专利名称：：Dna分子和方法DNA分子和方法
技术领域：
：本发明涉及DNA分子以及使用所述分子向革兰氏阳性细胞，特别是向梭菌纲(aa^nW")细胞中的DNA引入突变的方法。梭菌纲包括梭菌目(C7oWrWa/M)、盐厌氧菌目(//a/朋aeraZ^/es)和热厌氧杆菌目(T72ermoa"aera6a"eW"/es)。梭菌目包括梭菌禾斗(C7astnViz'aceae)，而梭菌科包括梭菌属(C/as化/d/wm)。梭菌属是最大的细菌属之一，由专性厌氧的革兰氏阳性产孢菌构成。某些成员，如热纤梭菌(C/M/rWwm决w附oce〃wm)和丙酮丁醇梭菌(C/a^Wwwweto^/^c訓)可用于化学燃料的工业级生产。后一梭菌种和其他良性的代表种还具有作为癌症靶向治疗剂的递送载体的显著潜力。然而，由于如艰难梭菌(C7asW(i/w附6i^cz7e)、肉毒梭菌(C7astnV^w附Zofw/Z"w附)禾口产气荚膜梭菌(C7o^r^wm/w/n'"取m)的那些成员会导致人和家畜患病，结果使梭菌属声名狼藉。尽管所述菌属具有巨大的商业和医学重要性，但是由于对该生物体缺乏在分子生物学水平上的基本了解，所以无论是对其进行有效开发利用的进程，还是对抵抗其所致疾病的常规方法的研发，均受到了严重阻碍。这在很大程度上是缺少有效基因工具的结果。在最近几年中已经由包括丙酮丁醇梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌和产气荚膜梭菌在内的至少一个典型株确定了所有主要种的完整基因组序列。在其他菌种中，可以以此类数据为出发点进行更有效的疾病控制或产生具有改进加工性的菌株。在此类任务中的关键工具是将DNA合理地整合到基因组的能力。可采用技术(i)产生特异性突变体，以将其作为确定单个基因或基因簇功能的方式，这是理解生理学和发病机理的首要步骤；(ii)对调控基因或结构基因进行插入失活，以将其作为增加所需商品的产量的方式；和(iii)稳定地转入编码外源因子的基因信息。然而，目前尚没有用于任何一种梭菌的突变研究的有效整合载体，而且仍严重欠缺对该菌属进行基因插入失活的能力。现有技术中对梭菌突变体的制备依赖于整合载体与宿主染色体之间的同源重组。现已发现在产气荚膜梭菌株13、拜氏梭菌(C.Z^)'w/"ch7)NCIMB8052、丙酮丁醇梭菌ATCC824和艰难梭菌CD37中，携带宿主染色体区域的不能复制的质粒(replication-minusplasmid)可通过同源重组整合进入基因组中(Shim腿d"/(1994)/Sa"m》/.176:1616-23;WilkinsonandYoung(1994)140:89-95;Greenda/(1996)M^ra6Zo/.142:2079-2086;LiyanageW"/(2001)Mz'craWo/.67:2004-2010)。在拜氏梭菌和艰难梭菌的情况下，载体从大肠杆菌(￡.co/O供体迁移(mobilize)至拜氏梭菌和艰难梭菌中。而对于产气荚膜梭菌和丙酮丁醇梭菌，则通过转化引入质粒。在拜氏梭菌中发生整合的频率为每个受体l(^l(r7，这一频率比在可复制质粒(replicationproficientplasmid)中观察到的转化频率(10-41(T5)低2个数量级(WilkinsonandYoung,1994，如上)。在艰难梭菌中，尚没有关于获得频率指数的报道。在丙酮丁醇梭菌中，以每pgDNA0.8~0.9个"克隆"的频率产生整合体。在上述整合体中，靶位点质粒序列的侧翼具有引导整合的DNA片段的两个正向重复拷贝。结果导致质粒序列在分离上不稳定，例如在丙酮丁醇梭菌中的流失率为每30代1.83.0x10—3(Greene"/,1996，如上)，在拜氏梭菌中的流失率为每30代0.371.3xl(T3(WilkinsonandYoung,1994，如上)。人们认为优选利用等位基因交换获得整合体。因此，在产气荚膜梭菌中筛选并获得了双交换突变体(AwadeM/(1995)Mo/.M'crafc/oZ.15:191-202;Banname/a/(1995)Mo/.M/cra&o/.16:535-551)。然而，证实只有在用来失活靶基因的抗生素抗性基因任意一侧引入相当长(3.0kb)的同源序列时，等位基因交换才可能发生。此外，还证实即便在此条件下，突变体的分离也存在不定性(即，在io个独立试验中，仅有两个获得7V/c突变体)，并且很多突变体需要长达6个月的时间进行分离，而其他突变体可能完全不能分离。在产气荚膜梭菌中可检测到罕见的整合事件是DNA能够高频率地转化入此类生物体的结果。在其他种的梭菌中产生双交换突变体的努力尚未获得成功。迄今为止，证明除产气荚膜梭菌之外，很难使用经典的同源重组在其他一系列梭菌种中产生突变体。因此，在丙酮丁醇梭菌中仅制备出5个突变体。其中4个(k/^:,CAC3075;/to，CAC1742;aa《CACP0162;和《汉，CACP061)通过复制缺陷型质粒的单交换整合制备(Greenetal.，1996，如上；GreenandBennett(1996)^p;/.所oc/ze附.213，57-58;Harris&"/(2002)JBacten'o/.184,3586-3597)，而第5个突变体(spoM(CAC2071))则是由试图通过利用复制缺陷型质粒的相互交换来产生突变但没有成功的策略分离得到的(Nairda/(1999;U5acferzW.181,319-330)。类似地，现已报道的在艰难梭菌中产生的定向突变体仅有3个。一个突变体(gWJ，CD0274)是使用复制缺陷性型质粒产生的(Liyanage"a/,2001，如上)，然而此突变似乎是致死的，突变细胞不能增殖。另外两个失活基因(gai,CD3255和^W,CD1089)通过引入携带所述两个结构基因的内部片段的复制缺陷型载体而获得(O'Connorda/(2006)Mo/.Mz'cra&'o/.61,1335-1351)。后两个质粒的引入似乎在"有些困难"的情况下获取的，而且在分离出整合体的同时并没有记录分离的频率。实际上，在这两种生物体中难以对使用现有突变方法的效率做出评价，这是因为通常不存在突变体产生频率的指标。就丙酮丁醇梭菌而言，所述突变体产生频率的指标为(Thomas(2005)MetabolicengineeringofsoventogenicClostridia.In:Diirre,P.HandbookonClostridia,CRCPress,pp813-830)"每ng质粒DNA可产生的转化体少于1个"。此外，由于这些突变体中的大部分是由单交换插入产生的，因而由于质粒切除而不具有稳定性。例如，艰难梭菌突变体的Southern印记显示在细胞群的一些细胞中存在由"环凸"(loopedout)自主复制的质粒。经设计，目前越来越多的技术可利用包含移动性遗传元件的系统对细菌基因组进行更为有效的修饰。乳酸乳球菌的II型内含子Ll丄trB是通过内含子编码的逆转录酶(LtrA)以及切下的套索RNA来介导其自身移动性的元件。此外，实际上可能通过对内含子RNA的修饰使其重新靶向任何所需的DNA序列(Guoda/(2000)5We"ce289:452-457;Mohrda/(2000)Dev.14:559-573)。因此，通过对内含子的参与靶向的15bp区域中的单个碱基进行适当的突变，Karberg等人(iVa^^所ofec/2.(2001)19:1162-1167)能够以0.122%间的频率在数个不同大肠杆菌基因内的不同指定位点定向插入所述元件。中断这些基因之一^yj产生具有天然三甲氧苄二氨嘧啶抗性的克隆。因此，可通过在存在三甲氧苄二氨嘧啶的条件下进行培养来筛选整合体。其他基因的整合体通过筛选单克隆中是否存在L1丄trB内含子来鉴定。用于中断大肠杆菌Aj^基因的质粒也被用于中断弗氏志贺氏菌(S.^ex^n')和鼠伤寒沙门氏菌(S.Cy//2/m腦'訓)中的A^4基因。获得三甲氧节二氨嘧啶抗性克隆的频率分别为1%和0.3%。乳酸乳球菌的II型内含子Ll,LtrB用于在产气荚膜梭菌的p/c基因中产生敲除(Chen""/(2005)J;;/M/craWo/.71:7542-7)。此外，通过电穿孔向产气荚膜梭菌中导入包含设计为靶向;^基因的修饰Ll丄trB内含子的氯霉素抗性质粒。使用氯霉素筛选转化体，并通过PCR检测在p/c基因中插入的存在。在经检测的38个克隆中，大部分为阴性插入，但有两个克隆同时包含野生型和内含子插入型;^基因。认为后两个克隆是由单个转化菌产生的，其产生发生插入的子代和不发生插入的子代。来自这些混合克隆的细菌可产生纯克隆，其中10%的纯克隆包含内含子插入型/^基因。因此，除使用氯霉素筛选转化体之外，可通过两轮筛选鉴定插入突变体，而无需使用抗生素培养进行筛选。实际上，没有向染色体中引入任何抗生素抗性基因可作为此方法的特别优点。作者特别指出，使用携带不同修饰Ll丄trB内含子的相同穿梭质粒可在同一细菌细胞中造成多个基因中断。产气荚膜梭菌具有高转化频率，大约比其他梭菌种类高出2个数量级。此外，基因敲除(在;^中)得到易于检测的表型，其可容易地在琼脂板上观察到。Yao等人(iWJ(2006)12:1-11)使用Ll丄trB破坏金黄色葡萄球菌(Stap/zj/ococcwflwew)中的基因，而无需对基因进行选择。使用镉诱导型启动子引导Ll丄trB内含子在金黄色葡萄球菌中的表达；镉诱导有利于获得一个基因的插入突变体。在制备另一个基因的突变体时，所有经检测的克隆在缺少镉的条件下均为内含子插入阳性。Zhong等人(V"c/e/cAr/A7M.(2003)31:1656-64)描述了对II型内含子的重新靶向进行阳性筛选的方法，包含在II型内含子中插入"逆转录转座激活的选择性标记"或由包含T4噬菌体W内含子的三甲氧苄二氨嘧啶(Tp)抗性盒组成的RAM。所述Tp抗性基因编码II型二氢叶酸还原酶。所述W内含子是I型内含子，即能够在其正确方向上对其所在的RNA转录本进行自我剪接的自我催化型RNA元件。7^插入7)/的方向使得在基因转录时所述元件不会被剪接。因此，所得mRNA仍为突变体，而不会产生Tp抗性所需的蛋白质。当II型元件在重新靶向期间被转录成RNA时，RAM中的反向链以RNA的形式存在。在这种情况下，W元件的方向正确，并被剪接。结果，II型元件重新靶向染色体时，T)/基因已缺失其W插入，并具有功能性。结果，已成功发生重新对其进行直接筛选。此方法已应用于大肠杆菌细胞。梭菌通常具有三甲氧苄二氨嘧啶(trimethoprim)抗性，从而使得基于Tp抗性盒的RAM难以使用。例如，在Swenson等人的研究(Swenson""/(1980)J"^m'cra6.O^woAw.18:13—19)中，经检测的绝大部分分离菌均具有抗性。非致病性工业使用菌株也普遍具有抗性。实际上，在Jennert(2000)M/cra&o/ogv.146:3071-80中，纤维素分解梭菌(C.ce〃w/o/"/cMm)的内在抗性构成了基因转移试验使用的接合方法的基础。Sigma-Aldrich出售名为"TargeTronGeneKnockoutSystem"(TargeTronTM基因敲除系统)的基于由卡那霉素抗性(KnO盒组成的RAM进行基因敲除(主要在大肠杆菌中)的试剂盒。梭菌具有天然的卡那霉素抗性，因此在梭菌中不能将卡那霉素抗性作为选择性标记使用。无法通过交换标记对梭菌基因组中的指定基因进行敲除是对梭菌纲，特别是梭菌属成员进行商业开发的主要障碍。这对所有领域均有影响。因此，认为目前尚不能应用代谢工程产生具有改良发酵特征的工业菌株(例如，丙酮丁醇梭菌和丙酮-丁醇发酵过程)；不能产生在染色体上携带有用于癌症治疗的基因的菌株(临床试验的先决条件，例如产孢梭菌(C^omge"M)和梭菌引导的酶前药治疗)；致病机理的基础信息极少(例如艰难梭菌和需要住院治疗的感染)，而这是设计有效对策的首要步骤。不应将本说明书对在先公开文件的列出或讨论视为所述文件是现有技术的一部分或所述文件是公知常识。本发明人设计了能够将DNA有效地插入梭菌或其他梭菌纲细菌的基因组中，从而使所述基因组的基因产生靶向突变的DNA分子和方法。本发明的第一方面提供了DNA分子，其包含经修饰的II型内含子，其不表达内含子编码的逆转录酶，但在相对于经修饰的II型内含子的反方向上包含经修饰的选择性标记基因，其中所述选择性标记基因包含选择性标记的编码区域和可操作性地连接到所述区域的启动子，其中所述启动子能够导致由单拷贝选择性标记基因编码的选择性标记的表达，其表达量足以使所述选择性标记改变梭菌纲细菌细胞的表型，从而使其能够区别于不含所述选择性标记基因的梭菌纲细菌细胞；和10用于所述经修饰的II型内含子转录的启动子，所述启动子可操作性地与所述经修饰的II型内含子相连；并且其中所述含经修饰的选择性标记基因包含I型内含子，从而中断所述选择性标记的表达，其中所述I型内含子位于相对于所述经修饰的II型内含子的正方向；和其中所述DNA分子容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去所述I型内含子，从而获得所述选择性标记的编码区域，并容许在梭菌纲细菌细胞中DNA分子内的位点插入所述RNA转录本(或其DNA拷贝)。II型内含子是在真细菌和细胞器中发现的移动性遗传元件。在自然界中，它们利用由核糖核蛋白(RNP)复合物介导的迁移机制(称作"逆转录归巢"(retrohoming))，其中所述RNP复合物包含内含子编码的逆转录酶(IERT)和切下的内含子套索RNA。人们认为切下的内含子套索RNA通过逆剪接反应直接插入到双链DNA靶位点的一条链中，同时IERT也位点特异性地切割相对的另一条链，并将经切割链的3'-末端用于插入的内含子RNA的靶DNA引导的反转录(TPRT)。结果，将内含子(以及经修饰内含子中携带的任意核酸)插入到耙DNA中。TPRT系统仅需要IERT和切下的内含子RNA(参见SaldanhaWa/(1999)B/oc/^m/W^38,9069-卯83)。