专利名称：针对肿瘤基质抗原fap的dna组合物及其使用方法
技术领域：
本发明涉及脱氧核糖核酸(DNA)组合物，其编码有效刺激免疫应 答对抗肿瘤中的基质成纤维细胞的合适分子。更详细地讲，本发明涉 及DNA组合物，其编码称为成纤维细胞激活蛋白(FAP)的基质抗原。 本发明还涉及以下的方法使用该DNA组合物以抑制肿瘤生长和肿 瘤转移，并以增加化疗药物的细胞吸收。
背景技术：
逐渐变得清晰的是，肿瘤抗原是用于癌症治疗的难以捉摸的靶 标。这可通过对肿瘤细胞唯一的各种特征来解释，这些特征包括它们 的抗原的突变和由于MHC-抗原表达的下调的不足够的抗原呈递。此 外，细胞凋亡信号途径的缺陷、以及细胞凋亡抑制剂例如存活蛋白、 XIAP或bcl-2家族的抗细胞凋亡成员的增量调节不仅对T细胞介导的 杀伤赋予抗性，而且也对化疗药物的凋亡诱导效应赋予抗性。
人们逐渐认识到基质区室(stromal compartment)在肿瘤发生和肿 瘤侵入中起决定性的作用。已经显示基质细胞刺激正常上皮细胞的转型，互换生长因子、细胞因子和化学引诱物以激活邻近的细胞外基质和诱导赘生细胞的选择和扩张。在一项研究中，将肿瘤细胞作为混悬液注射进小鼠中据报道为不致瘤的，但注射包含其基质的实体瘤碎片
据报道却引起肿瘤生长(见Singh等，J. 1992年；175:
139-146)。激活的胞外基质显然赋予由pi整联蛋白介导的化学抗性，卩l整联蛋白附着于纤连蛋白，引起pi整联蛋白刺激性酪氨酸激酶的激活，从而抑制化学疗法诱导的细胞凋亡。该现象已经在多柔比星敏感性骨髓瘤细胞中报道，该骨髓瘤细胞在附着纤连蛋白之后发展抗性。最近的报道表明，可通过肿瘤基质成纤维细胞调控或通过分配肿瘤基质网络实现肿瘤排斥。另外，由于与肿瘤相关的巨噬细胞和成纤维细胞具有合成如VEGF、 TGF-pi和IL-10的蛋白质的能力，因此它们据报道促进局部免疫抑制环境。VEGF起树突细胞成熟的抑制因子的作用，因此导致耐受T细胞。VEGF也为涉及肿瘤-血管发生的主要因子。VEGF的激活引起存活蛋白和肺瘤-内皮细胞中的许多其它的凋亡抑制蛋白的增量调节，保护它们免受化学疗法的凋亡效应。相反，TGF-pi的抑制可引起肿瘤根除和对抗转移的保护作用。IL-10抑制树突细胞的成熟，因此抑制由Thl细胞介导的细胞介导性抗肿瘤应答。该效应使树突细胞向基本无效的体液免疫反应转变。
成纤维细胞为分泌富含胶原和其它大分子的细胞外基质的结締組织细胞。肿瘤-基质(即肿瘤支持组织)中的成纤维细胞合成成纤维细胞激活蛋白(FAP)，具有丝氨酸蛋白酶功能的II型跨膜蛋白质。FAP在超过90%的与结肠癌、乳癌和肺癌有关的基质成纤维细胞中选择性地过量表达。在伤口愈合期间和在一些胎儿间充组织中也可观察到FAP的短暂过量表达。另外，据报道该酶切割明胶和I型胶原，已经牵涉进细胞外基质重建中。椐报道FAP的过量表达引起肿瘤生长的促进和增加转移的可能性，而用抗FAP抗体治疗抑制肿瘤生长。此外，主要由成纤维细胞产生的I型胶原的肿瘤-基质表达，相反地与包括化疗药物在内的许多化合物的肿瘤内吸收有关，由此维持基质区室与化学疗法抗性的相关性。
已经使用疫苗以通过非常有限地给予预防剂提供对抗许多病症的长期保护，所述预防剂刺激生物体的免疫系统以在病原体可增殖和
引起病理效应之前破坏疾病的病原体。在Bernard R. Glick和Jack J.Pasternak ， M /ecw/ar历o阮Awo/ogy, WA7一/es am/ /i/7/ /z.ca"0朋o//^cow&'"a"f"A^，第二版，ASM Press第253-276页(1998)中描述了疫苗和接种疫苗的许多方法。
接种疫苗为诱导身体自身的免疫系统以在感染介质(infectiousagent)形成病理反应之前寻找并破坏感染介质的方法。 一般而言，疫苗为活的但减毒的感染介质(病毒或细菌)，或该感染介质的灭活形式。由活细菌或病毒组成的疫苗必须为非致病性的。 一般而言，通过物理或化学处理将细菌或病毒的培养物减毒(减弱)。即使该感染介质为无毒的，但它仍然可在用该疫苗治疗的受试者中刺激免疫应答。
由抗原刺激免疫应答，该抗原可为特异性的大分子或感染介质。这些抗原一般为蛋白质、多糖、脂类、或糖脂，它们被名为B细胞和T细胞的淋巴细胞认为是"外来的"。将两种类型的淋巴细胞暴露至抗原，刺激快速的细胞分裂和分化反应，引起被暴露的淋巴细胞克隆形成。B细胞产生浆细胞，浆细胞继而产生称为抗体(Ab)的蛋白质，这些蛋白质选择性地结合在感染介质上存在的抗原，从而中和或灭活病原体(体液免疫)。有时，B细胞应答需要CD4辅助T细胞的协助。
响应抗原暴露而形成的特异性的T细胞克隆为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该细胞能够结合和消除存在抗原的病原体和組织(细胞介导的免疫或细胞免疫)。有时，抗原呈递细胞(APC)如树突细胞会通过胞吞作用包裹病原体或其它外来细胞。然后APC加工来自那些细胞的抗原，并将这些抗原以组织相容性分子肽复合体的形式呈递到CTL上的T细胞受体(TCR),从而刺激免疫应答。
7以特异性抗体的形成为特征的体液免疫通常对抗急性细菌感染和来自病毒的重复感染最有效，而细胞介导的免疫对抗病毒感染、慢性胞内细菌感染、和真菌感染最有效。也已知细胞免疫防止某些癌症和引起器官移植的排斥。
在很长的时期内，得自先前感染的抗原的抗体在血液中保持为可
检测的，因此提供测定先前暴露于(exposureto)病原体的方法。当再暴露于相同的病原体时，免疫系统通过在病原体可增殖和产生致病性反应之前消除病原体而有效地防止再感染。
l鴻
抗原的非致病介质产生。按该方式，受试者可受到对抗随后暴露于病原体的保护作用，而不需要先前抗击过感染。
然而，并非所有的感染介质都可容易地如形成疫苗所需要地培养和灭活。现代的重组DNA技术已经允许设计新疫苗以设法克服该限制。可产生缺少致病基因的感染介质，因此允许活的、无毒形式的生物体用作疫苗。也可能工程改造相对的非病原生物如E. coli以呈递致病性载体的细胞表面抗原。经接种该转化载体的受试者的免疫系统受"欺骗"而形成针对该病原体的抗体。可对病原体的抗原蛋白质进行工程改造并使之在非致病性物种中表达，该抗原蛋白质可经分离和纯化以生产"亚单位疫苗"。亚单位疫苗具有稳定、安全和化学上明确定义的优点；然而，它们的生产成本太高。
近年来出现制备疫苗的新方法，广泛地称为基因免疫。在该方法中，编码病原体抗原的核酸(多核苷酸)可经操作插入接受免疫的受试者细胞中。受处理的细胞，优选抗原呈递细胞(APC)如树突细胞经转化，产生病原体的抗原蛋白质。然后这些在体内产生的抗原触发所需的宿主免疫应答。在这样的基因疫苗中使用的遗传物质可为DNA构建体或RNA构建体。通常，编码抗原的多核苷酸与其它促进多核苷酸序列联合导入以增强基因的插入、复制、或表达。可通过许多递送体系将编码抗原基因的DNA疫苗导入受试者的
宿主细胞。这些递送体系包括原核生物递送体系和病毒递送体系。例如， 一种方法为使用病毒载体，如掺有新型遗传物质的牛痘病毒，以接种宿主细胞。或者，该遗传物质可掺入质粒载体或可作为"棵"多核
苷酸，即简单地作为纯化的DNA直接递送至宿主细胞。另外，DNA可稳定地转染进减毒的细菌如鼠伤寒沙门氏菌(ypA/wwWwwJ 。当用经转化的沙门氏菌(5Wmo"e〃a) 口服接种病人时，细菌被运输至肠(即次级淋巴组织)中的淋巴集结，然后刺激免疫应答。
