专利名称：：用于免疫治疗的活化淋巴细胞的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备活化淋巴细胞的方法，更具体地涉及制备用作细胞免疫治疗剂的活化淋巴细胞的方法，当人体患有必需施予免疫细胞的疾病时，通过从人体外周血液中分离淋巴细胞，在体外大量增殖和活化分离出的淋巴细胞，并将该活化淋巴细胞施予淋巴细胞来源的人体；或通过冻存该活化淋巴细胞，并将冻存的该活化淋巴细胞施予淋巴细胞来源的人体。
背景技术：
：人体免疫细胞包括自然杀伤(NK)细胞和T细胞，它们能识别和消除转化的某些细胞，如癌细胞或感染病毒的细胞。因此，利用那些细胞的功能可以预防和治疗这些疾病。然而，对于癌症患者来说，免疫细胞难以表现足够的抗癌作用，因为各种抗癌疗法包括外科手术，抗癌药物治疗和放射治疗导致免疫系统减弱，从而削弱免疫细胞的功能或显著减少免疫细胞的数量。为此，如果将患者免疫细胞在体外大量增殖和激活，然后再施予该自体患者，有可能获得期望较高的抗癌效果。活化淋巴细胞是一种细胞免疫治疗产品，通过在体外大量增殖和激活人体血液免疫细胞，并将该活化免疫细胞施予该自体患者，用于治疗癌症。它是一种具有个体针对性的抗癌免疫治疗剂，通过激活自体患者的免疫细胞诱导体内免疫，如包括树突状细胞的抗癌免疫治疗剂。由于肿瘤抗原暴已知的，所以用细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特定地消除肿瘤细胞是可能的[Rosenbergetal.，1999]。但人们知道，各种癌中MHCI族的表达降低，并且由于这一机制，癌细胞可以避开CTL的免疫监视[Amiotetal.，1998]。另一方面，MHCI族-缺陷癌细胞对自然杀伤(NK)细胞高度敏感[Pawelecetal.，2004]。NK细胞不需要识别抗原就能消除癌细胞和感染病毒的细胞[Albertssonetal.，2003;Coluccietal.，2003;Smythetal.，2002]。NK细胞的活性通过激活信号和抑制信号之间的信号平衡来调节[Faragetal.，2003]。最为完好的激活配体是NKG2D配体。其中，MHCI族-相关A链和B链(MICA/B)受应激，如热休克，氧化应激和病毒性感染诱导，UL-16结合蛋白(ULBPs)的表达受病毒感染诱导[Vivieretal.，2002]。NKG2D配体的表达受应激诱导，这些配体在不同癌细胞系中表现出不同的表达形式[Watzletal.，2003]。NKG2D配体具有标记应激的细胞或转化的细胞的能力，意味着癌细胞对NK细胞的敏感性可通过调节激活配体的表达来控制。因为NKG2D配体能增强对NK细胞的敏感性，所以可以消除NKG2D配体高度表达的癌细胞，即使其MHCI族的表达是正常的[Rauletetal.,2003]。由此，如果NKG2D配体的表达增强，则NKG2D受体-表达细胞如NK、NKT、CD8+T和^T细胞的抗癌疗效可以进一步增强。在20世纪80年代初期，罗森伯格(Rosenberg)小组完成了黑色素瘤、肾细胞癌、淋巴瘤、肺癌和结肠癌方面的LAK细胞(淋巴因子-激活的杀伤细胞，用IL-2激活NK细胞)临床试验[Rosenbergetal.，1985]，但LAK细胞的临床应用受到限制，因为LAK细胞的抗癌细胞毒性相对较弱，并且难以大量获得这种细胞。为了克服这一限制，沃夫斯密特(Schmidt-Wolf)等开发了一项通过在抗CD-3抗体、IFN-y、IL-1和IL-2的存在下培养外周血单核细胞，制备大量高效毒性细胞的技术[Schmidt-Wolfetal.，1991]。培养的细胞称作"CIK(细胞因子诱导杀伤)细胞"，相比现有的LAK细胞，CIK细胞具有高细胞毒性和高增殖率。