关于II型内含子的详细资料可在Karberga/(2001)A^/we所otec/mo/ogy19，1162-1167中找到，该文件通过弓I用并入本文，并在本文引用的参考文献中。本领域中也将正RT称作内含子编码的蛋白质(IEP)。IEP(IERT)具有逆转录酶活性以及核酸内切酶和成熟酶活性，能够将内含子克隆插入到DNA中。切割DNA底物并将其插入核酸分子的过程包括RNP复合物中II型内含子RNA与DNA底物中特异区域的碱基配对。其他的相互作用发生在内含子编码的逆转录酶和识别位点侧翼的DNA底物区域之间。II型内含子RNA通常具有两条序列(EBS1和EBS2)，这两条序列能够与DNA底物上链中的两个内含子RNA结合序列(IBS1和IBS2)杂交。通常，II型内含子编码的逆转录酶与底物识别位点的第一序列元件以及第二序列元件结合。II型内含子RNA通常插入到DNA底物上链的切割位点。识别位点的第一序列元件位于推定切割位点IBS1序列以及IBS2序列的上游。所述第一序列元件包含约10约12个核苷酸对。识别位点的第二序列元件位于推定切割位点的下游，且包含约10约12个核苷酸如本文所示，位于切割位点上游的核苷酸相对所述切割位点的位置为负(-),位于切割位点下游的核苷酸相对所述切割位点的位置为正(+)。因此，所述切割位点位于双链DNA底物上链中(-1)(+1)位核苷酸之间。相对所述切割位点，IBS1序列和IBS2序列位于由约(-1)位延伸至约(-14)位的识别位点区域内。EBS1通常位于II型内含子RNA的域沖，并包含能够与底物中IBS1序列的核苷酸杂交的约57个核苷酸。EBS2通常位于II型内含子RNA的EBS1上游的域I中，并包含能够与底物中的IBS2序列核苷酸杂交的约57个核苷酸。为了有效切割底物，优选与II型内含子RNA中EBS1的第一个核苷酸紧邻的核苷酸或序列与底物上链的(+l)位核苷酸互补。本发明DNA分子中包含的经修饰的II型内含子不表达IERT。优选II型内含子不包含功能性的正RT开放读码框。优选地，通常包含IERT的II型内含子的域IV被部分切除，从而使II型内含子不含IERT。已知有多种II型内含子可用于实施本发明。这些内含子包括细菌内含子，例如在综述(DiaandZimmerly(2002)iVwc/efcJc/A30:1091-1102)中讨论的真细菌内含子，还包括在综述(Zimmerly，HausnerandWu(2001)M/c/e/cA油i^29:1238-1250)中引用的线粒体内含子和叶绿体内含子。优选所述II型内含子为乳酸乳球菌的II型内含子Ll丄trB(Mohr"fl/(2000)，如上)。此II型内含子中的IERT是LtrA蛋白质。酿酒酵母(&cc/MfrawyceycewvWae)的核苷整合酶all和al2也是适合的。另一个选择是来自梭菌接合转座子Tn5397的II型内含子(Roberts""/(2001)J.BacteWo/.183:1296-1299)。LtrARNP复合物包含乳酸乳球菌LtrB基因的切下的野生型或切下的经修饰的Ll丄trB型II型内含子RNA(下文称为"Ll丄trB内含子"RNA)，以及野生型或修饰的Ll丄trB内含子编码的逆转录酶(称作LtrA蛋白)。Ll丄trB内含子RNA的EBS1包含7个核苷酸，并位于457463位。野生型Ll丄trB内含子RNA的EBS1序列具有5'-GUUGUGG(SEQIDNo.1)的序列。Ll丄trB内含子RNA的EBS2包含6个核苷酸，并位于401406位(包含406位)。野生型Ll丄trB内含子RNA的EBS2序列具有5'AUGUGU(SEQIDNo.2)的序列。本发明DNA分子中的II型内含子经过修饰而包含经修饰的选择性标记基因。选择性标记基因是能够向表达所述基因的细菌细胞赋予不同于不表达所述基因的细菌细胞的变化表型的任意基因。所述经修饰的选择性标记基因是通过包含中断所述选择性标记表达的I型内含子而被修饰的(与未经修饰的选择性标记基因相比)。术语"未经修饰的选择性标记基因"包括包含启动子和基因编码区的基因，其中所述启动子不是天然存在的基因的启动子。"未经修饰的选择性标记基因"还包括其中所述启动子是天然存在基因的启动子的情况。下文描述了对选择性标记基因进行修饰的更多详细资料，但其本质在于I型内含子的存在阻止选择性标记的表达，但是切除I型内含子获得的核酸(即，未经修饰的选择性标记基因)能够表达所述选择性标记。优选所述选择性标记基因位于II型内含子的域IV中。可以理解，只要I型内含子的存在能阻止选择性标记的表达，则所述I型内含子可位于所述选择性标记基因内的任何位置。可以理解，所述I型内含子可位于如在启动子内，例如位于启动子元件的(-10)(-35)位之间，位于启动子和编码区之间，或位于编码区内。可将包含I型内含子的选择性标记基因(即，经修饰的选择性标记基因)视为被逆转录转座激活的标记(RAM)。I型内含子是自我剪接的内含子，对其剪切可能需要或不需要例如蛋白质的辅助因子。已知可用于实施本发明的多种I型内含子包括噬菌体内含子(SandegranandSj6berg(2004)乂5"/.C/^肌279:22218-22227)，和四膜虫I型内含子(Roman(1998)祝oc/2em.95:2134-2139)。优选不需要辅助因子即可对其剪接的I型内含子。优选所述I型内含子是来自噬菌体T4的I型内含子td(EhrenMand(1986)淑/.加d5W.园83:5875-5879).可以理解，DNA分子中各个成分的方向非常重要。因此，由图2可见，经修饰的选择性标记基因在n型内含子中存在的方向与n型内含子相反。此外，i型内含子在n型内含子中存在的方向与选择性标记基因相反，而与ii型内含子相同。如果i型内含子与选择性标记基因的方向相同，那么无论包含选择性标记的ii型内含子是否已重新靶向到染色体中，所述内含子都将能够从所述选择性标记基因的mRNA转录本中切除掉，并出现由选择性标记基因赋予的表型。因此，I型内含子和选择性标记基因的方向必须相反。如果选择性标记基因的方向与n型内含子相同，按照上述逻辑，i型内含子的方向必须与II型内含子相反。然而，在这个方向上I型内含子将不会从mRNA转录本上切除，这样即便II型内含子确实重新靶向到染色体，也不会出现可选择的表型。只有各个成分的方向如图2所示时，n型内含子重新靶向到染色体才是选择性标记表型表达的充要条件。将本发明的DNA分子用于向梭菌纲细菌细胞中的DNA分子的位点引入核酸分子时(如下文详述)，I型内含子从经修饰的II型内含子产生的RNA转录本中被除去，获得编码所述选择性标记的区域，并将所得的RNA转录本(或其DNA拷贝)引入到梭菌纲细菌细胞中DNA分子内的位点。这样被引入到梭菌纲细菌细胞的DNA分子中的核酸具有能够在所述细菌细胞中表达所述选择性标记的选择性标记基因。在优选的实施方案中，经修饰的II型内含子的侧翼具有外显子，其中外显子允许对I型内含子RNA转录本进行剪接。所述选择性标记基因的启动子能够引起由单拷贝选择性标记基因编码的选择性标记的表达，其表达量足以使所述选择性标记改变梭菌纲细菌细胞的表型，从而使其能够区别于不含所述选择性标记基因的梭菌纲细菌细胞。例如，所述启动子可以是，在以单拷贝存在于细菌染色体并且可操作性地连接到选择性标记的编码区时，以可检测的量表达所述选择性标记的一个启动子。所述选择性标记基因的启动子是，在梭菌纲细菌细胞中具有功能性，并如上所述，在以单拷贝存在时能够引发充分表达的一个启动子。优选所述启动子在梭菌中具有功能性。适合的启动子包括产气荚膜梭菌的/血基因的启动子(Takamizawad(2004)iVote/wEx;/mw7'o"P,ycaft'ow36:70-75);丙酮丁醇梭菌的/^、决/和"A启动子(Tummala"a/(1999)々取￡"v/ra".Af/craWo/.65:3793-3799)以及产气荚膜梭菌的c/e启动子(Melville,LabbeandSonenshein(1994)/w/ec^waw//wmwmXv62:5550-5558)，以及丙酮丁醇梭菌的硫解酶启动子(Winzerda/(2000)JMo/.M/cra6/o/.所ofec^wo/.2:531-541)。优选所述选择性标记基因的启动子是丙酮丁醇梭菌的A/启动子。为了检测启动子是否可能作为本发明选择性标记的有效启动子，可将RAM的剪接变体(g卩，在I型内含子被除去后编码选择性标记)置于其转录调控下，并以低拷贝数引入到待耙定的梭菌中，其中优选其拷贝数与染色体的拷贝数相等。这可以通过使用低拷贝数质粒实现，例如在Swinfield"(1990)Gene87:79-90中描述的质粒pAM(31的低拷贝衍生物，或更理想地，使用接合转座子，方法如Mullany等(户/osmW(1994)31:320-323)和Roberts等人(/M/cra&o/MeAoA(2003)55:617-624)所述。为了实现后者，将剪接的RAM与待评估的启动子一起克隆到不能在革兰氏阳性菌中复制，但携带抗生素抗性基因(例如cWP)以及衍生自接合转座子(例如Tn9M)的DNA片段的载体中。随后，将所述质粒转入基因组中带有适合的接合转座子(Tn976)的枯草芽孢杆菌(5acz7/^w^7&)细胞中，并在包含氯霉素的平板上筛选转化体。由于所述质粒不能复制，能产生氯霉素抗性克隆的唯一途径是通过Tn976与质粒携带的同源区之间的同源重组将所述质粒整合进入基因组。其结果在基因组中产生了单拷贝的、携带剪接的RAM以及待检测启动子的转座子::质粒共合体(cointegrate)。此时，可将获得的枯草芽孢杆菌转接合子(transconjugant)用作与待靶定梭菌接合的供体。在此类接合配对(mating)中，可基于获得甲砜氯霉素抗性筛选转入了转座子::质粒共合体的梭菌受体。一旦获得具有所述抗性的梭菌受体，转移接合子即可通过RAM编码的抗性(例如红霉素抗性)进行检测。调控经修饰的II型内含子转录的启动子可以是在梭菌纲细菌细胞中具有功能的任何适合的启动子。所述启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子。可对诱导型启动子去阻遏化，这样即可以组成型的方式驱动表达。在实施例中描述的特定试验中，本发明人发现与组成型表达相比，经修饰的II型内含子的调控表达并没有给予高内含子插入频率的优点。然而，在其他情况下，能够调控经修饰的II型内含子的表达可能是有用的。普通技术人员能够进行试验以确定特定的启动子是否能够获得满意的内含子插入率。Girbald(2003)」p;/.Af/craWo/.69:4985画4988描述了优选的丙酮丁醇梭菌的木糖诱导型启动子，所述启动子是基于木糖葡萄球菌(Stap/^/ococc^的木糖操纵子启动子-阻遏物调控系统。适合的诱导型启动子可由IPTG或木糖诱导。例如，将所述DNA分子用于梭菌细胞时，所述启动子是受大肠杆菌/"c操纵子的lac操纵区调控的巴斯德梭菌(C.15;^Wem^m^)铁氧化还原蛋白基因的启动子区域，这非常方便。便利的是，所述DNA分子可进一步包含大肠杆菌的/^/基因。调控经修饰的II型内含子转录的启动子可以是组成型启动子。技术人员可以理解，通常所有启动子均受到某种条件的调控，即便该条件尚不为人知。因此，我们希望将"组成型启动子"广义地解释为包括在重新靶向方法采用的正常培养条件下，在梭菌细胞中具有活性的启动子，而无需添加试剂以激活所述启动子驱动的转录。对初级代谢非常重要的基因的启动子可以是适合的"组成型启动子"。例如，实施例中描述的硫解酶启动子A/可以是适合的启动子。其他适合的启动子是丙酮丁醇梭菌的启动子Md、cW、W/4、e(/B和6c^(AlsakerandPapoutsakis(2005)J5acfen'o/187:7103-7118)。被认为适合驱动RAM中经修饰的选择性标记表达的启动子也是适合的。使用诱导型启动子能够在将RAM重新靶向到细菌染色体后，关闭II型内含子的转录，其中所述II型内含子包含被I型内含子破坏的选择性标记基因(可称为RAM)。当从诱导型启动子转录RAM时，选择性标记的表达是无效的。这可能是因为在从染色体转录的编码链转录本以及从DNA分子转录的非编码链转录本之间形成双链的缘故。本发明的DNA分子优选能够在梭菌纲细菌细胞中复制。更优选能够进行条件复制。便利的是，所述DNA分子包含适合的复制起点，以及在革兰氏阳性细菌细胞中进行复制所必须的任何复制基因(即适合的rw基因)。优选所述DNA是质粒。所述DNA也可以是线性的，或者可以是如M13的丝状噬菌体。便利的是所述DNA分子是穿梭载体，其可以在如大肠杆菌的革兰氏阴性细菌细胞中复制并增殖，并可以在革兰氏阳性细胞中复制，特别是梭菌纲，更特别是梭菌属的细胞。此外或可选地，本发明的DNA分子包含容许从一个细菌细胞向梭菌纲细菌细胞进行接合转移的区域。特别优选DNA分子包含容许在大肠杆菌和梭菌纲细菌之间，更特别地在大肠杆菌和梭菌属细菌之间进行接合转移的区域。例如，DNA分子可包含onT(转移起点)区，包括fraJ基因。Davis,I,Carter,GYoung,MandMinton，NP(2005)"GeneCloninginC7ostnW/a"，In:HandbookonC7osfnV^a(DurreP,ed)37-52页,CRCPress,BocaRaton，USA提供了对梭菌进行转化和接合的方法。选择性标记可以是能够在梭菌纲细胞中表达，并能够用于筛选包含选择16性标记的梭菌纲细胞的任何适合的选择性标记。适合的选择性标记包括对毒素解毒的酶，例如前药转化酶。选择性标记还包括原养基因(在相应的营养缺陷型突变体中使用)。优选选择性标记是向表达所述选择性标记的梭菌纲细菌细胞提供生长优势的标记。因此，在给定生长条件下，与不表达选择性标记的同类细胞相比，表达选择性标记的细菌细胞通常能够生长(或生长较快)。合适的选择性标记包括抗生素抗性因子。因此，合适的选择性标记基因是向梭菌纲细菌细胞赋予抗生素抗性的基因。并非所有的抗生素抗性基因均可用于所有梭菌纲细胞中。例如，梭菌具有天然的卡那霉素抗性，并常具有三甲氧苄二氨嘧啶抗性。