如遗传性疾病和癌症。通常基因癌症疫苗导入APC编码抗原的基因，经如此转化的APC产生特定类型胂瘤细胞的抗原。因此，对抗许多癌症类型的有效的通用疫苗必然需要许多用于欲免疫对抗的每种类型癌细胞的单一疫苗。
持续需要的是用于免疫对抗各种类型癌症的广泛有效的DNA组合物，例如疫苗。本发明满足该需要。
发明概述
有效抑制胂瘤生长和肺瘤转移的DNA组合物包含以下的DNA构建体编码可在受试者的免疫细胞中表达的成纤维细胞激活蛋白(FAP)的至少一个表位的DNA构建体，该受试者已经被给予DNA构建体。该DNA构建体被掺入药学上可接受的载体。该组合物可编码FAP的单个表位、包含两个或多个FAP表位的多肽、整个FAP蛋白质、或其将刺激对抗肿瘤基质细胞所需的免疫应答的任何部分。优选地，该DNA构建体编码具有由SEQ ID NO: 2组成的氨基酸残基序列的人FAP、或与SEQ ID NO: 2具有至少80%相似性并包括至少一个FAP表位的蛋白质。
该DNA构建体可为棵DNA构建体，优选为质粒的形式。如有需要，可将这样的棵DNA构建体结合脂质体递送栽体、聚合物递送载体、电穿孔、基因枪等。在一些优选的实施方案中，将该DNA构建体掺入减毒的病毒载体或减毒的细菌性载体中。
在优选的实施方案中，该DNA构建体被掺入减毒的细菌性载体，例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌(^Sa/wo"e〃a 0^A/wwhwm)，最优选鼠伤寒沙门氏菌(5Wwo"e〃a (v/ /^wwnYw^的双重减毒的(^ra/r, c/aw》菌才朱o
任选该DNA组合物也可包含编码免疫效应器蛋白例如细胞因子的DNA构建体。优选的细胞因子包括CCL21、 IL-2、和CD40LT。
本发明的DNA组合物可作为靶向肿瘤基质成纤维细胞抗原FAP的疫苗，该肿瘤基质成纤维细胞抗原FAP是作为T细胞介导的癌症免疫疗法的靶标。基质成纤维细胞为在支持肿瘤生长的肿瘤环境中存在的非转化细胞。对于指向对抗被肿瘤细胞单一表达的抗原的疗法，与靶向仅由胂瘤细胞表达的抗原的疗法相比，靶向由基质成纤维细胞表达的FAP的方法具有几个优点。首先，基质成纤维细胞在遗传上比经常突变的异型肿瘤细胞群更加稳定。因此，靶抗原的表达保持更加稳定，充当用于免疫疗法的更可靠的靶标。第二，从基质成纤维细胞到T细胞受体复合物的抗原呈递不会如在肿瘤细胞中经常发生的被减量调节的MHC-抗原表达削弱。第三，由于在凋亡信号途径中的缺陷、抗凋亡蛋白的增量调节、或对CTL的免疫抑制效应，肿瘤细胞往往曰渐变得对T细胞介导的杀伤具有抗性。另外，与涉及只被特定肿瘤类型表达的抗原的疗法相反，对在超过90。/。的结肠癌、乳癌和肺癌的基质区室中特异性过量表达的FAP进行定靶，允许治疗组合物治疗许多不同的恶性肿瘤。
在一个优选的实施方案中，通过将作为口服DNA组合物的FAP自身抗原cDNA与减毒的细菌性递送载体(例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌林)递送到周围淋巴器官即小肠的淋巴集结中的抗原呈递细胞，本发明的DNA组合物打破外周T细胞对FAP自身抗原的耐受。在预防性方法中，通过用本发明的DNA组合物接种疫苗诱导的T细胞介导的抗肿瘤免疫应答在两个不同的鼠类肿瘤模型(即多重耐药的CT26
10结肠癌和多重耐药的D2F2乳癌)中抑制胂瘤生长。本DNA组合物还显著地抑制CT26结肠癌治疗模型中已确立的肺转移的扩散。
优选的DNA组合物包含减毒的沙门氏菌(5Wwo"e/W性载体，该载体为名为RE 88的鼠伤寒沙门氏菌f^ 0^/^7m/n'ww^)双重减毒菌抹，包括G 麵—和爿rc^突变，得自Remedyne Corporation (Santa Barbara,CA)。减毒的沙门氏菌^S"fl/wo"e〃fl)性载体包括编码可在免疫细胞中表达的FAP的至少一个表位的DNA。细菌本身不表达FAP，而是递送FAP DNA至免疫细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)，免疫细胞随后表达FAP。这样的组合物可延长抗肿瘤效果达10个月，也实现鼠类模型中的T细胞、NK细胞和DC活化标记的显著的增量调节。此外，体内T细胞去除实验表明仅牵涉到CD8+T细胞而不牵涉到CD4+T细胞。由CD8+ T细胞介导的体外细胞毒性效应特异性地把向过量表达FAP抗原的靶细胞。例如，在概念证实实验中，来自用本发明组合物接种的小鼠的CD8+ T细胞诱导体外细胞毒素溶解经工程改造以过量表达FAP的肿瘤细胞，这表明对FAP的特异性免疫应答。令人意想不到的是，即使还可发现FAP在伤口愈合期间短暂地过量表达，但是没有观察到由接种本发明的DNA组合物引起的伤口愈合损伤。
本发明的DNA組合物还可掺入编码作为该组合物佐剂的免疫效应分子的DNA构建体。这样的免疫效应分子包括例如IL-2, T细胞增殖的诱导物；CCL21，化学诱导成熟树突细胞和幼稚T细胞的趋化因子；和CD40LT,已知的树突细胞成熟的诱导物。优选所述编码免疫效应蛋白的核酸被掺入质粒。FAP和免疫效应蛋白DNA构建体可被掺入同 一个质粒或两个单独质粒中。诱导对抗肿瘤-基质成纤维细胞的CTL应答可抑制各种肿瘤的生长，对特殊的肿瘤类型为非特异性的。
本发明还提供抑制哺乳动物肿瘤生长或肿瘤转移的方法，该方法包括按足以刺激对抗呈递FAP抗原的肿瘤基质细胞的免疫应答的量，将本发明的DNA组合物给予哺乳动物。
ii本发明的另一方面为有效的组合治疗方法，该方法包括将化疗药
物联合本发明的DNA组合物来给药。在本发明的此方法实施方案中， 将各种化疗药物联合本发明的包含编码FAP或其免疫原性部分的 DNA构建体的DNA组合物给予病人，所述化疗药物例如有多柔比星、 紫杉醇、和/或环磷酰胺，当按最大耐受量(MTD)给药时该化疗药物不 引起骨髓抑制。本发明的FAP组合物与上述药物的组合提供附加优 点，该优点为I型胶原表达的减量调节，和因此而增加的各种化疗药 物和其他化合物的肿瘤内吸收。本发明的DNA组合物引起多种分子 的肿瘤细胞吸收增加，所述分子包括但不限于抗肿瘤化疗药物。例如， 低分子量染料萤光素(376 Da)、高分子量化合物伊文思蓝白蛋白 (68,500 Da)和抗肺瘤化疗药物5-氟尿嘧咬(5-FU; 130Da),它们全部都 在经本发明DNA组合物治疗的小鼠中以相对于用非活性对照组合物 治疗的小鼠高很多的水平被肿瘤细胞吸收。本发明的DNA组合物加 上抗肺瘤药物多柔比星的组合在50%的接受本组合疗法治疗的小鼠中 诱导同位生长的乳腺肿瘤的完全排斥。在单独用DNA组合物或单独 用多柔比星治疗的小鼠中没有观察到肿瘤的完全排斥。
优选的方法提供用于增强哺乳动物化疗药物吸收的方法。该方法 包括按足以刺激对抗呈递FAP抗原的哺乳动物细胞的免疫应答的 量，将本发明的DNA组合物给予哺乳动物，然后给予该哺乳动物有 效量的化疗药物。
另一优选的方法实施方案为在哺乳动物中抑制肿瘤生长或肿瘤 转移的方法，该方法包括以下步骤按足以刺激对抗呈递FAP抗原的 哺乳动物细胞的免疫应答的量，将本发明的DNA组合物给予哺乳动 物，随后给予该哺乳动物有效抗肿瘤量的抗肿瘤化疗药物。
优选通过本发明方法治疗的哺乳动物为人。
在本发明的方法实施方案中，可以经肠内例如通过口服给药，或 经胃肠外例如通过注射或静脉输注，给予所述DNA组合物。优选口服给予该组合物。该组合物可包装在密封容器中，用对临床医生有效 地给予该组合物有用的信息贴标签。.