众所周知，该细胞组中表现毒性效应的细胞对CD56表面抗原呈阳性，其中CD3+CD56十细胞约为2030%，CD3-CD56+细胞(NK细胞表面抗原)所占比率很低(<10%)。然而，研究包括CIK细胞在内的细胞对肿瘤细胞的毒性显示CD3-CD56+细胞的杀伤能力高于CD3+CD56+细胞[Schmidt-Wolfetal.，1993;Luetal.，1994;Scheffoldetal.，1995]。因此，认为LAK细胞和CIK细胞中具有最高抗癌作用的细胞是NK细胞(CD3-CD56+)。同时，MSDilber等开发了通过在抗CD-3抗体和IL-2中培养外周血单核细胞，大量培养CD3-CD56+的技术[Carlensetal.，2001]。培养的细胞称作"CINK(细胞因子诱导自然杀伤)细胞"，比起现有的LAK细胞，该细胞具有高增殖率。然而，根据该方法，CD3-CD56+细胞仅可在补充了抗-CD3抗体和IL-2的CellGroSCGM培养基中大量培养。4另外，人们知道CD4+CD25+调节性T细胞在正常人体的外周血单核细胞(PBMCs)中以小于5%的比率存在，且在体外抑制T细胞的增殖[K.E.Earleetal.,2005]。此外，体外用IL-2培养的CIK细胞能诱导CD4+CD25+调节性T细胞的增殖，分泌大量IL-IO，由此抑制CTL的增殖，降低CTL的细胞毒性[JanSchmidtetal.，2004]。特别地，人们知道CD4+CD25+调节性T细胞减少CIK或NK细胞中表达的NKG2D受体的数量，并且由活化的CD4+CD25+调节性T细胞产生的TGF-P抑制NK细胞的细胞毒性[FrancoisGetal.，2005]。因此，在本发明中，从PBMC分化和增殖的自体活化淋巴细胞中，CD4+CD25+调节性丁细胞的比率显著降低至5%，因此改善了自体活化淋巴细胞在体内的功能。
发明内容因此，本发明为解决现有技术中存在的问题作了很多努力，结果发现在白细胞介素-2(IL-2)、y干扰素(IFN-y)和抗CD-3抗体的存在下，通过从人体外周血中分离培养淋巴细胞，可大量制备对肿瘤细胞和感染病毒的细胞具有很强杀伤力的€056+和NKG2D+细胞，从而完成本发明。因此，本发明的一个主要目的在于提供制备活化淋巴细胞的方法，其中在抗CD-3抗体、IL-2和IFN-y存在下，通过从人体外周血中分离培养淋巴细胞，可大量制备对肿瘤细胞和感染病毒的细胞具有很强杀伤力的CD56+和NKG2D+细胞。本发明的另一个目的在于提供一种细胞免疫治疗组合物，该组合物包含根据所述方法增殖的活化淋巴细胞作为活性成分。图1显示活化淋巴细胞在培养6天，10天，15天和21天的数量测量结果。图2显示用流式细胞仪对每一测试组中活化淋巴细胞的表面抗原CD3和CD56进行分析所获得的图表。图3显示用流式细胞仪对每一测试组中活化淋巴细胞的表面抗原NKG2D和CD56进行分析所获得的图表。图4显示用流式细胞仪对每一测试组中活化淋巴细胞的表面抗原CD16和CD56进行分析所获得的图表。图5显示冷冻活化淋巴细胞前后，分别用流式细胞仪对活化淋巴细胞的表面抗原CD3和CD56,表面抗原NKG2D和CD56以及表面抗原CD16和CD56进行分析所获得的图表。图6显示在辅以抗-CD3抗体和IL-2的介质中培养的，正常人体CIK(细胞因子诱导杀伤)细胞中的CD4-和CD25-阳性细胞。图7显示在培养的0天、14天和21天，用流式细胞仪对活化淋巴细胞的表面抗原CD4和CD25进行分析所获得的结果。最佳实施方式为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供制备活化淋巴细胞的方法，包括以下步骤(1)从外周血中采集和分离淋巴细胞；(2)在白细胞介素-2(IL-2)、7干扰素(IFN-力和抗-CD3抗体的存在下，在体外培养淋巴细胞，以制备活化淋巴细胞；(3)将该活化淋巴细胞冻存给定的一段时间；和(4)解冻和复苏冻存步骤的淋巴细胞。