因此，优选选择性标记基因不是卡那霉素抗性基因或三甲氧苄二氨嘧啶抗性基因，特别是在所述细菌细胞是梭菌属的情况下。适合用于梭菌细胞(例如梭菌)的抗生素抗性基因包括红霉素抗性基因(例如五rm)和氯霉素抗性基因(例如mW)。另一种适合的抗生素抗性基因是te^M，例如来自粪肠球菌(五wferacocc^Tn916接合转座子的fdM(Roberts""/(2001)M/craZ)/o/.147:1243-1251)。另一种广泛用于梭菌纲细菌的适合的抗生素抗性基因是壮观霉素腺苷酸转移酶aafif(Charpentierd(2004)々p/.￡"v/ra".M^raWo/.70,6076-6085)。本发明的方法和DNA分子也可用于研究功能未知的基因。例如，对本发明的DNA分子进行改造以包含将被引入到梭菌纲细胞DNA中的独特寡核苷酸序列(称作标签)。可便利地产生分别包含不同标签序列的多个本发明DNA分子。当所述DNA插入到细菌染色体时，标签存在于基因组DNA中，并可通过如扩增、与标记寡核苷酸探针杂交而被检测出来，其中所述标记寡核苷酸探针的一部分具有与所述标签的一部分互补的序列。适合的标签、探针以及扩增和杂交方法描述于Hensel"(1995)5We"ce269:400-403中。通过本发明的方法可产生大量突变体，其中每个突变体都具有插入到不同基因中的DNA，并且每个突变体都可通过其独特的标签鉴定。通常，各个不同的重新靶向核酸都包含使其靶向梭菌纲细胞DNA中的不同基因的靶向部分。可将多个突变体引入到环境中一段时间内。随后，从所述环境中回收突变体。在回收的突变体库中检测各个标签的能力产生了关于特定突变体是否能够与其他突变体一样地生长或生存的指标。这样，可能鉴定出在所述环境中生长或生17存所需的基因。Hensel等人(1995;如上)使用类似的方法鉴定了沙门氏菌的毒力基因。在改进的上述方法中，可产生具有相同的标签但不同的随机II型内含子靶向部分以及相应的外显子序列的本发明DNA分子，收集并将其用于制备细菌突变体。WO01/29059描述了具有随机耙向部分的II型内含子。大部分DNA分子不会插入到细菌基因组的任何位置。然而，在靶向部分序列的控制下，一些DNA分子可能会插入到细菌基因组中的未知位点。在本方法中可使用足够大的本发明DNA分子库，从而获得DNA插入到其染色体的一个或多个克隆。可筛选出单个克隆。可使用具有不同独特标签的本发明DNA分子库重复该过程，从而获得具有独特标签的另一个单突变细菌克隆。这样，可产生分别具有独特标签的多个细菌突变体。如上所述，可将多个突变体暴露于环境中，从而鉴定影响在所述环境中生长或生存的特定突变。随后，表征由此筛选鉴定的突变体，从而鉴定DNA插入到哪个基因中。下文给出了关于编码经修饰的选择性标记的基因的更多细节，其中所述基因包含破坏所述选择性标记表达的I型内含子。选择性标记基因或其编码区可与DNA区域连接，例如在其侧翼具有容许在并入到染色体后切除选择性标记基因或其编码区的DNA区域。因此，可筛选出表达选择性标记的突变梭菌细胞克隆，并对其进行操作从而除去选择性标记基因。可使用重组酶切除所述DNA区域。重组酶通常识别位于被切除区域侧翼的特定DNA序列。Cre重组酶或FLP重组酶是优选的重组酶。也可以使用具有极罕见切割位点的限制性酶，从而在限制位点切割的DNA分子，其中将所述限制位点引入到选择性标记基因或其编码区的侧翼。优选的限制性酶是I-SceI。已将选择性标记基因切除的突变细菌细胞保留了II型内含子插入。因此，具有选择性标记基因的插入或不具有选择性标记基因的插入的突变细胞，具有相同的表型。由于此类突变细菌细胞在于RAM中不含选择性标记基因，可通过本发明的方法对其进行进一步的突变。尽管本发明DNA分子中的经修饰的II型内含子不表达IERT，该DNA分子可方便地在其他位点包含能够表达IERT的基因。如果待插入II型内含子的梭菌细胞使用的遗传密码不同于所述II型内含子以及其相关n型内含子编码的逆转录酶，优选对n型内含子编码的逆转录酶的序列进行修饰，使其包含与宿主细胞遗传密码对应的密码子。在本发明的特别理想的实施方案中，所述经修饰的n型内含子包含耙向部分。所述靶向部分通常容许将经修饰的II型内含子的RNA转录本插入到梭菌细胞的DNA分子内的位点中。所述位点通常是经选择的位点，并且对所述经修饰的n型内含子的靶向部分进行选择，使其耙向所述经选择的位点。在优选的实施方案中，所述经选择的位点位于梭菌细胞的染色体DNA中。所述经选择的位点通常位于特定基因中，或位于影响特定基因表达的DNA部分中。在此类位点插入经修饰的n型内含子通常会中断基因的表达并导致表型的改变。出于代谢工程的目的，可选择进行突变的基因。例如，在如热解糖梭菌(T7z^7W6)a"aero6ac&n'MW■sacc/wrofydcww)或具有类"[以f^i;IK乍用的梭菌纲其他成员的生物体中，可通过删除乳酸脱氢酶或磷酸转乙酰酶分别阻止乳酸盐(酯)或乙酸盐(酯)的形成，从而用于提高乙醇的水平(Desai"a/.(2004)如/緣油'o/胸gc/mo/.65:600-5)。在生产溶剂的梭菌(例如丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌)中，可以特异性地删除编码负责产生溶剂和酸的酶的基因，以此作为使丙酮和丁醇最大化生产的方式(参见JonesandWoods(1986)M/cro^'o/iw.50:484-524)。因此，通过删除负责产生乙酸盐(酯)的酶(磷酸转乙酰酶和/或乙酸激酶)、产生丁酸盐(酯)的酶(磷酸转丁酰酶和/或丁酸激酶)、产生丁醇的酶(丁醇脱氢酶A和/或丁醇脱氢酶B)和/或产生丙酮的酶(乙酰乙酸脱羧酶和/或乙酰乙酰辅酶A转移酶)，从而产生仅生成丙酮或丁醇的菌株。此外，通过向染色体中添加基因可拓展所述菌株的发酵能力，这样即可降解新的底物(糖、木质纤维素、半纤维素等)和/或制备新的终产物(异丙醇、1,3-丙二醇等)。可选择性地突变基因，从而测定其编码产物在毒力中的作用，这是开发疫苗及其他对策的先决条件。例如，在艰难梭菌中，由于此前不能产生等基因突变体，尚不确定毒素A和毒素B(CdtA和CdtB)的相对作用(BongaertsandLyerly(1994)A//cra6/"/17:1-12)。某些菌株(Perellea/(1994)/^k^/wmww.65:1402-1407)还产生肌动蛋白特异的ADP核糖转移酶CDT(CdtA和CdtB)。毫无疑问，其他因子也会产生毒力，特别是在初始定植过程中。现己提出有多个基因产物参与(Tasteyred"/(2001)/w/e"/附/m/"69:7937—7940;Calabi"a/(2002)/"/e"/附mw"70:5770-5778;Calabid(2001)/"々"/附ww"69:2144"2153)，包括与粘附、S层蛋白(SplA)以及迁移性(FliC和FliD)有关的那些基因。迄今为止，尚不能通过产生突变体获得这些因子参与疾病的明确证据。梭菌纲中很多细菌的基因组DNA序列是已知的。例如，丙酮丁醇梭菌(ATCC824(GenBank登录号AE001437))、艰难梭菌(GenBank登录号AM180355)、破伤风梭菌(C.^towOE88(GenBank登录号AEO15927)以及产气荚膜梭菌13(GenBank登录号BA000016)和肉毒梭菌的基因组DNA序列都是己知的。产孢梭菌的基因组序列是部分已知的，并且与肉毒梭菌的基因组序列非常类似。据此信息能够容易地确定插入位点，例如在开放读码框之内确定插入位点。优选本发明的DNA分子包含具有靶向部分的经修饰的II型内含子，所述DNA分子将所述经修饰的II型内含子的RNA转录本(或其DNA拷贝)靶向到这些细菌之一的基因组的基因中。如上所述，天然的II型内含子包含将所述内含子耙向到靶DNA中特异序列的区域。因为通过DNA底物的识别位点与RNP复合物中切下的II型内含子RNA的碱基配对，可以部分地识别DNA底物的识别位点，所以能够控制DNA底物中的核酸插入位点。这可以通过对EBS1序列、EBS2序列或S序列或其组合进行修饰而完成。由此类经修饰的II型内含子产生的RNP复合物能够在基因组中的新识别位点切割DNA底物并插入核酸分子。例如，可参考图1A和图lB所示的乳酸乳球菌的II型内含子Ll丄trB，修饰EBS1、EBS2和S，从而允许经修饰的II型内含子的RNA转录本与靶位点进行碱基配对。Mohr"(2000)&Z)eve/o;we"f14，559-573描述了II型内含子Ll丄trB的、能够将所述内含子重新靶向到特异DNA序列的DNA靶位点识别规则，所述文件通过引用并入本文。Perutka"a/(2004)JAfo/.历o/.336,421-429还描述了靶向部分的计算机辅助设计，所述文件通过引用并入本文。俄亥俄州立大学研究基金会(OhioStateUniversityResearchFoundation)的WO01/29059描述了基于筛选的方法，其中将期望的DNA靶位点克隆到受体载体中，使其位于无启动子的tef基因的上游，所述文件通过引用并入本文。从具有随机靶向部分(EBS和5)以及IBS外显子序列的组合供体库中筛选插入到所述位点的内含子。经修饰的Ll丄trB内含子包含异源启动子，这样当所述内含子插入到受体载体的靶位点时，tetR基因可得到转录，包含所述载体的细菌细胞即可被筛选出来。可通过PCR确定经修饰的内含子的序列。因此，可分离出能够插入到梭菌细胞的耙DNA位点的经修饰的II型内含子DNA。在II型内含子Ll丄trB的情况下，认为5区域与耙DNA中5'区域的相互作用对II型内含子的有效逆转录归巢并不重要。然而，内含子RNA中EBS2和EBS1之间的相互作用，以及靶DNA中IBS2和IBS1之间的相互作用，则更为重要。将II型内含子从RNA转录本切除时，认为所述II型内含子与侧翼外显子RNA的部分进行瞬时的碱基配对。特别地，EBS2和EBS1区域分别与5'外显子的IBS2和IBS1区域发生碱基配对。因此，优选修饰5'外显子的IBS2和IBS1区域，从而增强其与内含子RNA中经修饰的EBS2和EBS1区域的碱基配对。这有利于从其RNA转录本中有效地切除II型内含子。可方便地利用本领域已知的任何适合的定点诱变方法进行EBS2和EBS15位点以及IBS2IBS1位点的修饰，例如使用寡核苷酸定点诱变法或基于PCR的方法。本发明的DNA分子通常能够表达不同于选择性标记的抗生素抗性标记。例如，如果选择性标记基因是第一抗生素抗性基因，则所述DNA包含第二抗生素抗性基因。特别优选两个抗生素抗性基因都是能够在梭菌细胞中产生抗生素抗性的基因。例如，所述DNA分子中的选择性标记基因可以是红霉素抗性基因，并且所述DNA分子还包含氯霉素抗性基因(反之亦然)。所述DNA分子用于梭菌时，特别优选任意的抗生素抗性基因选自红霉素抗性基因(例如wmS)或氯霉素抗性基因(例如c"W)。可以理解，尽管可以方便地使本发明的DNA分子本身包含能够表达IERT的基因，但也可以在单独的DNA分子上提供。因此，本发明的另一个方面提供了包含本发明第一方面的DNA分子以及能够表达IERT的单独的DNA分子的试剂盒。所述DNA分子通常是质粒，优选可以兼容质粒。可以理解，所述试剂盒还可包含能够表达lac阻遏蛋白的DNA分子(通常是质粒)。在本发明的DNA分子包含可操作性地连接到II型内含子的IPTG诱导型启动子，但本发明的DNA分子不包含/""基因的情况下，这是有用的。本发明的第三个方面提供了将核酸分子引入到梭菌纲细菌细胞中的DNA分子的位点的方法，所述方法包括以下歩骤(i)向梭菌纲细菌细胞提供本发明的DNA分子以及能够表达II型内含子编码的逆转录酶的DNA分子；和(ii)培养所述细菌细胞，其中所述培养条件容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去I型内含子，并将包含选择性标记基因的所述RNA转录本(或其DNA拷贝)插入到所述位点。优选在容许表达选择性标记的条件下培养梭菌纲细菌细胞。通常基于选择性标记赋予的变化表型来选择已经将核酸分子引入到细胞内DNA分子的位点的梭菌目细菌细胞(即突变细胞)。便利地，所述选择性标记是抗生素抗性标记，并基于在存在相关抗生素的条件下的生长能力选择突变的梭菌细胞。便利地，克隆所选的细胞并获得细胞的单克隆。本发明的另一个方面提供了将核酸分子靶向到梭菌纲细菌细胞中DNA分子的选定位点的方法，所述方法包括向梭菌纲细菌细胞提供本发明的DNA分子以及能够表达II型内含子编码的逆转录酶的DNA分子，其中在本发明的DNA分子中，经修饰的II型内含子包含靶向部分；并培养所述细菌细胞，其中所述培养条件容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去I型内含子，并将包含选择性标记基因的所述RNA转录本(或其DNA拷贝)插入到所述位点内。可以理解，这样可能在梭菌纲(例如梭菌)细菌细胞的DNA(例如基因组)中产生定点突变。通过本发明的方法获得的梭菌纲的突变细菌细胞也是本发明的一部分。可以理解，在本发明的所有方面中，优选的梭菌纲细菌细胞是梭菌。特别优选梭菌细胞是热纤梭菌、丙酮丁醇梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、产孢梭菌、拜氏梭菌、破伤风梭菌、C."//"(>;"^附或腐败梭菌(CM/^^m)。梭菌细胞也可以是热解糖梭菌，这是用于工业乙醇生产的重要菌种。术语"梭菌"还包含罗斯氏菌属(i^W"n'a)，例如益生菌io^)訓'a/teW>^to。因此，优选本发明DNA分子中的选择性标记基因是能够用于在这些菌种中进行筛选的基因(例如，红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四22环素抗性基因或壮观霉素抗性基因)。还优选本发明的DNA分子包含复制起点，以及在这些菌种中进行复制所必须的任何复制基因。本发明的一个特别特点是经修饰的选择性标记基因包含中断所述选择性标记表达的I型内含子。