本发明的DNA组合物用于治疗和预防许多病症。例如，患有结 肠直肠癌、乳腺癌、肺癌等的患者可受益于通过本发明的组合物的免 疫。
附图简迷
图1为鼠类FAP DNA构建体的表征和化学抗性肺瘤细胞系的表 征。分图A阐明编码完整鼠类FAP的质粒cDNA,该质粒cDNA被 插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体(pFAP)的EcoRI位点中。分图B显 示在瞬时转染CT26细胞之后通过蛋白印迹法证明的FAP蛋白表达。 分图C显示用标明的浓度的各种化疗药物治疗的CT26结肠癌和D2F2 乳癌细胞。在孵育48小时之后，用Hoechst-33342染料着色评定细胞 核的凋亡。柱条表明3次试验的平均值加上标准差。
图2a -图2c阐明基于FAP的DNA组合物对肺瘤生长的作用。 预防设置(setting):在按照材料和方法中描述进行间隔1周的3次接种 疫苗中的最后一次之后10天，用致死量的3 x 104CT26细胞皮下注射 (图2a)或用致死量的3 x 105 D2F2细胞原位(图26)攻击BALB/c小鼠 (n=8)。描述8只小鼠的平均肿瘤生长，平均值土SE, P<0.01。 治疗 设置首先对BALB/c小鼠(11=8)静脉注射105 CT26细胞，然后在3 天和IO天之后一旦确定肺转移就马上进行治疗。在18天之后，将肺 切除并称重(正常的肺重量为约0,2g)，检查转移情况，通过目测评价 打分，如下评定被融合转移灶覆盖的肺表面百分比0 = 0%, 1《20%， 2 = 20-50%， 3>50%，尸O.01(图2c)。。
图3阐述由CD8+T细胞诱导的细胞毒性。(A)描述的是在经治疗 小鼠的效应期期间抗体介导的排除对寿命的影响(*表示与对照组相比 的统计显著性，pO.Ol)。 (B)将CD8十T细胞从经治疗小鼠的脾中纯 化，用经Y辐射的肿瘤靶细胞进行刺激，然后与经pGFP或pGFP/pFap转染的CT26细胞孵育48h。如下通过用Hoechst-33342染料着色评定 细胞核的凋亡细胞核的凋亡阶段0:不凋亡；阶段1:大规模染色 质凝聚；阶段2a:染色质断裂；阶段2b:凋亡小体。(C, D)用经pFap 转染的A31成纤维细胞对得自经pFap和空载体免疫的小鼠(r^3)脾细 胞刺激5d，然后对其进行"Cr-释放试验。(D)使效应细胞和靶细胞与 抗MHC I类抗体共孵育(平均值+SD, *表示与空载体相比的统计显著 性，p<0.05)。 (E)经治疗小鼠(r^2)的CT26胂瘤的单细胞悬液FACS 分析，用抗CD3+PerCP-Cy5.5抗体和抗CD8+FITC抗体着色。描述了 两个实验中的一个。(F)用抗CD8 FITC抗体和DAPI核染剂着色的、 经pFap和空载体治疗的小鼠的CT26肿瘤的代表性部分。
图4显示FAP/I型胶原的表达和萤光素/白蛋白/5-FU的瘤内吸收。 (A)在经治疗小鼠的皮下(s.c.) CT26肿瘤中FAP(上面的分图)和I型胶 原(下面的分图)表达的免疫组织化学分析。(B)在经治疗小鼠的皮下 CT26肺瘤中FAP和I型胶原的免疫印迹。(C， D, E)条形图表明在萤 光素的腹膜内(i,p.)注射、伊文思蓝白蛋白的静脉内(i.v.)注射或14C-5-氟尿嘧啶的静脉内注射之后，来自经治疗的BALB/c小鼠(n-4)的皮下 CT26肿瘤匀浆的光密度或闪烁测量结果的平均值+SE。分别为 P<0.05、 PO.01和P0.05。
图5阐述生物和化学联合疗法的抗转移效果和副作用。(A)预防设 置在以1周为间隔用对照疫苗、PBS.或本发明的疫苗的3次接种疫 苗中的最后一次之后10天，用3 x 105 D2F2细胞原位(o丄)攻击BALB/c 小鼠(11=8;平均值士SE)。在5、 10和15天之后，用多柔比星治疗上述 小鼠。(B)治疗设置在用1()S个D2F2肿瘤细胞静脉内注射之后5天， 用pFap疫苗或对照疫苗每周治疗BALB/c小鼠(n-8)。在每次接种后 的1天，用多柔比星静脉内治疗上述小鼠(*描述与对照組相比的统计 显著性，pO.OOOl， * *描述与对照组、对照/多柔比星组、pF叩组和 pFap/多柔比星组相比的显著性，pO.OOOl)。图6(A)瘤内的多柔比星浓度用5x 105 D2F2细胞皮下攻击经 治疗的BALB/c小鼠(11=4)，在16天之后用LC-MS测定混合的肿瘤溶 胞产物中的多柔比星浓度(代表两个实验，平均值+SD, PO.OOl)。 (B) 在经治疗小鼠(11=4)的上背部造成3 mm直径的圆形伤口 ，测量直至伤 口完全闭合的平均时间(平均值+SD)。
图7显示编码人FAP的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:l)。 图8阐述人FAP的氨基酸残基序列(SEQ ID NO:2)。 图9显示编码鼠类FAP的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。 图10显示鼠类FAP的氨基酸残基序列(SEQ ID NO:4)。 图.11显示编码人IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)。 图12显示人IL-2的氨基酸残基序列(SEQ ID NO:6)。 图13显示编码鼠类IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:7)。 图14显示鼠类IL-2的氨基酸残基序列(SEQ IDNO:8)。 图15显示编码人CCL21的核酸的核苷酸序列(SEQIDNO:9)。 图16显示人CCL21的氨基酸残基序列(SEQIDNO:10)。 图17显示编码鼠类CCL21b的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:ll)。
图18显示鼠类CCL21b的氨基酸残基序列(SEQIDNO:12)。 图19阐述人CCL21和鼠类CCL21b之间的氨基酸序列相似性。 图20显示编码鼠类CCL21a的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。
图21显示鼠类CCL21a的氨基酸残基序列(SEQ IDNO:14)。 图22显示编码人CD40L的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。 图23显示人CD40L的氨基酸残基序列(SEQ ID NO:16)。
优选的实施方案的详述
本发明提供有效抑制肿瘤生长或肿瘤转移的DNA组合物，该 DNA组合物靶向被称为成纤维细胞激活蛋白(FAP)的肿瘤基质抗原。
15该DNA组合物包含编码可在免疫细胞中表达的FAP的至少一个表位 的DNA构建体，该构建体被掺入药学上可接受的载体中。该DNA构 建体可编码FAP的单个表位、包含FAP的两个或多个表位的多肽、 整个FAP蛋白质、或其将刺激所需对抗肿瘤和肿瘤转移的免疫应答的 任何部分。
当用于本文和所附权利要求时，术语"DNA构建体"是指编码目标 蛋白质或多肽例如FAP表位、FAP蛋白质、IL-2、 CCL21等的DNA 结构。DNA构建体包括可在靶细胞中转录的任何DNA，包括线性DNA 和质粒DNA,以及已掺入细胞或病毒的遗传物质中的DNA。优选该 DNA构建体为已4参入病毒递送载体或细菌性递送载体(例如不致病的 减毒的病毒载体或细菌性载体)中的DNA。当用本发明的组合物治疗 受试者时，编码FAP的DNA被递送至免疫细胞(例如，巨噬细胞和树 突细胞)，然后表达FAP蛋白质。FAPDNA的病毒载体和细菌性载体 本身不表达FAP。
本发明的DNA组合物刺激CTL的形成，CTL有效对抗呈递FAP 抗原的细胞例如肿瘤基质细胞(如基质成纤维细胞)。。这样的肿瘤基 质细胞选择性地被CTL靶定，后者随接种本发明的DNA组合物而产 生。本发明的组合物可减少I型胶原的肿瘤基质表达，随后增强化疗 药物的吸收。
本文所用术语"免疫"是指对抗表达抗原细胞的的长期免疫保护。 术语"接种"是指暴露于抗原，这致使在经治疗的受试者中产生对表达 该抗原的细胞的免疫。
术语"FAP蛋白"是指人FAP、或者与人FAP具有至少80%序列相 似性且包括至少一个的人FAP表位的多肽。术语"FAP DNA"是指编码 人FAP的DNA、或编码与人FAP具有至少80%序列相似性且包括至 少一个的人FAP表位的多肽的DNA。.