当需要长期储存步骤(1)和(2)制备的活化淋巴细胞时，使用步骤(3)和(4)。本发明方法中的步骤(1)是从外周血中采集和分离淋巴细胞的步骤，其中该淋巴细胞采集自患病或健康人体的外周血液。因为方便易行，优选从臂静脉采集血液，但只要其含有淋巴细胞任何位置都可能用到。步骤(1)采集的外周血中可加入肝素钠、乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸，这样就不会发生凝血。本发明的活化淋巴细胞可通过从采集的外周血中分离淋巴细胞，经体外培养增殖和激活该分离淋巴细胞而得到。本发明方法的步骤(2)是激活和增殖步骤(1)中分离的淋巴细胞的培养步骤。培养步骤(1)采集的淋巴细胞的方法优选但不限于在IL-2，IFN-y或抗-CD3抗体单独或组合存在下完成。在这种情况下，最优选在IL-2，IFN-y和抗-CD3抗体组合存在下培养该淋巴细胞，因为比起IL-2，IFN-y或抗-CD3抗体单独存在，这样能显示很强的抗癌作用。而且，通过使用合适的抗原诱导抗原特异性T淋巴细胞，然后在其中加入一种CD3抗体或各种促分裂素，也可获得抗原特异性活化淋巴细胞。至于抗原，有可能使用纯化抗原，来自癌细胞或病毒的提取物，癌细胞或病毒本身，或具有交叉反应的伪抗原。在这种情况下，任何材料都可使用，只要它具有增殖和激活淋巴细胞的功能。同6时，培养过程中也可使用IL-15代替所述IL-2。本发明步骤(2)中使用的IL-2和IFN-Y可在商业上获得，优选在培养基中以1-2000U/ml的浓度使用。IL-2禾卩IFN^还可以在普遍广泛使用的细胞培养基中溶解后使用，例如生理盐水、磷酸盐缓冲溶液、RPMI-1640、DMEM、IMDM、AIM-V(GIBGO，USA)、X-Vivo(Cambrex)、LGM、KBM-306(KohjinBio)、CellGro(CellGenix)等。IL-2和IFN-y—旦溶解，就需要在冷冻状态下储存，以防止其活性降低。同时，作为培养基，只要它适合培养淋巴细胞，可以没有特定限制地使用任何培养基，优选的例子包括RPMI-1640、DMEM、IMDM、AIM-V、X-Vivo、LGM、KBM和CellGro，尤优选无血清培养基，如AIM-V、CellGro、KGM和X-Vivo。步骤(2)中的培养基优选含有血清，因为含血清的培养基有很好的增殖作用。至于血清，不仅可用商业上获得的胎牛血清或正常人的血清，还可使用自体血清。还可能使用无血清培养基。淋巴细胞的培养可在通常细胞培养系统中进行，例如C02培养箱。细胞培养中C02的浓度为110%，优选37%;培养温度为3040°C，优选3538。C。虽然细胞培养的时间没有具体限制，但细胞培养优选进行约228天，因为这确保抗-CD3抗体的刺激信息传递到细胞。培养时间尤其优选38天，因为这使抗-CD3抗体的刺激信息稳定地传递到细胞，并且显示高的培养效率。更优选在培养过程中用显微镜观察细胞的状态，以便在添加适量培养基时测定细胞的数量。此外在细胞培养中，培养开始后的14天细胞不增殖，但之后可观察到细胞增殖，培养基从橙色变为黄色。在培养基中添加的额外培养基的量优选为该培养基量的0.15倍。同时，额外培养基的添加以17天，优选24天的间隔进行，以便防止培养基变质和IL-2活性降低。本发明方法步骤(2)中的细胞培养可以通过将单核细胞悬浮在包含IL-2和IFN-Y的培养基中开始，并在培养容器中加入抗-CD3抗体用于固定化(immobilization)。此外，如有必要，培养基中还添加各种细胞因子和促分裂素，淋巴细胞增殖和活化的效率将进一步增加。还有，用于刺激淋巴细胞的抗-CD3抗体可以是动物或细胞产生和纯化的抗体，或商业上获得的OKT-3抗体。除了这些抗体，可不加任何特定限制地使用任何抗体，只要它能刺激7淋巴细胞的增殖和活化。