小分子RNA分析的第一个关键步骤就是从生物样本中纯化小分子RNAs。多数传统RNA分离试剂盒目的是为回收mRNA 而设计的，往往会弃去较小的RNA分子以减少干扰提高mRNA得率。因此这些步骤会导致一些小分子RNAs，如微小RNAs的损失。另外，此类方法往往涉及酚/氯仿等有毒化学物质的抽提。多数RNA纯化试剂盒采用的标准玻璃纤维滤膜或者硅胶滤膜，不能有效的回收更小的小分子RNA，如微小RNA。例如，利用这些方法虽然能有效回收5. 8S rRNA,但微小RNA部分或者全部被弃除。随着对小分子RNA，尤其是微小RNA研究的逐渐深入，小分子RNA的分离技术逐渐成为一种需求。微小RNA的分子量相对较小，对于常规的核酸提取法都不适用。微小RNA只有在乙醇浓度很高的条件下(大于70% )才能与核酸提取柱相结合，从而得到分离。但在该浓度的乙醇条件下，绝大多数的其他分子，特别是大分子都会被沉淀，使分离无法进行。 目前多采用利用毒性很强的酚以及氯仿等有机试剂，首先将大分子沉淀除掉，然后纯化总的核酸。除了使用的试剂有毒外，大分子的DNA和RNA仍然会影响对微小RNA的进一步分析。因此，有必要开发新的小分子RNA的提取方法。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种小分子RNA的提取方法。本发明的方法是通过以下技术方案来实现的。本发明提供一种小分子RNA的提取方法，其不使用酚/氯仿处理样品，具体地，所述方法包括以下步骤1)采用裂解液处理样品后，再用滤膜过滤样品，除去样品中的大分
3子组分，得到小分子组分；2)进一步纯化小分子组分，得到小分子RNA。优选地，所述步骤1)中滤膜的截流分子量为20K到100K，优选为30K和50K。优选地，所述步骤2、中小分子组分的纯化是通过以下方法来实现的先采用有机溶剂处理小分子组分，再直接通过核酸结合柱纯化。优选地，所述有机溶剂选自乙醇和异丙醇。优选地，所述核酸结合柱选自RNA结合柱和DNA结合柱。优选地，所述小分子RNA包括微小RNA、小干扰RNA和小核RNA。优选地，所述样品为生物样品，选自细胞、组织提取物、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液、腹水、脑集液及泪液分泌物。由此可见，本发明采用滤膜法，首先将样品中含量丰富的大分子组分如DNA和蛋白与分子量较小的小分子组分分开，微小RNA存在于小分子组分中。含有微小RNA的小分子组分经乙醇处理后，直接通过RNA的特异结合柱(RNA特异结合柱包括所有RNA结合柱) 加以纯化，具体的提取过程如图1所示。本发明对于液态生物样品，例如组织，血清，血浆， 唾液和尿液等更有其特点。可直接经样品裂解液作用将样品中的微小RNA与其结合的大分子蛋白或DNA分子分离，游离的微小RNA在高浓度的乙醇存在下可以与微小RNA的特异结合柱结合，并得以纯化。更重要的是，本发明不涉及有毒的化学成分，如酚和氯仿等的使用。本发明为高效快捷的微小RNA分离纯化方法，对各种不同来源的样品(动物、植物、细胞等)，尤其是液体样本，均能取得满意的提取效果。对各种小分子RNA，包括微小核糖核酸(微小RNA， mi RNA)、小干扰核糖核酸(小干扰RNA，small interfering RNA, si RNA)、小核核糖核酸(小核RNA，small ημ lcear RNA, snRNA)均能实现较好的回收。具体到微小RNA，目前的微小RNA提取方法普遍采用酚/氯仿抽提除去大分子，然后经乙醇沉淀加过柱的方法。大分子的存在直接影响乙醇沉淀和过柱，因此本发明采用滤膜法，首先用裂解液将将样品中含量丰富的DNA和蛋白大分子和分子量较小的小分子组分分开，然后经滤膜将DNA和蛋白大分子和分子量较小的小分子组分分离，微小RNA存在于小分子组分。含有微小RNA的小分子组分则可以由乙醇处理。这时的微小RNA在高浓度的乙醇帮助下可以与微小RNA的特异结合柱结合，即游离的微小RNA在高浓度的乙醇存在下可以与微小RNA的特异结合柱结合，从而进行分离纯化。