用于本发明的DNA组合物的DNA构建体优选包含编码包含FAP 的一个或多个表位的多肽的核酸，该DNA构建体可操作地连接至在免疫细胞中基因表达所需的调控元件。优选该DNA构建体编码全长 FAP蛋白质，或编码与FAP具有至少80%的高度相似性且包括至少 一个FAP表位的多肽。有用的DNA构建体优选包括在免疫细胞内核 普酸表达所需的调控元件。这样的元件包括例如启动子、起始密码子、 终止密码子、和多聚腺苷酸化信号。另外，编码免疫原性革巴标蛋白质 的序列的表达经常需要增强因子。如本领域已知，这些元件优选可搡 作地连接至编码期望蛋白质的序列。优选这些调控元件经过选择，在 其将被给予的物种中可操作。优选该DNA构建体为质粒形式，并被 才参入病毒载体或细菌性载体中。最初，编码FAP蛋白的DNA构建体 可通过转染，使用本领域熟知的方法掺入细菌性载体。随后，可以培 养经转化的细菌以提供细菌的备用菌种，该菌种包括在细菌的遗传物 质内的FAPDNA。所述经转化的细菌的培养提供用于本发明的DNA 组合物的备用源。
优选起始密码子和终止密码子作为编码FAP的核苦酸序列的一部分 包括在本发明的DNA组合物之中。起始密码子和终止密码子必须与 编码序列在同一个框内。
优选本发明的组合物中所包括的启动子和多聚腺苷酸化信号经 过选择，而在待免疫的受试者的细胞内具有功能性。
用于本发明组合物的、特别是产生用于人的基因疫苗DNA组合 物的启动子的实例，包括一(旦不限于来自猿猴病毒40 (SV40)的启动子、 小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长 末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(CMV)如CMV直接 早期启动子，埃巴病毒(EBV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因的 启动子，例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸、 和人金属硫蛋白的基因的启动子。
用于本发明的DNA组合物的、特别是产生用于人的DNA组合物 的多聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多聚腺苷酸化信号和 LTR多聚腺苷酸化信号。除DNA表达所需的调控元件之外，其它元件也可包括进DNA分 子中。这样的附加元件包括增强子。该增强子可为，例如，人肌动蛋 白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸增强子和病毒增强子例如 来自CMV、 RSV和EBV的那些增强子。
调控序列和密码子 一 般依赖于物种，因此为了最大化蛋白质产 生，优选调控序列和密码子经过选择，以在待免疫的物种中有效的。 本领域技术人员可制备在给定受试物种中具有功能性的DNA构建体。
用于本组合物的DNA构建体可为"棵"DNA,如在Restifo等Gewe 7T^ra/^2000; 7:89-92中定义，其相关公开通过引用结合到本文中。 优选该DNA构建体为质粒形式或为被掺入减毒病毒或减毒细菌的遗 传物质中的DNA。有用的递送载体(viehicle或carrier)包括可生物降解 的微胶嚢、免疫激活复合物(ISCOM)、用于棵DNA构建体的脂质体、 和用于经遗传工程改造的减毒活病毒或减毒活细菌的各种生理学可 接受的緩沖剂。
可被转化以掺入FAP DNA构建体的合适减毒活细菌性载体的实 例包括鼠伤寒沙门氏菌(5Wmowe〃a 0^A/mwn'wm」、伤寒沙门氏菌 (Sa/mwie〃a 0^/ ;)、志贺氏菌属(5^^//^细菌、芽孢杆菌属(Sac!7/iw」 纟田菌、乳酸杆菌(XflctoZ fl"'〃w力、卡介苗(Sfld〃e Ca//wg"g-Gwen'w) fSCG,大肠杆菌fEscAen'c/n'a co/"、霍乱弧菌(T/Z n'o cAo/erae,弯曲 杆菌(Taw;^/o^"e^、李斯特菌(丄Wen'a入或本领域已知的任何其它
合适的细菌性载体。优选载体为减毒的活鼠伤寒沙门氏菌(^3/附0^//"
(y; /n'mw7'wmj载体，尤其当该组合物被预定为口服时。优选的减毒活鼠 伤寒沙门氏菌(Sa/mo"e〃a 包括」ra^ -菌林例如SL7207，
或双重减毒的\ c/am —菌林例如RE88。双重减毒的v4ra^ -、 —鼠伤寒沙门氏菌(SWwowe〃a />p/ >mn'wm_;为特别优选的载体。
本领域充分描述了用外源DNA构建体转化活细菌性载体的方法。 参见，例如，Joseph Sambrook和David W. Russell, M /ecw/ar C7om'"g, J Z^,一 Mawwa/,第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York (2001) (Sambrook和Russell)。在转化 之后，外源遗传物质被掺入细菌的遗传物质中，因此随着细菌繁殖， 外源DNA与该生物体的天然DNA —起复制。因此，细菌一旦经转化， 生物的正常繁殖过程就提供外源DNA的备用供给。
优选的病毒载体包括噬菌体、疱渗病毒、腺病毒、腺伴随病毒、 辛德比斯病毒、脊髓灰质炎病毒、痘苗病毒、和禽痘病毒。本领域也 充分描述了用外源DNA构建体转化病毒载体的方法。参见上述的 Sambrook和Russell 。
有用的脂质体载体为单层的或多层的嚢泡，并具有由亲脂材料形 成的膜和内部的水性部分。将水性部分用于本发明以包含待递送至耙 细胞的多核苦酸材料。 一般优选形成脂质体的材料具有阳离子基团(例 如季铵基团)和一个或多个亲脂基团(例如具有约6个-约30个碳原子 的饱和或不饱和烷基)。 一组合适的材料在欧洲专利公开第0187702号 中描述，在Wolff等的美国专利第6,228,844号中进一步论述，其有 关公开通过引用结合到本文中。在文献中描述了许多其它合适的形成 脂质体的阳离子脂类化合物。参见例如L. Stamatatos等，历0cAew/W7 1988; 27: 3917-3925;和H. Eibl等，历—CA纖'勿1979; 10: 261-271 。或者，可使用微球体如共聚丙交酯-乙交酯 (polylactide-coglycolide)可生物降解的微球体。如本领域已知的，将核 酸构建体装入胶嚢或另外与脂质体或微球体复合，用于将核酸释放至 组织。
其它有用的载体包括包含可生物降解聚原酸酯材料的聚合微球 体，如Wang等，淑Ma紋,2004; 3(3): 190-6. Epub 2004年2月15 日中所描述的，其相关公开通过引用结合到本文中。
优选用于本发明的组合物包含编码人FAP或其功能性同源体的 DNA构建体。FAP的功能同源体优选具有与人FAP至少约80%氨基 酸残基序列相似性，更优选至少约90%，最优选与人FAP至少约95% 相似性。GenBank是National Institutes of Health(NIH)的基因序列数据库， 是所有公开可用的DNA序列的注解集合。GenBank是International Nucleotide Sequence Database Collaboration 的 一 部分，是DNA DataBank of Japan(DDBJ) 、 European Molecular Biology Laboratory(EMBL)、和National Center for Biotechnology Information的 GenBank的联合成果。