例如，还可使用抗-CD28抗体。本发明方法的步骤(3)是将该活化淋巴细胞冻存一给定时间的步骤。在该步骤中，要保存的淋巴细胞可以以一定浓度悬浮在细胞防腐液的中，该浓度根据其大小适当选择。在防腐液中悬浮和冻存该淋巴细胞所需要的密度为lxlOS细胞/毫升lxl(T细胞/毫升。在该步骤中细胞防腐液的用量并不重要，但鉴于方便，防腐液优选使用0.11000ml，更优选0.5100ml。本发明方法步骤(3)中使用的冻存液可以是商业上获得的细胞防腐液，也可以自己配制用于步骤(3)。该细胞防腐液可以在合适的缓冲溶液或培养基中含有血清、高分子物质如蛋白质或多糖，和二甲亚砜(以下称作"DMSO")，所有列出的物质都不是细胞保存所必需的。因此，用于保存细胞的防腐液不限于以上组分。淋巴细胞悬浮于合适的细胞防腐液并在低温下冻存。制备好的冻存液在使用前可存放于冰箱(4'C)。在本发明制备活化淋巴细胞的方法中，该活化淋巴细胞优选为0056+和NKG2D+细胞。本发明中，CD56+为杀伤细胞标记，NKG2dD+为淋巴细胞活化受体标记。图2的图表显示本发明实施例3的结果，其中x-轴是CD-3(T-淋巴细胞标记)标记的淋巴细胞，y-轴是CD56标记的淋巴细胞。每个图表分为四部分进行分析，四部分中的左上部分(区域Ol)显示CD-3阴性，CD-56阳性天然杀伤细胞(NK细胞)，右上部分(区域02)显示CD-3阳性和CD-56阳性淋巴细胞。这两部分中(01和02)的细胞为具有抗癌作用的淋巴细胞。在该分析结果中，根据本发明的实施方式，在IL-2，IFN-y和抗-CD3抗体组合存在下培养淋巴细胞时，杀伤细胞表面抗原CD56的表达率在所有试验组均高于60。/c)(Gl至G4)，且T淋巴细胞标记CD3阴性细胞的比率在所有试验组(Gl至G4)均高于50%。该结果表明本发明使用的AIM-V，CellGro，X-Vivo和KBM培养基都可用来大量培养具有很强抗癌作用的杀伤细胞。同时，图3显示NKG2D受体表达的分析结果。NKG2D受体是已知如NK，NKT，CD8T和YST细胞等参与激活淋巴细胞的激活受体之一。图3表中x-轴是NKG2D标记的淋巴细胞，y-轴是CD56标记的淋巴细胞。每个图表分为四部分进行分析，四部分中的左上部分(区域02)和右下部分(区域04)显示NKG2D阳性淋巴细胞。具体地，右上部分显示NKG2D和CD-56均为阳性的淋巴细胞。因此，根据本发明的实施方式，在IL-2，IFN-y和抗-CD3抗体组合存在下进行淋巴细胞的培养时，NKG2D阳性淋巴细胞的比率在所有试验组均高于90%(G1至G4),NKG2D在几乎所有的杀伤细胞中(CD-56阳性细胞)为阳性。从这些结果可以看出，根据本发明的制备方法培养的活化淋巴细胞显示高的抗肿瘤细胞或抗感染病毒细胞活性。在本发明用于制备活化淋巴细胞的方法中，该活化淋巴细胞除CD56+和NKG2D+外，优选进一步包括CD16+。本发明中，所述CD16+为FcyRHI标记。图4的图表显示本发明实施例3的结果，x-轴是CD16标记的淋巴细胞，y-轴是CD56标记的淋巴细胞。每个图表分为四部分进行分析，四部分中的右上部分(区域P2)显示对CD-16和CD-56均为阳性的淋巴细胞。己知CD-16表面抗原诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。因此，认为由于根据本发明实施方式制备的细胞中，表面抗原-表达细胞的比率在所有试验组均高于40%，则比起CD16表面抗原表达很少或不表达的CIK细胞，根据本发明制备的细胞将显示出强大的抗癌作用。本发明用于制备活化淋巴细胞的方法中，活化淋巴细胞中004+和〔025+的比率优选为36%，更优选小于5%。人们知道，癌症患者外周血中CD4-和CD25-阳性细胞比正常人高2.5倍[AnnaMariaWolfetal，2003]。