本发明在克服了已有方法缺点，例如使用有毒的化学成分的同时，有效保持了微小RNA分离的快捷，有效和纯度。采用本发明的方法提取出的MiRNA含量与酚/氯仿抽提法(ΑΜΒΙ0Ν试剂盒)相当。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中图1为本发明提供的小分子RNA的提取方法，一个体积的样品首先与一个体积的样品裂解液混合，然后经超滤膜将大分子除去，收集的小分子组分再经乙醇处理并由RNA 柱将小分子RNA特异性吸附，漂洗后小分子RNA由DEPC处理的纯化水洗脱。图2为本发明实施例1和2分别从血浆和组织中提取的微小RNA的实时PCR检测结果，分别取上述实施例中提取的微小RNA，加入5pm茎环引物逆转录得到的cDNA，实时PCR 分析样品中的microRNA-miRM。
具体实施例方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。实施例1血浆中微小RNA的提取取100 μ 1新鲜或_80°C冷冻的血浆加入至1. 5ml塑料离心管中，向离心管中加入100 μ 1盐酸胍裂解液，涡旋混合10秒后室温孵育10分钟，再将混合液加入30Κ超滤离心管(Pall Corporation, Cat. #0D030C33)，经 15000rpm 室温离心 20 分钟。根据离心后的体积向离心管内加入2. 5倍无水乙醇，用移液器吹打混勻。将混合后的液体移至核酸纯化柱(Bioer2ml)，13000rpm离心1分钟。弃掉收集管液体，在柱内加入600 μ 1洗脱液 (0. OlMTris-HCl pH 7. 5,0. 2Μ NaCl, 0. 2mM EDTA，80% 乙醇，上述试剂均用 DEPC 处理的纯净水配制)，13000rpm,离心1分钟。弃掉收集管液体，将核酸纯化柱按13000rpm离心甩干1 分钟。将纯化柱柱移至新的收集管内，柱内加入50μ 1预先在90°C水浴中预热的无RNA酶的去离子焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的纯净水，室温孵育1分钟。13000rpm离心2分钟， 离心后得到的液体即为微小RNA，-20°C保存。实施例2组织中微小RNA的提取取50mg成人肝组织在液氮中研磨成粉末，加入至2ml组织裂解液(4M异硫氰酸胍，0. 5%十二烷基肌酸钠，8% β -巯基乙醇，26mM柠檬酸钠)，涡旋混合10秒后室温孵育 5分钟，经15000rpm室温离心10分钟。取500 μ 1的上清液加入30K(Pall Corporation, Cat. #0D030C33)超滤离心管，15000rpm室温离心20分钟。根据离心后的体积向离心管内加入2. 5倍无水乙醇，用移液器吹打混勻。将混合后的液体移至核酸纯化柱，13000rpm离心1 分钟。弃掉收集管液体，在柱内加入600 μ 1洗脱液(0. OlMTris-HCKpH 7. 5),0. 2M NaCl, 0. 2mM EDTA, 80%乙醇，上述试剂均用DEPC处理ddH20配制)13000rpm，离心1分钟。弃掉收集管液体，将核酸纯化柱按13000rpm离心甩干1分钟。将纯化柱移至新的收集管内，柱内加入50 μ 1预先在90°C水浴中预热的无RNA酶的去离子DEPC处理过的纯净水，室温孵育 1分钟。13000rpm离心2分钟，离心后得到的液体即为微小RNA，-20°C保存。实施例3微小RNA的检测本实施例对实施例1和实施例2中得到的微小RNA逆转录合成miR-McDNA，并进行实时定量PCR检测其中的miR-M，具体方法如下取12μ 1上述实施例1或2中提取的microRNA加入1. 5ml塑料离心管中，向离心管中加入5pm逆转录引物1 μ 1，混合后放置70°C水浴，5分钟。迅速放置冰上5分钟。