编码人FAP的cDNA的核酸序列，SEQ ID NO:l(图7)已经发表 在GenBank中，登记号为BC026250,.其公开内容通过引用结合到本 文中。人FAP的相应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO:2(图8)。
编码鼠类FAP的DNA的核酸序列，SEQ ID NO:3(图9)已经发表 在GenBank中，登记号为BC019190,其公开内容通过引用结合到本 文中。鼠类FAP的相应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO:4(图10)。
由于遗传密码的固有简并性，编码人FAP的氨基酸序列的其它 DNA序列可用于本发明的实践。这样的DNA序列还包括能够与人 FAP杂交的那些DNA序列。
核酸具有对于SEQ ID NO:l的那些核苷酸残基而言不同的核苷酸残基 的删除、添加或取代，所述删除、添加或取代产生编码相同FAP基因 产物的序列。编码人FAP的功能等效同源体的DNA分子也可用于本 发明的DNA组合物。
由核酸编码的基因产物也可包含在FAP氨基酸残基序列之内的 氨基酸残基的删除、添加或取代，该删除、添加或取代致使沉默的变 化(silent change),因此产生功能等效的FAP。可根据相关残基在极性、 电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质上的相似性进行这样
的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正 电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的含不带电的极 性头基团的氨基酸包括以下亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、 丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
20本文所用功能等效FAP是指包括一个或多个表位的蛋白质，当被T
细胞识别时其允许这些相同的T细胞识别展示在表达FAP的细胞上的 FAP表位。在优选的实施方案中，功能等效FAP具有对于人FAP的 氨基酸残基序列(SEQ ID NO:2)而言具有至少约80%相似性、例如至少 约90%相似性或至少约95%相似性的氨基酸残基序列。
可工程改造编码FAP的DNA构建体，以为了各种目的而改变 FAP编码序列(相对于天然FAP cDNA， SEQ ID NO:l而言)，这些目 的包括但不限于修饰FAP基因产物的加工和表达的改变。例如，可使 用本领域熟知的技术如定点诱变在DNA中引入突变，以插入新的限 制酶切位点，改变糖基化模式、磷酸化作用等。
在一个优选的实施方案中，本发明的DNA组合物包含编码FAP 的DNA构建体和可^t喿作地编码至少一种免疫效应蛋白的DNA构建 体，两者都可在免疫细胞中表达。当用于本文和所附权利要求时，词 组"免疫效应蛋白"意指参与免疫系统途径的调控的蛋白质。优选所述 免疫效应蛋白为细胞因子。
细胞因子为由细胞产生的蛋白质和多肽，可影响其它细胞的行 为，例如细胞增殖、细胞分化、免疫应答的调控、造血作用、和炎症 反应。细胞因子已经被划分成许多家族，包括趋化因子、血细胞生成 素、免疫球蛋白、肿瘤坏死因子、和多种未确定的分子。 一般见Ox/oW ￡)/c"o a/7 o/ 5!'oc/ie/w'W^. a打c/ Afo/ecw/ar 5z'o/ogy， 4奮i丁片反，Oxford University Press， 2000; 和C. A. Janeway， P. Travers， M. Walport和 M. Schlomchik， /w顯加6/o/ogy,第五版，Garland Publishing， 2001(下 文称"Janeway and Travers")。在Janeway and Travers ， 附录III， 第 677-679页介绍细胞因子的简明分类，其相关公开内容通过引用结合 到本文中。
血细胞生成素包括，例如促红细胞生成素、白介素-2(IL-2，由T 细胞产生的133个氨基酸蛋白质，与T细胞增殖有关)、IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-9、 IL-ll、 IL-13、 IL-15 (114个氨基酸的IL-2样蛋白质，刺激肠上皮细胞、T细胞和NK细胞的生长)、粒细胞集落 刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、制瘤素 M(OSM)、和白血病抑制因子(LIF)。
干扰素包括例如IFN-a、 IFN-卩和IFN-y (由T细胞和NK细胞产 生的143个氨基酸的同源二聚体蛋白，参与巨噬细胞激活、MHC分 子表达增加和抗原处理成分增加、IG类型转换、和Th2的抑制)。
免疫球蛋白包括，例如，B7.1(CD80)、和B7.2(CD86),两者共同 刺激T细胞应答。
肿瘤坏死因子(TNF)家族包括，例如，TNF-a、 TNF-p(淋巴毒素)、 淋巴毒素-(3(LT-l3)、 CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、 4-1BB配体、胂瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体(Trail)和OPG配体。
本领域熟知CD40配体(CD40L)的生物学作用，尤其是在T细胞 活化的共同刺激期间其与在抗原呈递细胞上表达的CD40的相互作 用。CD40为在所有成熟B细胞、大多数成熟B细胞恶性肿瘤、和一 些早期B细胞急性淋巴细胞性白血病的表面上表达的48 kDa糖蛋白， 但它不在浆细胞上表达，Clark, Z^we/l""gms 1990， 35:33-36。 CD40L: 约35 kDa的II型膜蛋白在抗原识别时在T细胞表面上表达。当作为 同源三聚体表达时，TNF家族的成员为生物学最有活性的。在这方面 CD40L也不例外，其可通过融合到该配体整个胞外结构域N-末端的 33个氨基酸的亮氨酸拉链模体的修饰，作为同源三聚体(CD40LT)表 达。Gu画than等，J,/wm/"o/ 1998， 161:4563已报导，CD40LTDNA 增强细胞免疫应答，例如当用编码高免疫原性模型抗原P-半乳糖苷酶 治疗小鼠时，诱导IFN-y和细胞溶解性T细胞活性。
CD40LT为在诱导对抗肿瘤自身抗原的有效保护性免疫所需要的 T细胞活化中的重要因子。 一旦负载抗原的MHCI类复合体被树突细 胞(DC)吸收并呈递给幼稚T细胞，第一抗原信号马上通过T细胞受体 (TCR)释放，增量调节CD40LT。然后CD40LT通过CD40与CD40LT 的相互作用在T细胞表面上诱导DC上的协同刺激活性。因此已接触过抗原的这些APC可表达共同刺激性分子B7.1 (CD80)和B7.2 (CD86)，后两者通过与CD28相互作用传送第二共同刺激信号至T细 胞导致T细胞完全活化的事件，以同时产生促炎细胞因子INF-Y和 IL12, 4丸行效应物功能。
没有分配到特定家族的许多细胞因子包括，例如，肺瘤生长因子 -卩(TGF-(3)、 IL-la、 IL-1卩、IL-1 RA、 IL-IO、 IL-12(自然杀伤细胞刺激 因子；具有197个氨基酸的链和306个氨基酸的链的异二聚体，与活 化NK细胞和诱导T细胞分化成丁Hl-样细胞有关)，巨噬细胞抑制因 子(MIF)、 IL陽16、 IL-17(细胞因子产生诱导因子，在上皮细胞、内皮细 胞和成纤维细胞中诱导细胞因子产生)，和IL-18。