也知道CD4-和CD25-阳性细胞可增加正常人外周血中培养的CIK(细胞因子诱导杀伤)细胞。即报道所说，即使是正常人的CIK细胞，在抗-CD3抗体(或OKT-3)和IL-2的存在下进行培养时，CD4-和CD25-阳性细胞的比率也会从培养前的0.5±0.07%增长到培养14天后的35.5±8.4%(见图6)[JanSchmitetal.，2004]。在本发明中，从癌症患者外周血中分离的淋巴细胞显示CD4-和CD25-阳性细胞的比率显示大于10y。，但当淋巴细胞在IFN-Y，抗-CD3抗体和IL-2存在下培养21天，该比率降低到小于5%的正常水平(见图7)。本发明制备活化淋巴细胞的方法中，抗-CD3抗体优选在使用之前固定于培养容器中。为应用于本发明，抗-CD3抗体优选包含于培养基中，但是考虑到淋巴细胞增殖效率和操作简便，更优选固定于培养容器中。用于固定抗体的培养容器包括玻璃、聚氨酯、聚烯烃或聚苯乙烯制成的容器。具体地，可以使用容易获得的塑料制成的细胞培养瓶，其大小可适当选定。抗体的固定可通过向培养容器中添加抗-CD3抗体的稀释液进行，以固定和稳定该抗体，比如在4-37t:下固定2-24小时。此外，为固定抗-CD3抗体，抗-CD3抗体在生理缓冲盐水中稀释，如浓度为0.1-3(Vg/ml的无菌磷酸盐缓冲液。抗体在固定后储存于冰箱(4°C)中备用。为用于本发明，将液体成分从储存的抗体稀释液中除去，残留抗体如有必要可用生理缓冲液如磷酸盐缓冲液于室温下洗涤。图1显示在培养6天，IO天，15天，21天时活化淋巴细胞数量的测定结果。在图1中，淋巴细胞于AIM-V培养基中培养G1和G5，CeIIGro培养基中培养G2和G6，X-Vivo培养基中培养G3和G7，KBM培养基中培养G4和G8。培养21天时，活化淋巴细胞数量的测定结果显示，当淋巴细胞在含有抗-CD3抗体(Gl-G4)的培养基中培养时，与培养早期的淋巴细胞数量相比，活化淋巴细胞的数量平均增加168倍。当淋巴细胞在抗-CD3抗体固定化瓶(G5G8)中培养时，与培养早期的淋巴细胞数量相比，活化淋巴细胞的数量平均增加338倍。从上述结果可见，当淋巴细胞在抗-CD3抗体固定化瓶中培养时，细胞增殖率比在含抗-CD3抗体的基质AIM-V的培养情况高约两倍，有可能在CellGro、X-Vivo和KBM培养基中大量培养活化淋巴细胞。此外，在用抗-CD3抗体固定化瓶培养和用含抗-CD3抗体的培养基培养之间，比较细胞的增殖和激活。结果是，当细胞在抗-CD3抗体固定化瓶进行培养时，细胞的增值率比其它情况高约两倍。同样，在培养21天时对表面抗原CD3、CD16、CD56和NKG2D分析显示，根据培养条件来看，它们并无差升。在本发明制备活化淋巴细胞的方法中，细胞的冻存优选使用冷冻管或袋，细胞密度为0.510.0x107细胞/冷冻管或0.0510.0x101G细胞/冷冻袋。保存本发明的冷冻细胞的冷冻容器可以是商业获得的冷冻细胞的冷冻管或袋，大小可根据需要适当选择。冷冻细胞的数目优选0.510.0x107细胞/冷冻管或袋，冷冻管的数目为21000个，取决于血液采集量。在冷冻袋实例中，冷冻细胞的数目优选0.0510.0x101()细胞/冷冻袋，冷冻袋的数目为1IO个，取决于血液采集量。此外，为用于本发明，被冻存的细胞解冻，溶解10和复苏，用于病人。在特殊情况下，细胞也可在解冻和溶解后立即给予。本发明用于制备活化淋巴细胞的方法中，细胞最多保存15年，可在适宜时间点解冻、溶解和复苏，如有必要，还可以长时间冻存。冻存细胞可根据本领域技术人员熟知的任意细胞冻存方法进行储存，但是当含有细胞的冷冻管或袋使用可控速率冷冻系统以-1匸/min的速率冷却至-70-90°c，然后转移储存于氮气罐中时，细胞可储存15年或更久。本发明的冻存可以使用冷冻箱、超低温冷冻箱或氮气罐，但考虑到淋巴细胞的稳定性和增殖效率，优选使用可控速率冷冻系统。