所述选择性标记是能够在梭菌纲细菌细胞中表达，并可用于筛选梭菌纲细菌细胞，特别是梭菌细胞的选择性标记。特别优选所述选择性标记是可用于筛选梭菌的抗生素抗性基因。本发明的另一方面提供了包含经修饰的红霉素抗性基因的DNA分子，其中所述经修饰的红霉素抗性基因包含I型内含子。本发明的另一方面提供了包含经修饰的氯霉素抗性基因的DNA分子，其中所述经修饰的氯霉素抗性基因包含I型内含子。本发明的另一方面提供了包含经修饰的四环素抗性基因的DNA分子，其中所述经修饰的四环素抗性基因包含I型内含子。本发明的另一方面提供了包含经修饰的壮观霉素抗性基因的DNA分子，其中所述经修饰的壮观霉素抗性基因包含I型内含子。本发明还包含存在于宿主细胞(例如，大肠杆菌或梭菌纲细胞)中的这些DNA分子。优选I型内含子存在的方向与抗生素抗性基因的方向相反。I型内含子可以出现在抗生素抗性基因内的任何位置，例如在编码区，从而中断翻译，或在编码区上游，从而中断转录或翻译。I型内含子在抗生素抗性基因内的存在形式使得所述内含子在转录后，能够将其本身从RNA转录本上切除(剪接)。可将本发明的I型内含子取代为能够以方向依赖的方式从较大RNA上自我剪接的任何自催化RNA。可适宜地使用"IStron"，人们认为这是I型内含子与IS元件的融合体(HaselmayerWa/(2004)^"aeraZe10:85-92;Bannam"a/(2000)Mo/.Mk油'o/.36:1447-1459)。为了避免疑问，处于本发明的所有方面的目的，认为能够以方向依赖的方式从较大RNA上自我剪接的任何自催化RNA均为I型内含子，无论其是否需要辅助因子。优选不需要辅助因子的I型内含子。优选I型内含子不编码内含子编码的蛋白质，例如内含子编码的逆转录酶。这一特征防止切下的I型内含子重新插入到细菌基因组内的其他位点。23应注意到，I型内含子(例如噬菌体T4的td内含子)的剪接通常依赖于插入点侧翼的外显子序列。因此，本发明的经修饰的选择性标记基因(以及特别是在本发明此方面中，编码红霉素抗性和氯霉素抗性和四环素抗性和壮观霉素抗性的经修饰的抗生素抗性基因)包含的I型内含子被插入到侧翼为适合的外显子序列的位点，从而容许将所述I型内含子从RNA转录本切除，并且其中所得的剪接转录本(或其DNA拷贝)编码有功能的选择性标记(例如，功能性红霉素抗性或氯霉素抗性)。适合于I型内含子的侧翼序列是已知的。例如，就噬菌体T4的I型内含子td而言，内含子之前通常为G残基(即，出现在内含子的5')，而内含子之后通常为5'-ACCCAAGAGA-3'序列(SEQIDNo.3)(即出现在内含子的3')。内含子之后也可以是5'-ACCCAAGAA-3'序列(SEQIDNo.4)。在本发明的优选实施方案中，选择性标记(例如，红霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四环素抗性基因或壮观霉素抗性基因)的编码区在内含子的侧翼包含适合的序列。就td内含子以及组合的5'和3'侧翼序列5'-GACCCAAGAGA-3'(SEQIDNo.5)而言，取决于读码框，侧翼能够编码多种氨基酸序列(如实施例中更为详细的解释)。在框1中编码氨基酸序列DPRD/E(SEQIDNo.6);在框2中编码氨基酸序列R/GPKR(SEQIDNo.7)，并且在框3中编码氨基酸序列"X"TQE"Z"(SEQIDNo.8)，其中X可以是G、E、A、V、L、S、W、P、Q、R、M、T或K中的任意一个，Z可以是K、S、R、I、M、T或N中的任意一个。因此，在优选的实施方案中，选择性标记基因的编码区编码具有上述氨基酸序列的一段肽。在另一个优选实施方案中，内含子的3'外显子序列存在于选择性标记编码序列5'末端的适合的读码框中，这样，在缺失内含子时，编码序列编码有功能的选择性标记，其中在选择性标记多肽的N-末端包含连接肽。所述连接肽通常是420个，优选415个，通常为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基的肽，所述肽的一部分可由内含子侧翼的外显子编码序列编码。连接肽的存在基本不干扰抗生素的抗性活性。换而言之，由I型内含子切除后产生的核酸分子表达产生的多肽具有抗生素的抗性活性。也可以安排I型内含子的侧翼序列，从而使I型内含子的插入中断选择性标记基因的转录。例如，可将其置于启动子元件的(-35)(-10)之间。还可以安排I型内含子的侧翼序列，从而使I型内含子的插入干扰选择性标记基因的翻译。例如，可将其置于核糖体结合位点和起始密码子之间。可以理解，可使用如在Sambrookda/,"Molecularcloning:Alaboratorymanual",2001,第三版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY中描述的标准分子生物学技术制备本发明的DNA分子。现在将参考以下非限制性实施例和附图描述本发明。图1A:II型内含子Ll丄trB的二级结构模型。预测的二级结构由6个域(I-VI)组成。虚线表示在未剪接的前体RNA中，内含子与侧翼外显子之间EBS2/IBS2、EBS1/IBS1和5-S，的相互作用。在未经修饰的Ll丄trB内含子中，编码LtrA蛋白的开放读码框存在于标示为IV域的非结构性环中。B:II型内含子Ll丄trB识别DNA靶位点的机制。LtrA蛋白与II型内含子Ll丄trBRNA结合形成核糖核蛋白复合物。从前mRNA中切除内含子，释放核糖核蛋白颗粒。核蛋白颗粒定位到细胞内的靶DNA序列。未经修饰的核蛋白的耙DNA序列是没有内含子的//rfi基因拷贝，其序列如SEQIDNo.9所示。内含子RNA插入到上链的插入位点(IS)。随后在切割位点(CS)切割下链，LtrA从切割的DNA引导，并逆转录内含子RNA。由宿主的修复活性完成整合过程。通过LtrA与靶序列内核苷酸之间的相互作用，以及内含子RNA中的EBS2和EBS1与耙序列中的互补序列IBS2和IBS1之间的相互作用的组合介导对靶标的识别。灰色阴影表示被LtrA蛋白识别的最重要的核苷酸。图2由重新靶向核酸衍生的突变体的阳性筛选。A:来自位于质粒的重新靶向核酸的选择性标记基因的转录不产生抗性，这是因为所产生的mRNA保留了插入的I型内含子W，由此使选择性标记基因的表达被中断。由于转录方向的错误，W元件不能从mRNA剪切下来。B.通过添加IPTG诱导产生II型内含子Ll丄trARNA，导致从梭菌启动子/^开始的转录。选择性标记基因中的I型内含子W以正确的方向转录，并且WRNA从所产生的RNA中切除。C.将Ll丄trARNA和选择性标记基因插入到染色体中的靶位点。选择性标记基因不包含I型内含子W，因此选择性标记基因的表达没有受到干扰。因此，所述细胞表现出与选择性标记的表达相关的表型，所以可被筛选出来。图3pMTL5401Fcat在产孢梭菌和丙酮丁醇梭菌中的诱导性表达(a)大肠杆菌/梭菌穿梭质粒pMTL5401Fcat。(b)显示处于对数生长早期的包含pMTL5401Fcat的产孢梭菌克隆，(c)显示处于对数生长早期的包含pMTL5401Fcat的丙酮丁醇梭菌克隆，在使用1mMIPTG诱导后(■)或不进行诱导(▲)时，在细胞裂解液中监测CAT活性。图4适合于选择性标记基因的用于成功剪接I型内含子W的序列在核苷酸系列(SEQIDNos.132-134)上显示三个翻译读码框中的任意一个所需的氨基酸序列(SEQIDNos.6-8)。'X，位的氨基酸可以是G、E、A、V、L、S、W、P、Q、R、M、T或K。'Z，位的氨基酸可以是K、S、R、I、M、T或N。图5使用连接子添加到ermB基因上的RAM功能(a)将包含W内含子及其外显子的连接子插入到erm^ORF及其启动子(SEQIDNo.lO)之间，阻止红霉素抗性的表达。从反向链切除W内含子产生编码功能性蛋白质的修饰wm5基因(SEQIDNo.il)，其中所述蛋白质在其N-端具有12个额外氨基酸(SEQIDNo.12)。将ErmBtdRAMl的enwB启动子替换成ErmBtdRAM2中的启动子。(b)使用多个模板以及引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Rl进行PCR，其中所述引物位于ErmBtdRAMl中W内含子的侧翼。第1道ErmBtdRAMlDNA;第2道ErmBtdRAMlSEDNA;第3道由RNA合成的cDNA，其中所述RNA是在IPTG诱导后从包含pMTL201acZTTErmBtdRAMl的细胞分离出来的；第4道cDNA合成之前同一RNA制备物。(c)使用多个模板以及引物Thio-Fl和ErmB-Rl进行PCR，其中所述引物位于ErmBtdRAM2中W内含子的侧翼。第1道产孢梭菌^oft4突变体的基因组DNA;第2道pMTL007::Csp-^oO4-249s质粒DNA;第3道野生型产孢梭菌的基因组DNA;第4道水。图6ErmB/^/RAMl的特征和序列ErmBtdRAMl序歹U(SEQIDNo.13)图7ErmB似RAMl在大肠杆菌中被剪接的直接证据从表达pMTL201acZTTErmB^RAMl的细胞制备RNA，从而检测在诱导II型内含子RNA表达后，I型内含子W是否已经从ErmBtdRAMl切除。使用位于W插入位点侧翼的引物进行RT-PCR。在对照反应中，使用相同的引物通过PCR扩增ErmB/(iRAMl和经剪接的相同ErmBf(iRAMlSEDNA。第l道DNA对照；第2道ErmBWRAMl的PCR产物；第3道ErmBWRAMISE的PCR产物；第4道包含pMTL201acZTTErmB^/RAMl的细胞的总RNA的RT-PCR产物；和第5道RT-PCR的阴性对照。图8pBRR3中多克隆位点的构建质粒pBRR3-LtrB的克隆位点序列(SEQIDNo.14)和质粒pCR2.1-TOPO的克隆位点序列(SEQIDNo.15)。将所述的多克隆位点片段(SEQIDNo.16)插入到经切割的pBRR3-LtrB，从而制备出所述pBRR3-MCSl(SEQIDNo.17)，其包含在pCR2.1-TOPO质粒中发现的限制性位点。图9幼御论/2启动子的序列显示沩/启动子序列(SEQIDNo.18)以及决/2启动子序列(SEQIDNo.19)与共有启动子(SEQIDNo.20)的比较。"x"表示与共有序列相比发生取代的核苷酸。在各个序列中标出了位于(-10)~(-35)元件之间的间隔。图10ErmB^fRAM2的特征和序列ErmBtdRAM2序列(SEQIDNo.21)图llpMTL007的特征和序列最终的梭菌重新靶向系统(说明性实施例是重新靶向/"cZ的修饰衍生物)的质粒图谱和序列(SEQIDNo.22)。图12pMTL5401F的构建指出了每个步骤中使用的限制性位点。使用T4DNA聚合酶进行DNA末端的平端化。图13pMTL5402F和pMTL5402F-lacZTTErmBtdRAMl的构建指出了每个步骤中使用的限制性位点。使用T4DNA聚合酶进行DNA末端的平端化。图14pMTL007的构建指出了每个步骤中使用的限制性位点。图15突变体筛选和表征的实例(a)质粒pMTL007。(b，c)使用内含子特异性通用引物EBS以及基因特异性引物Cd-spo0A-R2(小箭头)进行PCR，从而对艰难梭菌^04基因中存在的内含子插入进行初步筛选。第l道水；第2道艰难梭菌亲株的基因组DNA;第3道pMTL007::Cd"/oO4-178a质粒DNA;第4~6道来自随机选择的3个EmK艰难梭菌克隆的DNA，其中所述克隆是使用pMTL007::Cd"jwO4-178a产生的。(d)使用针对的探针对艰难梭菌Wo04和/7,F突变体进行Southern印记。此探针与预先存在(无功能性)的染色体em^ORF杂交使第二带在亲本的泳道中也可以观察到。在woft4突变体的&^RV降解物中，两条带的大小类似。对丙酮丁醇梭菌(e)和产孢梭菌(f)进行同样的Southern印记。图16s/^A4突变体不形成孢子艰难梭菌、丙酮丁醇梭菌以及产孢梭菌的^oft4突变体和亲株在固体培养基上分别生长14天、4天或3天时的相差显微镜照片。以百分比的形式显示三个独立试验的平均产孢频率。实施例l:可由IPTG诱导的'fac'启动子的研发此前已经描述过携带人工启动子'/"c'的大肠杆菌/梭菌穿梭载体(pMTL540F)的应用。该质粒通过将大肠杆菌/acZ操纵子的操作基因插入到紧邻巴斯德梭菌铁氧化还原蛋白基因启动子的下游部位衍生而来(Foxetal(1996)Ge"e772^:3:173-178)。尽管曾将该启动子元件用于指导异源基因在梭菌中的高水平表达，但尚未证明具有受调控的转录。因此，构建了新型的大肠杆菌/梭菌穿梭载体pMTL5401F，其特征是具有/"c启动子、受丙酮丁醇梭菌磷酸转丁酰酶(A6)基因启动子转录调控的/^/阻遏物基因，以及质粒RK2的on丁区域，从而促进向产孢梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌的接合转移。为了检测pMTL5401F，我们插入了没有启动子的pC194c^基因拷贝，这样在所得质粒pMTL5401Ft^f图3)中该基因的转录受到/w启动子的调控。随后，我们使携带pMTL5401R^的产孢梭菌或丙酮丁醇梭菌细胞在存在或不存在外源IPTG的条件下生长，并分析其裂解物中CW基因产物的酶活性。在这两种生物中均观察到诱导现象，但是不存在IPTG的产孢梭菌中观察到显著的转录抑制(图3)，在丙酮丁醇梭菌中观察到显著的基础水平表达(图3)。尽管能够将pMTL5401F引入到艰难梭菌，但是在这种梭菌宿主中，28pCB102复制子的功能相对不足(PurdyW(2002)Mo/.Af/cra&'o/.46:439-452)，不能支持其转移接合子在添加了抗生素的液体培养基中生长。因此不能进行相同的诱导试验。实施例2:作为梭菌选择性标记的ErmB似的研发I型内含子W的剪接依赖于插入位点侧翼的外显子序列。