趋化因子为细胞因子的家族,所述细胞因子为相对小的化学引诱 物蛋白质和多肽，该家族刺激各种细胞(如吞噬细胞和淋巴细胞)的迁 移和活化，例如白细胞迁移。趋化因子在炎症和其它免疫应答中起作 用。趋化因子已经被划分成许多家族，包括C趋化因子、CC趋化因 子、CXC趋化因子、和CX3C趋化因子。这些名称是指分子中的半胱 氨酸(C)残基的数目和间隔;C趋化因子具有一个半胱氨酸，CC趋化 因子具有两个相邻的半胱氨酸，CXC具有被单个氨基酸残基分隔的两 个半胱氨酸，CX3C趋化因子具有被三个氨基酸残基分隔的两个半胱 氨酸。趋化因子与存在于细胞表面的许多趋化因子受体相互作用。见 Janeway和Travers，附录IV,第680页，通过引用结合到本文中。
另外，趋化因子可具有免疫调节活性，并参与对癌症的免疫应答。 例如，鼠类6Ckine/SLC，小鼠的人次级淋巴组织趋化因子(SLC)(现在 通常称为CCL21)类似物已被报导在C26结肠癌肿瘤细胞系中引出抗 肿瘤应答。见Vicari等，J. 7www"o/. 2000; 165(4): 1992-2000。人 CCL21及其鼠类相应物6Ckine/SLC被归类为CC趋化因子，与CCR7 趋化因子受体相互作用。Vicari等报导鼠类6Ckine/SLC (muCCL21) 也是CXCR3趋化因子受体的配体。人CCL21、鼠类muCCL21和多种其它趋化因子参与到各种免疫系统细胞如树突细胞、T细胞和自然
杀伤(NK)细胞的调节。
Mig和IP-10为与和激活的T细胞有关的CXCR3受体相互作用 的CXC趋化因子。淋巴细胞趋化蛋白为与和T细胞以及NK细胞有 关的XCR1受体相互作用的C趋化因子。Fractalkine为与和T细胞、 单核细胞以及嗜中性白细胞有关的CX3CR1受体相互作用的CX3C趋 化因子。
由本发明的DNA组合物编码的特别优选的免疫效应蛋白包括细 胞因子IL-2 (血细胞生成素)、CCL21(趋化因子)、以及CD40配体如 CD40配体三聚体(CD40LT)、 TNF家族细胞因子。
人IL-2的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为 BC070338,其公开通过引用结合到本文中。鼠类IL-2的DNA和蛋白 质序列已经发表于GenBank中，登记号为NM 008366，其公开内容 通过引用结合到本文中。
编码人IL-2的核酸序列呈现于图11中(SEQIDN0:5),其相应的 氨基酸残基序列(SEQIDNO:6)在图12中提供。编码鼠类IL-2的核酸 序列呈现于图13中(SEQIDNO:7),其相应的氨基序列(SEQ ID NO:8) 在图14中提供。
人CCL21的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号 为AB002409,其公开内容通过引用结合到本文中。鼠类CCL21a变 体的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为 NM011335，其公开内容通过引用结合到本文中。鼠类CCL21b变体 的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为NM011124， 其公开内容通过引用结合刊登于本文中。
编码人CCL21的核酸序列呈现于图15中(SEQIDNO:9)，其相应 的氨基酸残基序列(SEQ ID NO:10)在图16中提供。编码鼠类CCL21 (CCL21b变体)的核酸序列呈现于图17中(SEQ ID NO:ll),其相应的 氨基序列(SEQEDNO:12)在图18中提供。在图19中展示人CCL21与其鼠类相应物(鼠类CCL21b)之间的蛋 白质序列相似性。在人CCL21 (SEQ ID NO:10)与鼠类CCL21b(SEQ ID NO:12)之间具有约73%的氨基酸残基序列同一性。编码鼠类CCL21的CCL21a变体的核S^f列呈现于图20中(SEQ IDNO:13)，其相应的氨基酸序列(SEQIDNO:14)在图21中提供。人CD40配体(CD40L)为261个氨基酸的蛋白质，其以最有活性 的形式作为三聚体(CD40LT)存在。编码人CD40L(也称为CD154)的 DNA序列已经发表于GenBank中，登记号为NM 000074，其公开内 容通过引用结合到本文中(图22， SEQIDNO:15)。 CD40L的相应蛋白 质序列在图23中显示(SEQ IDNO:16)。本发明的方法方面包括给予哺乳动物包含DNA构建体的DNA 组合物，该DNA构建体编码可在哺乳动物的免疫细胞中表达的FAP。 优选所述哺乳动物为人。该组合物可经口、肌内、鼻内、腹膜内、皮 下、皮内、或局部地进行给药，视该组合物被制备的特定剂型而定。 优选以口服给药剂型制备该组合物，例如溶液、混悬液、乳剂、胶嚢、 片剂等。可使用本发明的DNA组合物以在接受该组合物治疗的患者中提 供肿瘤生长和/或肿瘤转移的长期抑制。在一个优选的实施方案中，所 述DNA组合物与抗肿瘤化疗药物^:合给予。该DNA组合物可与化疗 药物一起以组合剂型给药，或者该组合物和化疗药物可以以单独剂型 并以适合待给予化疗药物药理学的单独剂量间隔进行给药。与本发明的DNA组合物联用的化疗药物包括抗肿瘤剂例如多 柔比星、紫杉醇、环磷酰胺、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氨甲蝶呤等。本发明的DNA组合物优选用药学上可接受的载体或赋形剂例如 水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合配制，以辅助组合物的配制成制 剂和给予。该组合物也可包含辅助物质例如润湿剂、乳化剂、缓冲剂、 和制药领域熟知的其它辅助物质。优选将本发明組合物作为药学上可接受的载体中的溶液或混悬液，以基于FAP编码DNA的重量计算约1 -约10微克/毫升的DNA 浓度，经口给予哺乳动物例如人。用于本发明的DNA组合物的特别 优选的剂型为在合适的緩沖溶液中的经FAP转染的减毒细菌的混悬 液，该剂型可配制用于口服给药。该组合物的合适的剂量取决于欲治 疗的受试者，取决于组合物的活性，部分地取决于医师对给药或给予 该组合物的要求的判断。如果将使用多于一次的给药，那么给予哺乳动物的剂量和给药方 案将根据不同的哺乳动物和剂型而改变。有效剂量和给药方案可通过 临床剂量-反应研究凭经验确定，如本领域所熟知。选择剂量和给药方 案以提供免疫细胞中的足量的FAP表达，以刺激哺乳动物的免疫应答 对抗存在FAP抗原的细胞。优选给予受试哺乳动物的组合物的剂量在 哺乳动物的免疫细胞中刺激足量的FAP抗原表达，以维持对抗存在 FAP的细胞的免疫应答，所述免疫应答将持续至少1个月，例如至少 6个月或至少约1年的时期。本发明的组合物可以多剂量或单位剂量的形式包装在适当灭菌 的容器例如安瓿、瓶、或小瓶中。优选在装入本发明的DNA组合物 之后密封容器。优选该组合物被包装在具有附贴标签的容器中，该标 签标识该组合物，并以政府才几构例如United States Food and Drug Administration规定的形式的反映合适的法律下该组合物的批准、剂量 信息等的告示。该标签优选包含对保健专业人员将所述組合物给予患 者有用的、关于组合物的信息。该包装还优选包含关于组合物的给药、 用法说明、适应症和任何必要的警告的印刷信息材料。提供以下实施例以进一步阐述本发明的特征和实施方案，这些实 施例并不旨在限制。材料、方法和实施例.动物、细菌菌种、和细胞系。雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，得 自Scripps Research Institute (TSRI) Rodent Breeding Facility。