向离心管中加入5X逆转录缓冲液(promegaJ800Woods Hollow Road. Madison, WI 53711-399USA)4y 1，1 μ 1 IOmM dN TPs, RNA 酶抑制剂 1 μ 1 (40 活性单位)，逆转录酶 1 μ 1 (200活性单位)，42°C水浴60分钟，取出离心管，70°C水浴10分钟，得到的液体即为 cDNA。取 Ιμ 00離，加入5\卩0 缓冲液(卩1~01116区&，2800100(18 Hollow Road. Madi son, WI 53711-399USA[PR0MEGA，地址])5μ 1，0. 625U Taq 酶，Ιμ IOmM dNTPs,5y 1 25mM MgCl2, 1 μ 1 5uM上下游PCR 引物(由 invitrogen合成，上游引物为5，ACACTGGAGCTGGGTGGCTCAGT TCAGCAGG3，；下游引物为5，TGGTGTCGTGGAGTCG3，)，1 μ 1 20 XEva green，用去离子水补足至25 μ 1，开始实时定量PCR检测(检测条件如下:95°C 5m ；95°C 30s ；55°C 30s ；72°C 30s ； (95°C 20s-64°C 20s_72°C 20s) X40, Roche LightCycler 480)。 数据处理方法为Δ Ct法。高浓度的微小RNA会有较小的Ct值，而低浓度的微小 RNA会出现较大的Ct值。实验结果如图2所示，表明实施例1中提取的血浆样品微小RNA 中的miR-MCt值为23. 70，实施例2中提取的组织样品微小RNA中的miR-MCt值为15. 49。
权利要求
1.一种小分子RNA的提取方法，其特征在于，所述方法不使用酚/氯仿处理样品，其包括以下步骤1)采用裂解液处理样品后，再用滤膜过滤样品，除去样品中的大分子组分，得到小分子组分；2)进一步纯化小分子组分，得到小分子RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中滤膜的截流分子量为 20K 100K，优选为30K和50K。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤幻中小分子组分的纯化是通过以下方法来实现的先采用有机溶剂处理小分子组分，再直接通过核酸结合柱纯化。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自乙醇和异丙醇。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述核酸结合柱选自RNA纯化柱和 DNA纯化柱。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述小分子RNA包括微小 RNA、小干扰RNA和小核RNA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品为生物样品，选自细胞、组织提取物、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液及其他分泌物。
8.采用权利要求1至7中任一项所述方法提取的小分子RNA，优选地，所述小分子RNA 包括微小RNA、小干扰RNA和小核RNA。
全文摘要
本发明提供一种小分子RNA的提取方法。本发明采用滤膜法，首先将样品中的大分子组分如DNA和蛋白与小分子组分分开，小分子RNA存在于小分子组分中。将小分子组分经有机物处理后，直接通过特异结合柱加以纯化。本发明不涉及有毒的化学成分如酚和氯仿等的使用。本发明为高效快捷的微小RNA分离纯化方法，对各种不同来源的样品(动物、植物、细胞等)，尤其是液体样本均取得满意的效果，适用于各种小分子RNA，包括微小RNA、小干扰RNA、小核RNA的提取。
文档编号C07H21/02GK102191238SQ20101012627
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月15日 优先权日2010年3月15日
发明者夏东元, 张颖, 维克多·韩, 范盘生 申请人:博尔诚(北京)科技有限公司