被噬菌体T4的I型内含子W识别的靶位点是5，-GACCCAAGAA-3，(SEQIDNo.23)，并且在第一个'G'后插入内含子。然而，也可将I型内含子W插入到位点5，-GACCCAAGAGA-3，(SEQIDNo.5)(SigmaAldrichTargeTronTM基因敲除系统)。评估目前在梭菌中使用的抗生素基因序列是否具有这些序列，但未对并入这些序列的基因进行鉴定。如果蛋白质的编码区存在剪接位点5，-GACCCAAGAGA-3，(SEQIDNo.5)，那么该编码区编码的氨基酸序列将取决于其读码框。图4显示了剪接位点可能编码的氨基酸序列(对应于3个可能的框)。对已知赋予梭菌抗性的所有蛋白质的蛋白质序列进行筛选，但没有鉴定出任何包含期望氨基酸序列的候选蛋白质。因此，对编码选择性标记的基因进行工程改造，使其包含I型内含子^的插入位点。这将形成梭菌RAM的基础。选择粪肠球菌质粒pAMpl的天然wmB基因(赋予红霉素抗性)作为选择性标记基因，因为该基因已经广泛用于构建大肠杆菌/梭菌穿梭载体(Diirre,P.HandbookonClostridia.2005.TaylorandFrancis,CRCPress.)。设计包含所需剪接位点的连接子序列，并将其融合到^m5基因编码区的5'末端，实际上使所述蛋白质的N末端延长了12个氨基酸(图5)。在该序列的设计中，尽可能选择编码惰性和可溶性氨基酸的读码框，从而最大程度地减小对ErmB蛋白质功能的不利影响。框l(DPRD;SEQIDNo.6)为最佳选择，因为其包含应当有利于溶解的3个带电残基(Asp-ve，Arg+ve)。希望电荷的混合有助于阻止与蛋白质其他部分的强相互作用。连接子的其他部分由小惰性残基Gly和Ala构成，并带有一个Ser以避免出现可能降低蛋白质溶解性的疏水残基长链。此外，所选择的氨基酸序列引入了梭菌密码子的使用，从而最大程度地减少可能出现的任何表达问题。如下所述，使用以下表l所示的寡核苷酸引物，通过SOEingPCR构建了两个构建物ErmBWRAMl(包含在图6所示位点插入的W内含子的修饰em^基因)(SEQIDNo.13)，和经剪接的等价物Splicedequivalent,SE)，其中不存在W内含子。将ErmB^RAMl和ErmB^RAMlSE分别克隆到高拷贝质粒pMTL5402F中，其方向与/ac启动子相反(这样，由RAM或SE本身的启动子赋予抗性)。表h寡核苷酸引物序歹ij(5'—3')序列号ErmB-Pro-F3ErmB-Pro-RA连接子l-ErmB-FlErmB國RlErmB-Pro-RBtdGpI-FltdGpI-RlThio画FlThio-R-RAMCTACGCGTGGAAATAAGACTTAGAA24GCAAACTTAAGAGTGTGCAGAAGCACCAGCATCTCTTGGGTC25CATGTAATCACTCCTTCTTAATTACAAATTTTTAGCATCACCCAAGAGATGCTGGTGCTTCTGG26TGCTGGTATGAACAAAAATATAAAATATTCTCAAAACTTTTTAACGAGTGGAACGCGTGCGACTCATAGAATTATT27TCCTCCCGGGGGTAAGATTAACGACCTTATCTG28AACATAATGCCATGTAATCACTCCTTCTTAATTACAAATTTTTAGCATCGCATTATGTTCAGATAAGGTCGTTAA29TCTTACCCCCCAGAAGCACCAGCATCTCTTGGGT30TAATTGAGGCCTGAGTATAAGCTACTAGTACGCGTTATATTGATAAA31AATAATAATAGTGGGCCTTATCTGAACATAATGCCATATGA32ATCCCTCCTAATTTATACGTTTTCTC按照以下方式制备ErmB^RAMlSE。使用引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Pro-RA，通过PCR从pMTL5402F扩增出ermS启动子。使用引物连30接子1-ErmB-Fl和ErmB-Rl，通过PCR从pMTL5402F扩增出ORF。对PCR产物进行凝胶纯化，并在使用外侧引物(outerprimer)ErmB-Pro-F3和ErmB-Rl的SOEingPCR中将其作为模板使用。将编码ErmBtdRAMlSE的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO中。从pCR2.1::ErmBtdRAMlSE切下///"dlll/lol片段ErmBtdRAMlSE，并将其连接到使用相同酶线性化的pMTL5402F中。这使得在所得的质粒pMTL5402F::ErmBtdRAMlSE中，ErmBtdRAMlSE的放置方向与/ac启动子的方向相反。按照以下方式制备ErmBAiRAMl构建物。使用引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Pro-RB，通过PCR从pMTL5402F扩增出em5启动子。使用引物连接子1-ErmB-Fl和ErmB-Rl，通过PCR从pMTL5402F扩增出erwSORF。使用引物tdGpI-Fl和tdGpI-Rl，通过PCR从pACD4K-C扩增出被消弱的I型内含子W及其外显子。对PCR产物进行凝胶纯化，并在使用外侧引物ErmB-Pro-F3和ErmB-Rl的三向SOEingPCR中将其作为模板使用。将编码ErmBtdRAMl的PCR产物克隆到pCR2.1-TOPO中。从pCR2.1::ErmBtdRAMl切下///"dlll/^ol片段ErmBtdRAMl,并将其连接到使用相同酶线性化的pMTL5402F中。携带pMTL5402F::ErmB^RAMl的大肠杆菌对500lig/ml和125lig/ml的红霉素敏感(37。C过夜不生长)。携带pMTL5402F::ErmBAiRAMlSE的大肠杆菌对500)ig/ml和125ng/ml的红霉素具有抗性(37。C过夜生长)。这些试验证明经修饰的e^^基因赋予大肠杆菌红霉素抗性，同样重要的是还证明插入W使所述基因失活。实施例3:在大肠杆菌中验证选择性标记ErmBtd将pACD4K-C的重新耙向核酸成分M7d(平端)片段亚克隆到pMTL20(Chambersda/(1988)68:139-149)的i7/w/III和Smfll位点之间，再次证明fecZm新靶向区域能够敲除大肠杆菌宿主HMS174(DE3)中的/"cZ基因。然后，将pMTL20/acZTT中的ii:朋RAM替换为MiJ片段ErmBWRAM1。收集携带pMTL201acZTTErmB^RAMl的大肠杆菌细胞并制备RNA，从而检测在诱导II型内含子RNA表达后I型内含子W是否已经从ErmBtdRAMI剪接出来。随后，使用位于W插入位点侧翼的引物进行RT-PCR反应。作为对照，对ErmBWRAMl和ErmB^/RAMISE(ErmBWRAMl的剪接等价物)进行标准PCR。如图7所示，从经IPTG诱导的RNA样品中获得的主要产物具有对应于SE基因的较小大小。这清楚地说明W从ErmBWRAMI中的经修饰wm5基因的RNA中剪接出来。尽管已经发生了证明ErmBWRAMl剪接的事实，但是在将IPTG诱导的细胞平铺到添加了500)ig/ml、250)ig/ml或125lag/ml红霉素的琼脂培养基后，并未获得红霉素抗性菌落。由于大肠杆菌对较低水平的抗生素具有天然的抗性，不可能进一步降低抗生素的浓度。不能获得红霉素抗性菌落可能是由于拷贝数目的影响。因此，插入到基因组的单拷贝可能不足以产生高于野生型大肠杆菌通常固有的低水平抗性的抗生素抗性。为了检测这种可能性，使携带ErmB^RAMlSE的DNA片段与经切割的pACYC184连接，将连接混合物转入大肠杆菌，并将其平铺到包含四环素或红霉素的2YT培养基上，其中四环素或红霉素有3种不同的浓度，500pg/ml、250pg/ml和125pg/ml。在Erml25和Tet上生长的克隆数目相似，但在Erm250上生长的克隆数目比其低若干倍，仅有少数克隆在Erm500上生长。此对照试验将筛选pACYC184中存在的ErmB^RAMlSE的遗传性的操作限值设定为125吗/ml。在确定筛选大肠杆菌中ErmB^RAMlSE所需的红霉素水平后，使用引物/acZtarget-F(ACGAATTCCGGATAATGCGAACAGC-GCACGG;SEQIDNo.33)和/acZtarget隱R(TGCGATCGCACCGCCGA画CGGCACGCTGATTG;SEQIDNo.34)，通过PCR扩增包含耙向区域的/"cZ区域，将其克隆到pCR2.1TOPO中，随后亚克隆到pACYC184中，而pACYC184在大肠杆菌细胞中以数个拷贝存在。随后，通过将pMTL201acZTTErmBMlAMl引入到携带pACYC184::/^Z的大肠杆菌细胞中，重复所述重新靶向试验。经IPTG诱导后，将细胞平铺到包含红霉素的培养基上。与之前的试验相反，获得了适当数量的抗性菌落。在诊断PCR中使用适合的引物确认发生了II型内含子向pACYC184中/^Z基因的重新耙向。因此，ErmB^/RAMlSE以单拷贝存在时，ErmB的表达不足以赋予红霉素抗性，但以多拷贝存在时，ErmB的表达量足以赋予抗性表型。实施例4:使用选择性标记ErmBtd构建梭菌重新靶向系统在确认ErmB^RAMl能够取代Sigma-AldrichII型内含子中的AT"nRAM后，将整个元件与重新靶向/"cZ的区域一起从pMTL201acZTTErmB^RAMl(历"dlII/5bcI和5^I/M^I片段)亚克隆到梭菌表达载体pMTL5402F(经历mini-M2el切割)中，从而得到pMTL5402FlacZTTErmB^/RAMl。结果使II型内含子的表达在/""c启动子的控制之下。II型内含子的表达可被IPTG调控。检测该载体重新靶向大肠杆菌中pACYC184::/^Z上的/^rZ基因的能力。在IPTG诱导并平铺到红霉素板上后，证实了成功的重新靶向。实施例5:含ErmBWRAMl的II型内含子重新耙向效率的测定为了评估与X朋RAM相比，ErmB^RAMl是否影响II型内含子的重新靶向效率，我们使用Karberg等人研发的双质粒系统进行了若干迁移性试验(Karbergda/,2001，如上)。IPTG诱导后，1I型内含子从pACD2重新耙向到pBRR3-LtrB(携带其天然耙标LtrB)，结果激活后一个质粒中的Tet基因。因此，可基于四环素抗性的获得检测单个重新靶向事件。因此，通过在载体的唯一MwI位点插入ErmB^RAMl或i^wRAM，修饰质粒pACD2。随后，将这两个质粒转化到包含pBRR3-LtrB(即，带有野生型靶序列的受体质粒)的HMS174(DE3)细胞中。在筛选供体质粒后，使用500^MIPTG诱导细胞1小时，将细胞重新悬浮于LB中，使其恢复l小时，随后将经过不同稀释的细胞悬液平铺到多个选择性平板上。对于那些包含RAM的构建物，首先将TetK克隆重新划线到Tet平板上，随后再划线到包含适当抗生素的平板上，从而检测RAM剪接。结果显示于表2中。此试验证明KanRAM和ErmB^RAMl对内含子效率具有相似的影响，这可能主要起因于内含子大小的增加。重要的是，数据表明两种RAM剪接的效率类似。供体质粒结果内含子迁移效率*RAM剪接效率卞pACD2(空)100n/apACD2::KanRAM10-318/20pACD2::ErmBtdRAM~10-318/20*内含子迁移效率Te^克隆/AmpKCmK克隆卞RAM剪接效率=KanR或ErmR的重划线TetR克隆/所有的重划线TetR克隆通过最初的抗生素抗性均不能检测到两个RAM的剪接，仅在重划线TetR克隆时才可检测到。实施例6:有效的梭菌重新靶向序列的鉴定为了评价ErmB^RAMl的重新耙向，从3中不同梭菌种中选出8个不同的测试基因。它们是产孢梭菌;,F、^o似、cMrmSOM9，艰难梭菌/,Ff基因组注释号CD3592)和^oft4f基因组注释号CD1214)，丙酮丁醇梭菌f基因组注释号CAC2652)和wo04。在http:〃www.sigma-a:enosvs.com/targetron/对各个基因进行分析，并鉴定容许重新靶向的合适改变。按照Sigma-AldrichTargeTronTM基因敲除系统使用指南的指示，使用适合的引物进行PCR，从而产生恰当的经修饰的n型内含子。每次PCR需要独特的IBS、EBS2和EBSld引物以及EBS通用引物，其中所述独特的IBS、EBS2和EBS1d引物均经过设计以修饰II型内含子的靶向部分或其5'外显子。以下表3和表4给出了各个基因的靶定插入位点序列和引物序列。34表3:重新靶向核酸的预测靶定插入位点<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a靶用生物体、ORF和插入位点表示。靶定插入位点经过选择，这样从ORF起点开始所表示数目的碱基后以正义方向(s)或反义方向(a)插入内含子。表4:用于产生重新靶向的PCR产物的寡核苷酸引物<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>为了确保经修饰的n型内含子能够重新靶向所选定的梭菌基因，首先使用已知可有效作用的质粒系统在大肠杆菌中进行试验。所使用的系统是实施例5所述的Karberg等人(2001)研发的双质粒系统。利用该系统，将工程改造的II型内含子放置到一个质粒(pACD2)上，并将其靶点(在此情况下为克隆的梭菌基因)放置到第二质粒(pBRR3)上。1I型内含子从pACD2到pBRR的重新靶向造成后一质粒上Tet基因的活化。因此，可基于四环素抗性的获得检测单个重新靶向事件。将部分细菌平铺到非选择性琼脂板上，从而获得活细菌总量的指标，并将部分细菌平铺到包含四环素的琼脂板(Tet板)上。基于具有四环素抗性的活细菌总量的比例评价重新靶向的效率。为了促进靶基因从pCR2.1/pCRI1TOPO质粒到pBRR3质粒的亚克隆，向pBRR3-LtrB中引入多克隆位点，从而制备pBRR3-MCSl。