至于可控速率冷冻系统，可使用商业上可获得的系统，也可使用由用户改进的系统。此外，冷冻的细胞在可控速率冷冻系统中储存030天，优选07天。这里所用的术语"0天"意指在可控速率冷冻系统中储存期间为124小时。这里所用术语"期间"指恰好在活化淋巴细胞转移至有储存细胞能力的氮气罐中进行长期保存之前的初始冷冻期。将细胞由可控速率冷却系统转移至氮气罐中可用任何商业可得的物件进行，该物件可以进入氮气罐，包括罐或冷冻管箱。根据本发明的另一方面，提供了一种用于培养活化淋巴细胞的培养基组合物。该组合物包含抗-CD3抗体，白细胞介素-2(IL-2)和y干扰素(IFN-y)。培养CD3-CD56+细胞的现有技术可以仅在添加抗-CD3抗体和IL-2的CellGroSCGM培养基中进行，但在本发明中，在IL-2，抗-CD3抗体禾MFN-y同时存在下，大量培养CD3-CD56+细胞不仅可在CellGroSCGM培养基中进行，而且可在AIM-V，CellGroDC，KBM-306和X-Vivo培养基中进行。根据本发明的另一方面，提供了一种细胞免疫治疗组合物，该组合物包含根据本发明的制备方法增殖的活化淋巴细胞作为活性成分。这里，细胞免疫治疗剂是一种通过体外大量增殖和激活人体血液免疫细胞，并将该活化细胞施予自体患者来治疗癌症的抗癌免疫治疗剂。此外，该治疗剂是一种具有个体针对性的抗癌治疗剂，通过激活患者自体免疫细胞来诱导体内免疫，如含有树突细胞的抗癌免疫治疗剂。本发明中，当不仅来自正常人，也可以来自晚期癌症患者的外周血淋巴细胞在抗-CD3抗体、IFN-y和IL-2存在下进行培养时，具有基本相同活性的活化淋巴细胞可以大量增殖。此外，当根据本发明的制备方法获得的活化淋巴细胞冻存很长一段时间后，解冻和复苏时，这些细胞的生存能力和活性得到保持。因此，当淋巴细胞来源的人体患有需要施予该细胞的疾病时，根据本发明的活化淋巴细胞可用作细胞免疫治疗剂，通过从患者或健康人的外周血中分离淋巴细胞，体外增殖和活化该分离的淋巴细胞，然后将该活化淋巴细胞施予自体患者，或者通过冻存活化淋巴细胞，冻存的细胞解冻和复苏后施予自体患者。本发明的细胞免疫治疗组合物可以本领域已知的普通配方例如注射液的形式制备，也可外科手术般地直接植入癌症部位或在静脉给药后转移到癌症部位。根据本发明的组合物的剂量可以不同，取决于疾病类型，给药途径，患者年龄和性别以及疾病的严重程度，但本发明的组合物优选给药剂量为成人lxl071011细胞。根据本发明，通过在抗-CD3抗体、IFN-y和IL-2存在下培养人外周血淋巴细胞，可以大量制备高效毒性细胞。根据本发明的制备方法增殖的活化淋巴细胞包括003-0056+(天然杀伤细胞标记)细胞和CD3+CD56+细胞，且可以大量培养。CD3-CD56+细胞是LAK细胞的主要成分，CD3+CD56+细胞是CIK细胞的主要成分。因此，比起单独使用LAK细胞和CIK细胞，根据本发明的淋巴细胞可显示出明显较高的抗癌作用。实施例参考以下实施例，对本发明作进一步详细描述。然而，应理解的是这些实施例旨在说明本发明，不应解释为限制本发明的范围。实施例l:淋巴细胞的血液采集和分离无菌状态下从人体静脉采集10100ml外周血。至于血液采集容器，可使用含抗凝血剂如肝素或EDTA的血液采集管或袋。然后，将血液注入50ml离心管中，与等量的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)混合均匀。50ml离心管中加入Histopaque-1077溶液(Sigma)，使Histopaque-1077溶液与PBS稀释的血液比率为h21:4。然后，将PBS稀释的血液缓慢加入到离心管中，使液面不分散。然后将混合物于室温、转速400Xg条件下离心分离，分离出淋巴细胞部分。然后将该部分用适量的磷酸盐缓冲生理盐水洗涤3次。