所有的动物实-睑均依照关于Care and Use of Laboratory Animals的National Institutes of Health Guide 4丸4亍，并经TSRJ Animal Care Committee批 准。双重减毒的鼠伤寒沙门氏菌fSfl/mowe〃a ^p/n'mwn'ww)菌株RE88 (^rov4 — dam —)由Remedyne Corporation (Santa Barbara, Califomia)4是供。 鼠类D2F2乳腺癌细胞得自Dr. Wei-Zen Wei， Karmanos Cancer Center, Detroit, MI,而CT26结肠癌细胞得自ATCC (Manassas, Virginia),然 后将这些细胞培养几个月，以获得化学抗性的亚克隆。在1% DMSO、所述浓度的依托泊苦、5-氟尿嘧啶、多柔比星、 长春碱或紫杉醇(Sigma, St. Louis, Missouri)的存在下，培养鼠类CT26 和D2F2癌细胞。在48小时之后，在与DNA特异性Hoechst 33342 染料(2 (iM; Molecular Probes, Eugene, Oregon)温育之后，计数凋亡的纟田 胞核。CT26结肠癌细胞和D2F2乳腺癌细胞的两个克隆分别具有获得性 化学抗性(见图1,分图C)。在将五种不同的诱导凋亡的化疗药物添加 至CT26结肠癌克隆(图1，分图C)时，唯独长春碱能够诱导轻度的细 胞凋亡效应，然而仅在5 的非常高的浓度下。对于5-氟尿嘧啶(5-FU) 而言，原始的母CT26细胞系(ATCC存CLR-2326)的1(:50为约1.85岸， 然而5-FU甚至在高达100 (iM的浓度时仍不能在抗性CT26克隆中诱 导细胞核的凋亡。在抗性D2F2乳腺癌细胞中，根据Hoechst-33342 染料染色所确定，唯独多柔比星在l pM的最高浓度时能够诱导细胞 核的凋亡。这些结果证明这两种肿瘤细胞系均为多重耐药的。统计分析。通过学生t检验确定实验組和对照之间差异数据的统 计学显著性。通过曼-惠特尼检验确定转移评分的显著性。通过log-rank 检验确定存活数据的显著性。假如P值0.05，那么数据被视为具有显 著性。实施例l.编码鼠类FAP的DNA组合物1的制备.将编码鼠类FAP (SEQ ID NO: 4,图IO)的cDNA(SEQ ID NO: 3,图 9;由Dr. J. D, Cheng提供)亚克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体 (Invitrogen, San Diego, California)的五coW限制性酶切位点，以得到真 核生物表达载体pcDNA3.1-FAP (pFAP)(见图1，分图A)。通过对来 自经瞬时转染的CT26结肠癌细胞的溶胞产物进行蛋白质印迹，来证 明来自上述载体的95kDaFAP蛋白的正确表达，该结肠癌细胞本身不 表达FAP(图1，分图B)。对经瞬时转染的D2F2乳腺癌细胞也进行同 样处理。对于瞬时转染而言，对CT26和D2F2细胞如先前所迷进行 电穿孔(见Loeffer等，薦战2001， 15: 758-767,通过引用结合到 本文中)。通过蛋白质印迹法用多克隆兔抗鼠类FAP抗体(由Dr. J. D. Cheng提供)，来证明FAP蛋白质表达。如下制备DNA组合物1:按照制造商推荐的方法，利用Bio-Rad 脉冲发生器在2kV、 960 jaF、和200Ohm下，将pcDNA3.1-FAP栽体 (约2昭的pDNA)电穿孔入新制备的双重减毒的鼠伤寒沙门氏菌 (5a/mo e//a ^; /n'mwn'MW」(菌林RE88)。在含氨千青霉素的平板上选择 包含所述载体的减毒的鼠伤寒沙门氏菌(^a/mo"e//a &/ / >m/〃'ww,第 二天挑取菌落，菌落在添加氨千青霉素的LB肉汤(10g蛋白胨，5g酵 母提取物，10g氯化钠；EM Science, Gibbstown,NJ)中培养过夜。分离 细菌并在磷酸盐緩冲液(PBS)中洗涤。然后将洗涂的细菌悬浮在PBS 介质(medium)中，浓度为约109个重组沙门氏菌(5Wwo"e〃a, /毫升 PBS,以形成含以下DNA构建体的DNA组合物1溶液该DNA构 建体可操作地编码鼠类FAP且掺入减毒的鼠伤寒沙门氏菌〈6Wwone〃a (y; /n'mim'wmj (vira/i- c/am —)载体中。将该组合物贮藏在密封的安瓿中直 至使用。也依照同样的方法制备由单独用pcDNA3.1载体(不含FAP DNA)转化的沙门氏菌「*^/附0^//^组成的"对照疫苗"。在对沙门氏菌 Pa/m卵e"flJ进行转化之前，将质粒DNA贮藏在约-80。C下。在构建如上所述(图1 ，分图A)的真核生物表达载体 pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Fap (pFap)之后，通过对来自经瞬时转染的CT26结肠癌细胞和D2F2乳腺癌细胞的溶胞产物的进行蛋白印迹，来 证明88kDaFAP蛋白的正确表达，这些细胞本身不能表达FAP(图1， 分图B)。实施例2.编码鼠类FAP、鼠类IL-2、和鼠类CCL21的DNA组合 物2的制备.通过在实施例1中描述的相同的一般方法，将来自ATCC,登记 号39892, Manassas, Virginia的编码鼠类IL-2的cDNA (DNA SEQ ID NO:5)、和来自Invitrogen, San Diego， California的鼠类CCL21a的 cDNA (DNA SEQ ID NO:7)亚克隆到实施例1的鼠类pFAP载体中。通 过在实施例1中所描述的方法，用所产生的载体(pFAP/IL-2/CCL21) 转化RE88鼠伤寒沙门氏菌(3"a/mowe^0;/ /u'wwWwm,以提供包含以下 DNA构建体的DNA组合物2溶液该DNA构建体可操作地编码鼠 类FAP、鼠类IL-2、和鼠类CCL21a，且被掺入减毒的鼠伤寒沙门氏 菌fSa/附o"e〃a ^y; /^wwn'w^载体中。实施例3.本发明的DNA组合物在结肠癌和乳腺癌的鼠类模型中的 评估.口服接种，肿瘤细胞攻击和用多柔比星治疗.对于预防设置 (prophylactic setting)中的实验而言，通过用包含约109个鼠伤寒沙门氏 菌0. (Kp/n'mMn'wm)04m4 Jam—)的约100 )al PBS的口服管饲法，按约 1周间隔对BALB/c小鼠(/ =8)接种3次，该鼠伤寒沙门氏菌(3". 0^Wmwn'wm)为用编码鼠类FAP的载体质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌 (实施例1的DNA组合物1)、用编码鼠类FAP、 IL-2和CCL21的载 体质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌(实施例2的DNA组合物2)、或实施例 1的对照疫苗，上述过程通过使用在Niethammer,等.，A^, Mec/., 2002, 8: 1369-1375中描述的方法来进行。在随后的约10天，通过在左前胁29腹皮下(s.c.)注射约3 x 104 CT26结肠癌细胞或通过在左边最下面第二 乳腺脂肪垫原位(o.t.)注射约3 x 105D2F2乳腺癌细胞，来对动物攻击。 通过以2维(即长和宽，以毫米为单位)测量肿瘤并按长度的一半 乘以宽度的平方计算体积，来计算出肿瘤体积(以mn^为单位)。在治 疗设置中，通过静脉内(i.v.)注射约1 x io5 CT26结肠癌细胞来进4亍起 始的肺瘤细胞接种，在此之后约3天和10天通过用对照疫苗或活性 DNA组合物来进行口服接种。在约18天之后，对肺称重(正常肺重为 约0.2 g)，并通过目测评估被融合的转移灶覆盖的肺表面百分比，来 对肺部肿瘤转移情况进行检查和评分，评分方法如下0%的覆盖度 为0分，小于约20%的覆盖度为l分，约20%-50%的覆盖度为2分， 大于约50%的肺表面被覆盖为3分。在肿瘤攻击之后的5、 10和15 天，用静脉内给药的约10 mg/kg多柔比星(Sigma)对各組小鼠进行多 柔比星治疗。