这是通过在pBRR3-LtrB的A^II和五coRI位点之间插入多克隆位点片段而完成的，所述多克隆位点片段包含在质粒pCR2.1-TOPO中发现的限制性位点。图8显示了克隆位点的序列。图8所示的多克隆位点片段是由寡核苷酸MCSlaCTCGAGGTACCATGCATAGGCCTGAGCTCA-CTAGTGCGGCCGCG(SEQIDNo.68)和寡核苷MCSlbAATTC-GCGGCCGCACTAGTGAGCTCAGGCCTATGCATGGTACCTCGAGACGT(SEQIDNo.69)制备的。使用双质粒内含子迁移性试验评估了4个重新靶向核酸(分别用于插入产孢梭菌基因p,F、^poft4、codF和S(9M)中的一个)。所有4个核酸均表现出远高出预期的有效重新靶向。因此，选择铺Tet板的稀释度并不理想，其位于进行克隆计数的范围之内，所以与使用较少细菌铺板的情况相比，此时所给出的效率的准确性较差。还评价了另外4个重新靶向核酸(分别用于插入艰难梭菌基因p"f和^o04或丙酮丁醇梭菌基因p^F和woft4中的一个)。通过将细菌平铺到Tet板来评价重新靶向事件。在此初步试验中，SONO没有产生En^克隆。结果显示于表5中。表5:内含子迁移性试验的结果供体质粒受体质粒内含子迀移效率*pACD2::Cs画spoOA-249sTRpBRR3::Cs-spoOAAS2frag~15%pACD2::Cs-codY-417sTRpBRR3::Cs-codYAS2frag~20%pACD2::Cd画pyrF國97aTRpBRR3::Cd-pyrF-97target~100%pACD2::Cd-spoOA國178aTRpBRR3::Cd画spo0A曙178target200/0pACD2::Cs陽pyrF-595sTRpBRR3::Cs画pyrF2%pACD2::Ca画pyrF-345sTRpBRR3::Ca-pyrF~0.2%pACD2::Ca-spoOA-242aTRpBRR3::Cs画spoOA20%pACD2::Cs-SONO誦492sTRpBRR3::Cs-SONO、、ND*内含子迁移效率=1^11克隆/紐1101/克隆，Cs:产孢梭菌；Ca:丙酮丁醇梭菌；Cd:艰难梭菌。数字是指在正义方向(s)或反义方向(a)上，内含子插入位点相对于基因起点的位置。TR=重新靶向核酸实施例7:在梭菌中评价重新靶向核酸将前4个新型重新靶向核酸(分别用于插入产孢梭菌基因p,F、^oft4、codr和SCWO之一)亚克隆到原型载体pMTL5402FTTErmB^RAMl中，并将所得重组质粒引入大肠杆菌供体CA434中，由此将其与作为受体的产孢梭菌或艰难梭菌用于接合试验。在后一种情况下，没有获得转移接合子。在产孢梭菌的情况下，使用两个质粒均获得了转移接合子。将单个转移接合子接种到添加了250pg/ml环丝氨酸以及7.5pg/m甲砜氯霉素(后者保证质粒的保持)的适合生长培养基中，并在37"C下厌氧温育过夜，从而使其生长至稳定期。将150nl此培养物接种到相同类型并包含相同添加物的1.5ml新鲜肉汤中，随后在37。C下厌氧温育。一旦能够在培养物中观察到生长物(通常在l小时后)，即使用lmMIPTG诱导培养物，并温育1小时。在7000rpm离心1分钟，收集2ml经诱导的细胞，通过重悬于PBS中进行清洗，并按上述方式收集细胞。将细胞团重新悬浮在等量(2ml)的不含添加物的适合生长培养基中，并在37t:下厌氧温育l小时。随后，在l小时、24小时和48小时后将培养物的系列稀释物平铺到添加l-10pg/ml红霉素的适合的固体生长培养基上，并在37i:下厌氧温育。2个独立试验并未获得红霉素抗性克隆。实施例8:关于天然ermB启动子的功能太差，以至于不能驱动足以使ErmB发挥选择性标记作用的表达的证据对实施例7中所述的不能检测到重新靶向核酸的重新靶向作用的一种解释是ermB启动子的功能太差，从而不能使细胞染色体中的单拷贝基因赋予细胞红霉素抗性。对粪肠球菌质粒pAMpi的ermB启动子序列的分析表明，启动子-35和-10区域之间的间隔为21bp。革兰氏阳性启动子的最佳长度是17土lbp。将ErmB/c/RAMlSE以相对于/ac/^两个不同的方向克隆至UpMT5402F中。只有所述基因在/^的控制之下时，携带ErmBf^MlSE的质粒才能向产孢梭菌宿主赋予红霉素抗性。尽管^777￡存在于多拷贝质粒上，但由于在相反的方向上，wmB编码区的转录依赖于其本身的启动子，所以其表达不足以产生抗性。实施例9:具有强启动子的梭菌ErmBtdRAM的研发丙酮丁醇梭菌基因的启动子是公认的强组成型启动子。设计引物从而将ErmB/6/RAMl启动子替换为启动子。这将删除位于转录起始位点与核糖体结合位点之间的非必需序列，并在起始密码子处插入iV&I位点，从而39容许在必要时再次简单地变更启动子。为了防止fW启动子过强的可能性，通过将-35和-10之间的间隔改为16nt并对-35和-10元件进行微小改动，设计出突变启动子W2'。图9显示了启动子和启动子-35和-10元件间的序列，并将其与革兰氏阳性共有生长性启动子进行比较。图10中显示了位于ErmB^RAM2序列的15-84位的启动子的完整序列。启动子的完整序列仅在图9所述区域中与启动子的序列不同。使用SOEingPCR和克隆步骤将A/启动子和启动子与ErmB^RAMl和ErmB^RAMlSE的起始密码子融合，产生各包含启动子的ErmB/^RAM2和ErmBWRAM2SE，以及各包含启动子的ErmB^RAM3和ErmB^RAM3SE。获取序列正确RAM2和RAM3克隆，并亚克隆至pACD2和pMTL201acZTT中进行评估。图10描述了ErmB^RAM2的特征和序列。如下表6所示，使用包含RAM2部分和RAM3部分的质粒测定这些部分赋予大肠杆菌TOP10细胞红霉素抗性的能力。表6:具有新型构建物的TOP10克隆对红霉素的敏感性<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在除SETOPO质粒之外的所有质粒中，erm5基因都被I型内含子中断，因此预期不能产生抗性。在SETOPO质粒中基因没有被中断，因此，如果的启动子足够强，则应该获得抗性表型。出乎意料的是，RAM2TOPO克隆向大肠杆菌赋予红霉素抗性。在这种情况下，极强的决/启动子和极高的拷贝数似乎克服了I型启动子的存在，这可能是通过在天然ATG发生极少的翻译起始造成的。仅在基因存在于TOPO时观察到这种效应。在插入到用于重新靶向的相关质粒(例如pACD2和pMTL201acZTTRAM时)，大肠杆菌细胞没有红霉素抗性。RAM3表现的抗性情况与预期一致。因此，每个启动子似乎都能够在梭菌重新靶向核酸中驱动选择性标记的表达。实施例10:在pACD2/pBRR3系统中评价ErmBtdRAM2和ErmBtdRAM3使用实施例5所述的重新耙向系统评价ErmB^RAM2和ErmB^/RAM3的重新靶向效率。结果显示于下表7中。表7:内含子迁移性试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>*内含子迁移效率=1^11克隆/八11^110^克隆卞RAM剪接效率=Kai^或ErmR的重划线TeP克隆/所有的重划线Te^克隆RAM2和RAM3的剪接是有效的(90%)，并且与原始RAM(RAMI)相当。实施例11:在大肠杆菌中的pMTL201acZTT系统中评价ErmBtdRAM2和ErmBtdRAM3如前所述，使用Ery5。o或Eryu5时，两个RAM都不能用于检测II型内含子至大肠杆菌HMS174(DE3)基因组中/acZ的重新靶向。RAM2而非RAM3产生了大量的EryR克隆，但PCR显示，它们不包含重新靶向/"cZ基因的II型内含子。推测产生这些克隆的原因是由于质粒赋予的微弱抗性。实施例12:图11显示了载体pMTL007(也称作pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM2)的基本成分。此II型内含子经过修饰以使其重新靶向lacZ基因。可对其进行修饰以使其重新靶向梭菌纲细菌细胞的基因。所述质粒的基本成分是引起重新靶向核酸元件表达的梭菌启动子，在本说明性实例中其是诱导型启动子/M。可使用通过操作子的方式进行诱导的类似的其他启动子，例如/""。为了介导诱导作用，所述质粒还携带了受梭菌启动子控制的大肠杆菌/""基因，在本实例中所述梭菌启动子为丙酮丁醇梭菌內6基因(编码磷酸转丁酰酶)的启动子。可使用组成型启动子替代诱导型启动子。所述质粒还携带质粒pMTL20E的ColEl复制子，从而容许在大肠杆菌中保持所述质粒，还携带酪酸梭菌(C/asmW/Mw^i)r/cMw)质粒pCB102的复制区，从而容许在梭菌种中保持所述质粒。此外，还通过包含^/P基因以保证在大肠杆菌(通过向培养基中添加氯霉素)和梭菌(通过向培养基中添加红霉素)中筛选所述质粒，从而保持所述质粒。所述载体还携带了质粒RP4的owr区，这样除进行转化之外，还提供了通过接合将所述质粒引入梭菌受体的可能性。所有这些元件都可以与其他来源的其他等价因子互换。因此，可将ColEl替换成能够在大肠杆菌中复制的其他复制子，例如pl5a、pVWOl或噬菌体复制起点(例如M13)。可将c^P取代为其他适合的抗生素抗性基因，例如te/M或^^/。类似地，可采用能够在靶定梭菌或革兰氏阳性细菌宿主中复制的任何复制子，例如pIM13、pIP404、pAMM、pCD6、pC194、pE194、pT181、pCB101、pBPl。也可以采用具有复制缺陷的复制子，包括条件型复制的复制子，例如温度敏感型或依赖外源因子进行复制的复制子。也可以采用缺少在革兰氏阳性菌中进行复制所必需的任何条件的质粒，即仅携带了ColEl复制子的自杀载体。也可以采用操纵子与阻遏物基因的其他组合。另一个候选者的代表为在接合转座子Tn5397上鉴定出的受四环素调控的启动子(Roberts,PhDthesis,UCL)。也可以是最近发现在丙酮丁醇梭菌中起作用的，来自木糖葡萄球菌的木糖诱导型启动子(Girbal"(2003)々少/五"vz'ra"M'craWo/.69:4985-8)。另一个候选者是在枯草芽孢杆菌中开发的受W调控的启动子(GeissendorferandHillen(1990)Jp//.M/craZn'o/.5/otec/2wo/,33:657-63)。它是通过在强启动子矽/的(-35)~(-10)位之间添加W操纵子(WO)序列而构建的(GeissendorferandHillen,19卯，如上)。在存在Wi基因(编码阻遏物)的条件下，亚致死浓度Tet的诱导能够100倍地诱导衍生化启动子。通过添加第二fef操纵子能够完全消除所得的基础水平表达，尽管该添加导致表达水平的整体下降。因此，该启动子在金黄色葡萄球菌中得到了广泛应用(BatemandW(2001)/w/e"/画亂69:7851-7;Ji"a/(2001)5We膨293:2266-2269)，其中证明仅有单个操纵子是必需的。受^"周控的启动子是我们研发的/^//^/系统的理想选择。因此，我们能够使用用于表达/"c/的同一启动子(丙酮丁醇梭菌pA启动子)来表达fe^。在枯草芽孢杆菌中，诱导的程度在整个测试范围内均具有剂量依赖性。然而，枯草芽孢杆菌对抗生素敏感，因而不能添加高浓度的Tet。对于具有该抗生素抗性的梭菌(例如艰难梭菌)则没有类似的应用限制。为了检测此系统的可行性，我们将重新合成/"c，将(-35)(-10)间的区域替换成tert9。若果在不存在Tet的条件下观察到高的基础水平表达，可添加第二操作子。还可进一步添加合成的/"c(9序列，以用于增强LacI对启动子的阻遏作用(Muller"W(1996)JMo/所o/.257:21-9)。pMTL007的构建下表8中显示了在构建中使用的寡核苷酸引物表8:寡核苷酸引物弓物序列(5'-3')序列号Iacl-PlGTGGTGCATATGAAACCAGTAACG70lacI-P2GAATTCCTAACTCACATTAATTGCGTTGCG71ptb-PlGAATTCAGGGAATTAAAAGAATGTTTACCTG72ptb-P2ACTCATATGTTGCACCTCTACTTTAATAATTTTTAAC73tdGpI隱FlGCATTATGTTCAGATAAGGTCGTTAATCTTACCCC29CatPFwdCAGCTGACCGGTCTAAAGAGGTCCCTAGCGCCCGGTCATGCTGTAGGTACAAGGTAC74CatPSOER75CatPRevCAGCTGACCGGTCTCTGAAAATATAAAAACCACAGATTGATAC76CatPSOEFGTACCTTGTACCTACAGCATGACCG77Thio-FlCTACTAGTACGCGTTATATTGATAAAAATAATAATAGTGGG78Thio誦R隱RAMCCTTATCTGAACATAATGCCATATGAATCCCTCCTAATTTATACGTTTTCTC79从酪酸梭菌质粒pCB102(MintonandMorris(l術)/Ge打M.c油'o/127:325-33)中分离1.627kb的hp/-///mini片段并使用Klenow聚合酶进行平端化。使用M^I切割复制子克隆载体pMTL21E(Swinfield"(1990)87:79-89)，使用Klenow聚合酶进行平端化，并与分离的pCB102复制子片段连接。如图12所示，所得质粒被命名为pMTL540E(TDavis，PhDThesis,TheOpenUniversity,1989)。诱导型启动子元件来自于巴斯德梭菌铁氧化还原蛋白基因的启动子。