最后离心洗涤之后，除去上清液，淋巴细胞沉淀均匀悬浮于磷酸盐缓冲生理盐水中，用台盼蓝溶液测定淋巴细胞的数量。结果显示细胞总数为2.0X1(^2.0X108。实施例2:抗-CD3抗体固定化瓶的制备将抗体(Orthodone0KT3注射液，Ortho生物技术制造)加到PBS中制备得到浓度为5吗/m的10ml抗-CD3抗体溶液，将抗体溶液加入到培养瓶中，该培养瓶底部表面积为225cm2，可使溶液在底面均匀分布。次日，用真空泵(suctionpump)吸取瓶中的抗体溶液，用PBS洗涤三次，由此制得抗-CD3抗体固定化瓶。实施例3:活化淋巴细胞的培养本发明中，在两种不同的培养条件下比较活化淋巴细胞增殖率和激活。为此，将淋巴细胞悬浮液加入至50ml各种适宜培养基(Gl:AIM-V(GIBGO,USA);G2:CeIIGro(CeIIGenix);G3:KBM(KohjinBio);G4:X画Vivo(Cambrex))中混合均匀，每种培养基包含1000U/mlIFN-y(Leucogen,LGLifeSciences)和15%的人血清。然后，每种培养基在37。C和5。/。C02条件下，于细胞培养瓶中进行培养。培养24小时后，采集每一瓶中的培养基，并转移至新的225-cn^的T-瓶中，并向各瓶中加入500U/mlIL-2(Proleukin,CHIRON公司)禾口50ng/ml抗CD-30抗体(Orthoclone，Ortho生物技术公司)。同时，在用实施例2制备的抗^03抗体固定化瓶进行培养和用含有抗-CD3抗体的培养基进行培养的情况之间，比较细胞的增殖率和激活。5天后，采集各瓶中的培养基，并转移至225cm2T-瓶中。然后，在各瓶中加入50ml含IL-2的培养基(以下，指"培养基")，并于37'C，5%(302存在下进行培养。4天后，在各瓶中加入100ml培养基，于37"C，5%032存在下进行培养。在此培养期间，每隔23天加入500U/mlIL-2。在培养的1415天，增加瓶的数目，以便防止活化淋巴细胞拥挤，细胞在37"，5%0)2存在下培养21天，得到5.0x1085.0X1(T活化淋巴细胞。图24显示在培养的21天，用流式细胞仪分析活化淋巴细胞中的表面抗原所得的结果。具体地，图2显示表面抗原CD3和CD56的分析结果，图3显示表面抗原NKG2D和CD56的分析结果，图4显示表面抗原CD16和CD56的分析结果。图24中，在培养基中培养淋巴细胞，G1为AIM-V培养基，G2为GellGro培养基，G3为Vivo培养基，G4为KBM培养基。此外，用抗CD-3抗体固定化瓶分析培养21天的每一测试组中活化淋巴细胞的表面抗原CD3和CD56，表面抗原NKG2D和CD56，以及表面抗原CD16和CD56。结果是，各表面抗原的表达都几乎类似于含有抗-CD3抗体培养基中完成的淋巴细胞的培养情况。根据本发明的制备方法，在制备活化淋巴细胞的过程中，即使当在抗-CD3抗体、IL-2和IFN-Y存在下培养冻存的外周血淋巴细胞时，淋巴细胞的增殖和活化也能很好地进行。实施例4:活化淋巴细胞中免疫抑制性丁细胞€04+/€025+的比率本发明中，004+(025+细胞为免疫抑制性丁细胞，导致免疫耐受。用流式细胞仪在培养过程的不同时间点对其表达进行分析。图7显示了在培养0天，14天和21天用流式细胞仪分析活化淋巴细胞中的表面抗原CD4和CD25所得的结果。如图7所见，CD4和CD25的表达水平随培养时间推移而开始降低，在培养21天后降低至正常水平(小于5%)。实施例5:活化淋巴细胞的冻存采集和离心步骤3所得的每一测试组中培养21天的活化淋巴细胞，然后除去各培养基，得到活化淋巴细胞沉淀。活化淋巴细胞沉淀与细胞保存液(培养基199'含715o/。画SO，0.110%五-淀粉(penta-starch)，O.卜腦肝磷脂以及120%白蛋白)充分混合，根据培养条件将1.0ml淋巴细胞溶液分配至10个细胞保存管(Coming)中。