现命名为々c，其创建过程包括在紧邻铁氧化还原蛋白基因启动子+1位之后添加大肠杆菌的/"c操纵子，并将紧邻铁氧化还原蛋白结构基因ATG起始密码的序列变成CAT，从而产生A^el限制性位点(CATATG)(Minton"a/(1990)VectorsystemsforthegeneticanalysisofC/oWnV^'wmIn:JwaeraZ)es/"//wm朋Afei/c/"e朋d/"血s吵(edsPBoriello&JHardie),WrightsonPublishing,Petersfield,UKpp.187-206)。在此特定实例中，/ac操纵子的插入方向与/^启动子的转录方向相反。然而，这并不影响其功能性，Lacl蛋白仍能够结合并抑制从启动子开始的转录。随后，将/"c启动子的7Wfel和五coRI限制性片亚克隆到质粒pMTL1003(Brehm"G/(1991)^7//.所otec/2"o/.36,358-363)的相同位点间，产生质粒pMTL1006。该亚克隆步骤有效地除去了pMTL1003的frp启动子，并将/acZ，的表达置于经修饰的/d启动子的控制之下。随后，对质粒pMTL1006进行fig/I酶切，并分离所得两个片段中较大的一个。类似地，使用Bg/I切割质粒pMTL500E(Oultramda/(1988)F五MSM/cra6/。/丄""56:83-88)，分离所得两个片段中较大的一个，并将其与从pMTL1006分离的较大片段相连接。所得质粒被命名为pMTL500F(Fox"a/,1996，如上)尽管pMTL500F能够在梭菌中充分复制，但是我们发现基于pAMpi的穿梭载体向梭菌的转移效率相对不足。因此，我们选择将复制子更换成pCB102的复制子。因此，使用Sg/I切割pMTL540E和pMTL500F，并将pMTL540E的较大片段与pMTL500F的较小片段连接。所得质粒被命名为pMTL540F(Fox"a/,1996，如上)。为了简明起见，将pMTL500E片段和pMTL1006片段的连接，以及pMTL540E片段和pMTL500F片段的连接表示为图12中pMTL540E和pMTL1006的单个连接。为了在转化尚未得到证实的情况下确保质粒的接合转移，我们选择向所述质粒提供质粒RP4的on丁(转移起点)。这样，使用五coRV和从pEoriT(Purdy&a/.,2002)切下RP4W7丁区，并将其亚克隆到pMTL540F的五coRV限制性位点，从而产生pMTL5400F(参见图12)。为了引起LacI阻遏蛋白的产生，使用引物lacI-Pl和lacI-P2，通过PCR从pNM52(Gilbertd"/(1986)M/cra&b/.132:151-160)扩增出约1.0kbAWel-五coRI片段无启动子的大肠杆菌/"c/基因拷贝。同时，使用引物ptb-Pl和ptb-P2，通过PCR扩增丙酮丁醇梭菌pA(磷酸转丁酰酶)基因的启动子区域。这使基因限定为578bp的i^oRI-iV^I片段。分离所述两个片段，并与经五coRI切割的pMTL20E连接，从而将/"c堪因置于/^启动子的转录调控之下，并将经修饰的基因限定为可移动的^:②Ri片段。从产生的质粒切除该片段，使用Klenow聚合酶进行平端化，并与经五coRV切割的pMTL5400F连接。如图12所示，将获得的质粒命名为pMTL5401F。质粒pMTL5401F携带作为选择性标记的wm基因。因此，它与ErmRAM不相容。因此将erw基因替换为pJIR418的基因(Sloan"(1992)尸/画W27:207-219)。完成此过程的步骤包括使用J緒額IIl切割pMTL5401F，使用Klenow聚合酶对DNA进行平端化，随后把使用J/^I和^//zml酶切pMTL5401F产生的的两个片段中较大的一个连接到携带pJIR418c^户基因的l.lkb/VwII片段上。该操作的结果是完全删除wm^并除去大部分Wfl基因。如图13所示，将获得的质粒命名为pMTL5402F。在此取代之前，通过破坏fi^Gl回文的序列突变除去片段中的SwGl位点，，而不改变ca^的编码序列。使用引物CatPSOEF和CatPSOER，通过片段拼接延伸(SewingOverlapExtension,SOE)PCR(Horton""/.，1990)进行此歩骤。此夕卜，经设计所使用的侧翼引物CatPFwd和CatPRev包含位点和内在的^gel位点。引入前者是为了随后将所述质粒插入pMTL5401F，而引入后者则有利于将来某时将最终质粒pMTL007中的c^尸取代为其他可选的标记。按照以下步骤构建pMLT007:TargetronTM质粒pACD4K-C购自于Sigma，并根据提供的方案利用试剂盒提供的对照引物使其重新靶向大肠杆菌的/^Z基因，与试剂盒提供方案的不同之处在于，首先克隆PCR产物，并在将HindlII/BsrGI片段亚克隆到pACD4K-C之前，验证其序列。如图13所示，切下重新耙向lacZ的核酸区域(5099bpNael片段)，并将其连接到pMTL20的2412bp片段上，其中，预先使用HindIII和SmaI酶切，并使用T4聚合酶使HindlII末端平端化，从而产生pMTL20的2412bp片段。倾向选择HindIII和NheI位点位于重新靶向核酸区域的侧翼的构建物。如图13所示，使用MluI切除KanRAM，并替换为包含ErmBtdRAM2的1259bpMlul片段。随后将包括ErmRAM的完整的重新靶向lacZ的核酸区域切割为3.3kbp的HindlII/SacI片段和1.8kbp的SacI/Nhel片段，将其一起连接到经HindIII和Nhel酶切的pMTL5402F中。所得质粒被命名为pMTL5402FLacZTTErmBtdRAMl。使用引物Thio-Fl和Thio-R-RAM，通过PCR从pSOS95(Tummala"a/(2003)/^rfm'o/.185:1923-1934)扩增丙酮丁醇梭菌ATCC824的启动子。对PCR产物进行凝胶纯化，并与来自ErmBtdRAMl构建物的I型内含子W的PCR产物一起，作为使用外侧引物Thio-Fl和tdGpI-Rl的SOEingPCR的模板。从该PCR产物切下143bpSpeLW^I片段的A/启动子和部分W内含子。从pCR2.1::ErmBtdRAMl切下剩余W内含子和e/mSORF(7V^I/A^1片段)。在三向连接中将这些片段连接到经S/7el和A^rt线性化的pCR2.1::ErmBtdRAMlSE中，获得质粒pCR2.1::ErmBtdRAM2。如图14所示，将包含RAM的pCR2.1::ErmBtdRAM2的Mw7/厕w7片段与pMTL201acZTT的较大Mm〃Mm7片段连接，从而形成pMTL201acZTTErmBtdRAM2。如图14所示，将包含RAM的pMTL201acZTTErmBtdRAM2的万^G/Z^诏/片段亚克隆到经5^67/6^5/切割的？]^11^402713021丁￡111131(111^1中，从而产生pMTL007。pMTL007最初被命名为pMTL5402FlacZTTErmBtdRAM2，而有时被称为pMTL5402FlacZTTErmRAM2、pMTL5402FlacZTTRAM2或pMTL5402FlacZTTR2。一旦经过重新耙向，所述质粒即被命名为以"靶向区域"(TR)的标志为后缀的pMTL007(或pMTL5402FTTErmBtdRAM2、pMTL5402FTTErmBRAM2或pMTL5402FTTRAM2)。TR是位于重新耙向PCR所产生的序列中HindIII和BsrGI位点之间的整个区域。例如，一旦通过克隆加入适合TR片段(Hindm/BsrGI片段)，从而使所述质粒重新耙向艰难梭菌630的^oO4基因(sjw04ORF的178位)，所述质粒即被命名为pMTL5402FTTErmBtdRAM2::Cd誦spoOA-178aTR。实施例13:评价pMTL5402FlacZTT系统中ErmBMRAM2和ErmBWRAM3对产孢梭菌中MrfF的作用在产生能够赋予梭菌红霉素抗性的新型RAM后，构建了包含具有靶向部分的II型内含子的梭菌重新靶向核酸，经设计使其将内含子靶向到产孢梭菌的cc^y。构建负载RAM2或RAM3的两个质粒，并分别命名为pMTL5402FCs-codY隱417sTT::RAM2和pMTL5402FCs-codY陽417sTT::RAM3。除了II型内含子的重新靶向部分以及IBS序列经过设计以容许重新靶向产孢梭菌的c/F而不是大肠杆菌的lacZ之外，RAM2的形式与图10中说明的相同。将两个质粒分别接合到产孢梭菌中。通过PCR验证转移接合子，并都显示出对Eryu5的敏感性。随后使用IPTG诱导各个RAM的选定转移接合子，通过离心清洗除去诱导物，随后恢复3小时，再平铺到包含一定浓度范围的红霉素的琼脂板上。下表9显示了获得的克隆数。表9:重新靶向试验的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>这些数据证明了充分的诱导期的重要性，并且与RAM3相比，使用RAM2获得更高的效率。实施例14:其他突变体的产生我们选择靶向两个基因，这两个基因的失活将导致易于检测的表型。它们是p^F和^o似。前者的失活将导致尿嘧啶营养缺陷型，而后者的中断将导致无孢子株。将pMTL007重新耙向产孢梭菌的^oO4基因，并在IPTG诱导后，容易地获得了数百个EmK产孢梭菌克隆。从4个随机克隆提取DNA，并将其作为PCR的模板使用。在所有情况下，对RAM特异的引物均产生了与W内含子缺失后的大小一致的DNA片段(图15)。在使用pMTL007::Csp-^oft4-249s证明了RAM的明显功能性后，我们利用方法部分指出的方案，进一步在所有3种梭菌中生成两个基因(p^F和^o似)的突变体。En^克隆的PCR筛选(图15b、图15c)显示向目标染色体位点的极高频率的插入(表10)，这证明使用本方法能够容易地获得整合子。在分离后，通过甲砜氯霉素敏感表型筛选质粒丢失的单个整合子克隆，发现消除所述质粒的克隆占所有这些不能额外继代的生物的绝大部分。通过跨过内含子-外显子连接的测序确定了插入位点(表10)，并利用针对RAM的探针，通过Southern印记确认了单拷贝插入元件的存在(图15d、图15e和图15f)。利用IPTG诱导产孢梭菌表达pMTL007::Csp-s/7oft4-249s中的内含子使插入频率增加了100倍，这与来自pMTL5401Fc^的报告数据一致。表10:调控内含子在产孢梭菌中的表达对插入频率的影响质粒IPTGa插入频率b相对插入频率epMTL007::Csp匪^oO4-249s-^1.31士0,34x10-91pMTL007::Csp,oO4-249s+1.63±0.72xl(T7124pMTL007::Csp-^oO4-249sA/ac/-1.95±0.54xl(T61489M吏用lmMIPTG(+)或使用水代替IPTG(-)诱导内含子表达。b在恢复期后，将细胞平铺到添加或未添加红霉素的TYG环丝氨酸平板上。插入频率表示为EmRc.f.u./ml/总c.f.u./ml。e相对插入频率为相对于使用pMTL007::Csp-^oO4-249s并使用水代替IPTG的试验结果进行归一化后的插入频率。为了确定内含子的受控表达是否赋予任何超出组成型表达的优点，我们向pMTL007::Csp-spoOA-249s中的toc/基因引入移码突变，从而使/ac启动子去阻遏。观察到插入频率进一步增加了10倍以上(表IO)，说明内含子的受控表达没有赋予超出组成型表达的优点。我们使用pMTL007::Cac-^oO4-242a在丙酮丁醇梭菌中进行了等效试验，并观察到添加IPTG后整合频率没有变化(数据未显示)。与pMTL5401Fc^报告的数据一致，此生物中由启动子起始的内含子的基础表达显然足以获取易检测的整合频率。与pMTL5401F类似，pMTL007在艰难梭菌中很不稳定而不能支持其转移接合子生长在添加了抗生素的液体培养基中(Purdy"(2002)Mo/.M'craWo/.46:439-452)。因此，不能进行类似于产孢梭菌中进行的IPTG诱导试验。然而，在艰难梭菌和丙酮丁醇梭菌中，可以简单地将转移接合子克隆重新划线到包含红霉素且没有添加IPTG的培养基上，从而容易地获得EmK整合子。与预期一致，所有的^w04突变体均不能形成孢子(图16)。发现除非添加50pg/L尿嘧啶，否则所有的p,F突变体均不能在基本培养基上生长。我们使所有3中梭菌突变体在没有红霉素选择的液体丰富培养基中生长，随后将其平铺到带有或没有尿嘧啶的基本培养基上，由此尝试选择尿嘧啶原养型的回复突变体。在至少3个试验中，都未能在缺少尿嘧啶的培养基上检测到回复突变体。通过与添加了尿嘧啶的培养基上的细胞计数进行比较，估计每个细胞的回复突变频率为艰难梭菌小于9.36X10—9，丙酮丁醇梭菌小于9.60X10—7，产孢梭菌小于5.50X10—9。这些发现与文献中的数据吻合(Frazieretal(2003)^p//.Mz'cra&o/.69:1121-1128)，表明这些内含子的整合子极为稳定，这是非常理想的突变体特征。实施例15:评估ErmB』^AM2系统对其他耙标的作用如下所述，现已开发出用于在梭菌中进行重新靶向的标准程序。1.主要根据Sigma在TametronTM试剂盒中提供的方法，产生针对目的基因的内含子重新靶向序列Sigma网站「http:〃www.sisma-genosvs.com/targetron/1提{共了用于在目的基因序列中确定可能的内含子靶，并设计PCR引物的计算机算法。随后，根据SigmaTargetron的实验方案使用这些引物以及SigmaTargetron试剂盒提供的PCR试剂，产生353bpPCR产物，该PCR产物对应于内含子的一部分并且包括经修饰的IBS、EBSld和EBS2序列，这样可将内含子重新靶向到目的基因。将此PCR产物克隆到例如pCR2.1的恰当的克隆载体中，并确定其序列。也可以将其直接亚克隆到pMTL007中。2.主要根据Sigma在TametrcmTM试剂盒中提供的方法，对原型梭菌重新靶向质粒pMTL5402FlacZTTR2进行重新靶向如果将步骤1的PCR产物克隆到克隆载体中，则使用限制性酶///Mdin和SwGI酶切质粒，从而切下所需的重新耙向序列，并将其克隆到使用相同酶进行酶切的pMTL5402FlacZTTR2中。在任意一种情况下均通过限制性分析和/或测序确定所得构建物。3.将成功进行重新靶向的梭菌重新靶向质粒转入靶生物中可通过基于电转化或接合的标准DNA转移法将重组质粒引入到梭菌宿主中。这两种方法均在Davis,I,Carter,GYoung,MandMinton，NP(2005)"GeneCloninginClostridia"HandbookonClostridia(DurreP，ed)37-52页,CRCPress,BocaRaton,USA中列出。在我们的试验中，通过接合将质粒从大肠杆菌供体引入到艰难梭菌和产孢梭菌中。与此不同，通过转化将质粒引入到丙酮丁醇梭菌中。4.通过使用IPTG诱导转化子实现重新靶向核酸的表达以及随后的整合将单个转化子克隆接种到1.5ml添加了25(Vg/ml环丝氨酸和7.5pg/ml甲砜氯霉素(后者保证质粒的保持)的适合生长培养基中，并在37t:下厌氧温育过夜，从而使其生长至稳定期。将150pl此培养物接种到相同类型并包含相同添加物的1.5ml新鲜肉汤中，随后在37。C下厌氧温育。一旦能够在培养物中观察到生长物(通常在1小时后)，即使用ImMIPTG诱导培养物，并温育3小时。5.将细胞平铺到选择性固体培养基并温育后，使用恢复步骤检测并分离重新靶向核酸整合子在7000rpm离心1分钟，收集2ml经诱导的细胞，通过重悬于PBS中进行清洗，并按上述方式收集。将细胞团重新悬浮在等量(2ml)的不含添加物的适合生长培养基中，并在37'C下厌氧温育3小时。随后将培养物的系列稀释物平铺到添加l-10pg/ml红霉素的适合的固体生长培养基上，并在37。C下厌氧温育。在1848小时后，可从平板上挑出红霉素抗性克隆(重新靶向核酸整合子)，所需时间取决于使用的生物和红霉素的浓度。可任选地再将培养物的系列稀释物平铺到无添加的固体生长培养基，或添加15^g/ml甲砜氯霉素(替代红霉素)的固体生长培养基上，由此测定整合发生的频率。表11中简要说明了用于制备梭菌突变体的标准程序。表ll:梭菌突变体<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>如果重新靶向核酸已经插入到靶基因中，诊断PCR引物将会给出具有预期大小的产物。a在若干克隆群中证实了期望突变体的存在b筛选出若干个发生期望突变的单个克隆有时重新靶向是无效的。因此，推荐尝试不止一个靶向部分，从而破坏给定的任意基因。此外，在进行组合批次PCR筛选之前，可将菌落混合。例如，如果将10或100个菌落组合，并且产生了针对重新靶向突变体的期望大小的PCR产物，然后可对各个菌落进行单独筛选。实施例16:其他突变体的产生为了进一步确认本方法的效用，我们分别从3个种中选择了数个其他基因，并重复了所述突变产生的程序。表12列出了靶基因，表4或表13显示了根据针对pMTL007的II型内含子修饰的标准方法，用于产生PCR产物的寡核苷酸引物。在各个情况下均获得了期望的整合子。通过PCR筛选确认各个插入，并通过核苷酸测序确定插入位点。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>表13:寡核苷酸引物<image>imageseeoriginaldocumentpage54</image>实施例17:基于catP的RAM的构建构建了包含可选的经修饰的选择性标记基因的RAM(即c"W)，其可赋予氯霉素抗性或甲砜氯霉素抗性。使用弓I物连接子-catP-F5'-ATACTCAGGCCTCAATTAAC-CCAAGAGA-AGTTGGAACAG^'(SEQIDNo.130)和catP-MluI-Rl5，-ATACGC-GTTTAACTATTTATCAATTCCTGCAATTCGTTTACAAAACGGC-3'(SEQIDNo.131)，通过PCR从pMTL5402F质粒DNA模板扩增caf尸ORF,其中利用引物延伸在cWPORF的5'添加连接子和"内含子的一小部分。使用5"M和Mwl酶切PCR产物。从pCR2.1::ErmBtdRAM2切下Spel/StuI片段ErmBtdRAM2部分，其包含A/启动子、连接子和I型内含子W的大部分。将两个限制性片段一起连接到经和M"I线性化的pCR2.1::ErmBtdRAM2中，获得包含新型RAM元件RAM-Cl的质粒pCR2.1::RAM隱Cl。RAM-Cl中紧邻ca^ORF的序列与ErmBtdRAM2中紧邻ORF的序列相同，包含决/启动子、连接子和I型内含子^。完整RAM-Cl元件的侧翼为位点，从而有利于将其亚克隆到Ll丄trB内含子的Mwl位点，以作为RAM使用。可将RAM-Cl或其衍生物作为RAM元件在pMTL007的类似质粒中使用，以基于获得的甲砜氯霉素抗性或氯霉素抗性来筛选梭菌中的重新靶向事件。可以理解，在宿主中保持质粒所需的选择性标记赋予宿主的试剂抗性必须与RAM赋予宿主的抗性不同。因此，可将pMTL007的c"W选择性标记替换成在梭菌中有效的不同选择性标记(例如wm5)，从而对其进行修饰。这样修饰的质粒可用于重新靶向梭菌。如本文所述，可操作性地连接到选择性标记编码区的启动子必须能够引起单拷贝选择性标记基因编码的选择性标记的表达，其表达量足以使所述选择性标记改变梭菌细胞的表型，这样才能够使所述梭菌细胞与不含所述选择性标记的梭菌细胞区分开。如果RAM-C1元件中的A/启动子不能满足此规则，可使用本文公开的方法将其替换或修饰。类似地，如果I型内含子^的位置不恰当，使其不能在存在于RAM中时抑制选择性标记的表达，或从RAM中切除后容许选择性标记的表达，都可以对其位置进行变更。可使用Karberg等人(2001)研发的双质粒系统检测RAM的元件的功能(参见实施例5)。综上所述，RAM-Cl或其衍生物可用于在梭菌中产生重新靶向突变体。权利要求1.DNA分子，其包含经修饰的II型内含子，其不表达内含子编码的逆转录酶，但在相对于经修饰的II型内含子的反方向上包含经修饰的选择性标记基因，其中所述选择性标记基因包含编码选择性标记的编码区域和可操作性地连接到所述区域的启动子，其中所述启动子能够引起由单拷贝选择性标记基因编码的选择性标记的表达，其表达量足以使所述选择性标记改变梭菌纲细菌细胞的表型，从而使其能够区别于不含所述选择性标记基因的梭菌纲细菌细胞；和用于所述经修饰的II型内含子转录的启动子，所述启动子可操作性地与所述经修饰的II型内含子相连；和其中所述经修饰的选择性标记基因包含I型内含子，从而破坏所述选择性标记的表达，其中所述I型内含子位于相对于所述经修饰的II型内含子的正方向；和其中所述DNA分子容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去所述I型内含子，从而获得编码所述选择性标记的编码区域，并容许在梭菌纲细菌细胞中的DNA分子内位点插入所述RNA转录本(或其DNA拷贝)。2.如权利要求1所述的DNA分子，其中所述经修饰的II型内含子的侧翼有外显子，其中所述外显子容许对II型内含子的RNA转录本进行剪接。3.如权利要求1或2所述的DNA分子，其中所述经修饰的II型内含子包含靶向部分。4.如权利要求3所述的DNA分子，其中所述靶向部分容许将经修饰的II型内含子的RNA转录本插入到梭菌纲细菌细胞DNA分子内的位点。5.如权利要求4所述的DNA分子，其中所述位点是选定的位点。6.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其中所述DNA分子是质粒。7.如权利要求6所述的DNA分子，其中所述质粒是大肠杆菌-梭菌穿梭载体。8.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其还包含容许从大肠杆菌向梭菌纲细菌细胞进行接合转移的蛋白质的编码基因。9.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其中可操作性地与选择性标记的编码区相连的所述启动子是丙酮丁醇梭菌A/、內6或^fc基因的启动子，或产气荚膜梭菌/血或基因的启动子。10.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其中，与不含所述选择性标记的梭菌纲细菌细胞相比，所述选择性标记赋予表达所述选择性标记基因的梭菌纲细菌细胞生长优势。11.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其中所述选择性标记赋予梭菌纲细菌细胞红霉素抗性或氯霉素抗性。12.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其中所述I型内含子位于所述选择性标记编码区之内或选择性标记编码区的上游。13.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其中可操作性地与II型内含子相连的所述启动子是诱导型启动子。14.如权利要求13所述的DNA分子，其中所述诱导型启动子是IPTG诱导型启动子或木糖诱导型启动子。15.如前述任意一项权利要求所述的DNA分子，其还包含编码II型内含子编码的逆转录酶的开放读码框，其中所述开放读码框可操作地与启动子连接但不在经修饰的II型内含子之内。16.试剂盒，其包含权利要求114中任意一项所述的DNA分子以及能够表达II型内含子编码的逆转录酶的DNA分子。17.将核酸分子引入到梭菌纲细菌细胞DNA分子内的位点的方法，所述方法包括以下步骤(i)向梭菌纲细菌细胞提供权利要求114中任意一项所述的DNA分子以及能够表达II性内含子编码的逆转录酶的DNA分子；和(ii)培养所述细菌细胞，其培养条件容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去I型内含子，并容许将包含选择性标记基因(或其DNA拷贝)的所述RNA转录本插入到所述位点。18.如权利要求17所述的方法，其还包括在容许所述选择性标记表达的条件下培养所述梭菌纲细菌细胞。19.如权利要求18所述的方法，其还包括基于所述选择性标记赋予的变化表型筛选所述梭菌纲细菌细胞。20.如权利要求19所述的方法，其还包括分离源自权利要求17获得的细胞的单克隆细胞的步骤。21.如权利要求1720中任意一项所述的方法，其中所述能够表达II型内含子编码的逆转录酶的DNA分子与权利要求114中任意一项所述的DNA分子相同。22.如权利要求115中任意一项所述的DNA分子，或如权利要求1721中任意一项所述的方法，其中所述梭菌纲细菌细胞是梭菌属细菌细胞。23.如权利要求22所述的DNA分子，或如权利要求22所述的方法，其中所述属是梭菌属，所述细胞是热纤梭菌、丙酮丁醇梭菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、拜氏梭菌、破伤风梭菌、(^."//"/>^/附或腐败梭菌。24.如权利要求115、22或23中任意一项所述的DNA分子，或如权利要求1723中任意一项所述的方法，其中所述梭菌纲细菌细胞DNA分子内的位点位于基因之内或位于影响基因表达的DNA部分之内。25.如权利要求115或2224中任意一项所述的DNA分子，或如权利要求1724中任意一项所述的方法，其中所述位点位于细菌基因组之内。26.如权利要求17~24中任意一项所述的方法，其中向所述梭菌纲细菌细胞提供权利要求1~15中任意一项所述的DNA分子的方式包括将所述DNA分子转导或转移到所述梭菌纲细菌细胞内，或将所述DNA分子从供体细菌细胞接合转移到所述细菌细胞内。27.将核酸分子靶向到梭菌纲细菌细胞中DNA分子的选定位点的方法，所述方法包括以下步骤(i)向所述梭菌纲细菌细胞提供权利要求3所述的DNA分子以及能够表达II型内含子编码的逆转录酶的DNA分子；和(ii)培养所述细菌细胞，其培养条件容许从经修饰的II型内含子的RNA转录本中除去I型内含子，并将包含选择性标记基因(或其DNA拷贝)的所述RNA转录本插入到所述的选定位点。28.如权利要求27所述的方法，其中所述DNA分子的选定位点是基因或影响基因表达的DNA部分。29.突变的梭菌纲细菌细胞，其通过权利要求17~27中任意一项所述的方法获得。30.包含经修饰的红霉素抗性基因的DNA分子，其包含中断所述红霉素抗性基因表达的I型内含子。31.包含经修饰的氯霉素抗性基因的DNA分子，其包含中断所述氯霉素抗性基因表达的I型内含子。32.包含经修饰的四环素抗性基因的DNA分子，其包含中断所述四环素抗性基因表达的I型内含子。33.包含经修饰的壮观霉素抗性基因的DNA分子，其包含中断所述壮观霉素抗性基因表达的I型内含子。34.如权利要求3033中任意一项所述的DNA分子，其中所述DNA分子是质粒。35.宿主细胞，其包含权利要求30~34中任意一项所述的DNA分子。36.权利要求115或3034中任意一项所述的DNA分子在制备突变的梭菌纲细菌细胞中的用途。37.如本文所述的任意新型DNA分子。38.如本文所述的将核酸分子引入到梭菌纲细菌细胞中DNA分子内的任意新型方法。39.如本文所述的将核酸分子靶向到梭菌纲细菌细胞中DNA分子的选定位点的任意新型方法。全文摘要本发明公开了包含II型内含子的DNA分子，其中所述II型内含子不表达内含子编码的逆转录酶但包含经修饰的反向的选择性标记基因，其中所述标记基因包含正向的I型内含子，从而在梭菌纲细菌细胞中引起表达，并且其中所述DNA分子包含容许将所述II型内含子的RNA转录本插入到梭菌纲细菌细胞的基因组中的序列。本发明还提供了将核酸分子引入到梭菌纲细菌细胞中的DNA分子的位点的方法。所述DNA分子和方法可用于在梭菌中产生突变。文档编号C12N15/74GK101506367SQ200780031195公开日2009年8月12日申请日期2007年6月21日优先权日2006年6月21日发明者奈杰尔·彼得·明顿,约翰·蒂莫西·希普申请人:莫沃斯技术有限公司