然后用可控速率冷冻系统以-rC/min的速率将该细胞保存管冷却至-9(TC，转移并储存在氮气罐中。实施例6:冻存的活化淋巴细胞的解冻和分析储存60天后，从步骤(4)中冻存的管的每一测试组中取出3支管，在恒温水浴中解冻14分钟，用培养基洗涤3次除去细胞保存液，并悬浮于培养基中。然后，用台盼蓝溶液测定细胞的活性，测定结果显示细胞存活率为7080%范围内，取决于培养条件(见表l)。同时，上述的不同条件下培养的各种活化淋巴细胞悬浮液在T-75cn^瓶中于37。C、5%002存在下培养2-3天，再测定活化淋巴细胞的存活率，测定结果显示细胞存活率高于95%。此外，对淋巴细胞中表面抗原CD3，CD16，CD56和NKG2D的分析结果显示，淋巴细胞中各表面抗原的比率在淋巴细胞冻存前后几乎相同。从该结果可看出，活化淋巴细胞的长期冻存对活化淋巴细胞的活性无明显影响(见图5)。表h细胞冻存前后，不同测试组的细胞存活率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>工业应用性为了克服现有方法中制备活化淋巴细胞的缺陷，本发明提供一种制备方法，通过培养从人外周血分离的淋巴细胞，在抗CD-3抗体，IL-2和IFN-Y存在下，大量培养对肿瘤细胞和感染病毒的细胞具有很强杀伤能力的CD56+和NKG2D+细胞。这样，根据本发明的方法增殖和激活的淋巴细胞可用作细胞免疫治疗剂，大大增强抗癌作用。此外，根据本发明，通过增殖和激活健康人的外周血活淋巴细胞所得的活化淋巴细胞可以冷冻和长期保存，一段时间后，当活化淋巴细胞来源的人体患有需要施予免疫细胞的疾病时，保存的活化淋巴细胞就可作为细胞免疫治疗剂，用以治疗该疾病。权利要求1.一种制备活化淋巴细胞的方法，包括以下步骤从外周血中采集和分离淋巴细胞；在白细胞介素-2，γ-干扰素和抗CD-3抗体存在下，体外培养该淋巴细胞，制备活化淋巴细胞；将该活化淋巴细胞冻存一给定时间；和解冻和复苏冻存步骤的淋巴细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中该活化淋巴细胞为CD56+和NKG2D+。3.根据权利要求2所述的方法，其中该活化淋巴细胞除CD56+和NKG2D+外，进一步包括CD16+。4.根据权利要求1所述的方法，其中该活化细胞中CD4+禾qCD25+比率为36%。5.根据权利要求1所述的方法，其中将抗CD-3抗体在使用前固定于培养容器中。6.根据权利要求1所述的方法，其中冻存用冷冻管或冷冻袋进行，细胞密度为0.510.0x107细胞/冷冻管或0.0510.0x101()细胞/冷冻袋。7.用于培养活化淋巴细胞的培养基组合物，该组合物包括抗-CD3抗体，白细胞介素-2和y干扰素。8.—种细胞免疫治疗组合物，包括以权利要求l所述的制备方法增殖的活化淋巴细胞作为活性成分。全文摘要本发明揭示了一种制备活化淋巴细胞的方法，包括从外周血中分离淋巴细胞，体外增殖和活化分离的淋巴细胞。根据所揭示的方法，通过在抗-CD3抗体，IFN-γ和IL-2存在下培养人外周血淋巴细胞，可以大量制备高效毒性细胞。根据所揭示的制备方法增殖的活化淋巴细胞包括CD3-CD56+(天然杀伤细胞标记)细胞和CD3+CD56+细胞，它们可以大量培养。CD3-CD56+细胞是LAK细胞的主要成分，CD3+CD56+细胞是CIK细胞的主要成分。因此，比起单独使用LAK细胞和CIK细胞，本发明的淋巴细胞可显示出明显较高的抗癌作用。文档编号C12N5/02GK101506356SQ200780031143公开日2009年8月12日申请日期2007年4月18日优先权日2006年8月23日发明者姜治德,孙哲勋,孙永玉,安庆出,崔成僖,张政洙,朴恩卿,朴淳元,朴秞秀,李炅奎,李白天,潘贞花,金柱寅,金源硕申请人:比内克斯有限公司