为了去除CD4+和CD8+T细胞或NK细胞亚群，从用肿瘤细胞攻 击的前1天开始，每隔7天腹膜内(i.p，)注射靶向均来自National Cell Culture Center (Minneapolis, Minnesota)的CD4(克隆GK1.5)或CD8(克 隆2.43)的抗体(500昭)，或抗脱唾液酸的GM1抗体(Wako BioProducts, Richmont, Virginia)<
cd8+t细胞的细胞毒性.在按1周间隔的最后3次治疗之后约10 天，收集来自各已治疗組的BALB/c小鼠(>1=4)的脾细胞。使用CD8a 微珠(Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach，Germany)，按照制造商的实 验方案纯化CD8+细胞。然后使这些细胞与经y -照射(IOOO Gy, 45分钟) 的CT26细胞共培养5天来进行刺激，所述CT26细胞用 pcDNA3.1/Zeo(实施例1的空载体)或pcDNA3.1/Zeo-FAP(实施例1的 pFAP载体)瞬时转染。此后，使CD8+T细胞与CT26癌细胞(E:T-100:1) 共培养，后者已用作为对照的绿色荧光蛋白(GFP)、 (PEGFP; Clontech, Palo Alto, Califomia)或GFP加上编码鼠类FAP的pFAP质粒瞬时转染。在约48小时之后，如上所述用DNA特异性Hoechst 33342染料(2pM) 来评估细胞核的凋亡。
为了进行51Cr释放试验，按周为间隔对Balb/c小鼠(『3)治疗4 次。脾细胞在最后一次治疗之后13天收获，并与经Y照射(约1000 Gy, 45分钟)的用pF叩进行逆转录病毒感染的A31成纤维细胞(ATCC, Manassas, Virginia)孵育5天。然后使受激的脾细胞与经标记的 A31-pFap孵育约4小时，并计算溶解百分比。还使细胞与浓度为约 10 pg/ml的抗-MHC I类抗体(BD Biosciences, Rockville, Maryland)共 孵育。
免疫组织化学。使冷冻切片(约8(xm厚)固定于丙酮中并拉紧。在 与初级抗体(多克隆兔抗-鼠类FAP抗体(由Dr. J. D. Cheng提供)或多克 隆兔抗-鼠类I型胶原抗体(Chemicon, Temecula, California))温育之后， 依照制造商的实验方案(DAKO LSAB+试剂盒，过氧化物酶，DAKO, Carpinteria， California)使切片免疫染色。
为了进行聚焦显微镜检查法，固定的冷冻切片用抗-鼠类CD8抗 体、生物素化的抗-鼠Ig次级抗体、经FITC标记的链霉抗生物素蛋白 (BD Bioscience, Rockville, Maryland)染色，并用DAPI (Sigma, St. Louis, Missouri)共染。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来获取图像，使用 Zeiss Image Examiner软件(Carl Zeiss)处理该图像。为了进行T细胞浸 润的FACS分析，用pFap或空载体按每周为间隔治疗Balb/c小鼠 0=6)3次。在最后一次治疗之后的一周，用约3xl05CT26肿瘤细胞 皮下(s.c.)攻击动物。在3周后采集肿瘤，并通过在补充有I型胶原酶 (125U/ml;GIBCO,Gaithersburg,Maryland)的培养基中孵育切成薄片的 肿瘤组织45分钟，来制备单细胞悬浮液。在过滤之后，对两种小鼠 的细胞进行混合(pool)，用抗-CD3+PerCp-Cy5.5和抗-CD8+FITC(BD Biosciences, Rockville，Maryland)染色，并用FACS进行分析。
萤光素、伊文思蓝白蛋白和"C-5-氟尿嘧啶的瘤内吸收。在用对 照疫苗(实施例1)、 DNA组合物l(实施例l)或DNA组合物2(实施例2)按1周为间隔治疗3次的最后1次之后，在10天后通过在左前胁腹 皮下注射约3 x 104个CT26细胞来攻击小鼠。在此后约19天，给小 鼠腹膜内(i.p.)注射按约12pl/g体重计算的1 %萤光素钠(Sigma),静脉 内(i.v.)注射约lOOjil伊文思蓝白蛋白(Sigma),或静脉内(i.v.)注射约 2.5(iCi的"C-5-氟尿嘧咬(Sigma)。分别在约5分钟、30分钟或1小时 之后处死小鼠，以分别在490nm、 612nm处、或以y-计数器测定肿瘤 匀浆上清液的吸收或闪烁。
为了测定瘤内的多柔比星吸收，用约5x IO5 D2F2细胞在右胁腹 皮下(s.c.)攻击Balb/c小鼠0=4)。 16天后静脉内(i.v.)多柔比星 (10mg/kg),并在此后45分钟采集肿瘤。使用在1100系列LC-MS上 的Eclipse XCB-C8柱(Agilent, Foster City，California),对照内标柔红霉 素来测量样品。
潜在的副作用的评估。为了确定对伤口愈合的任何有害作用，对 小鼠施行外科手术制造伤口 。在按1周.间隔的3次治疗中的最后一次 之后约10天，用皮肤打孔器(Miltex Inc., Bethpage, New York)在 BALB/c小鼠(^=4)的上背部造成约3 mm直径的圆形伤口。测量伤口 闭合所需的时间。尽管事实上FAP在伤口愈合期间过量表达，但本发 明的組合物不干扰伤口愈合过程。在经治疗的BALB/c小鼠("=4)的背 部施以约3 mm直径的圓形伤口之后，观察到经治疗小鼠和未治疗小 鼠之间的伤口愈合无显著差异。为了进行组织学分析，在检查之前7、 14、 21天对经治疗小鼠施加伤口。由小鼠病理学家进行皮肤活组织检 查，以及检查26种器官和组织。
用基于FAP的DNA组合物的预防性治疗抑制原发性肿瘤生长。 在用对照疫苗(实施例1)、DNA组合物l(实施例1)或DNA组合物2(实 施例2)按1周间隔3次治疗中的最后一次之后的10天，如上所述用 CT26结肠癌细胞在皮下攻击或用D2F2乳腺癌细胞原位攻击不同组的 BALB/c小鼠("=8)。本发明的DNA组合物抑制多重耐药性CT26细胞 (图2fl)、以及耐药性D2F2细胞(图2^的原发性肿瘤生长。编码FAP、CCL21、和IL-2的组合的DNA组合物2,对抑制原发性肿瘤生长是 近似等效的(图2力。
本发明的DNA组合物减少在治疗设置中已确立的转移的生长。 在用约1 x io5 CT26结肠癌细胞初次静脉内接种之后3天和10天，用 实施例1的DNA组合物1治疗的BALB/c小鼠与用实施例1的对照 疫苗治疗的小鼠相比，前者导致实验性肺转移显著减少。相反，对照 组的小鼠显示大范围的转移并在肿瘤细胞接种之后的18天开始死亡 (图^)。相似地，pFAP单独与pCCL21的组合也是近似等效的(图M)。
CD8+T细胞提供有效的抗肿瘤免疫应答。小鼠用DNA组合物 l(实施例l)按1周间隔静脉内(i.v.)治疗3次，并用约1 x 105 CT26细 胞攻击。然后在效应期用抗CD4+或CD8+T细胞抗体、以及抗NK细 胞的抗体对小鼠进行去除其相应的效应细胞处理(图3,分图A)。 CD4+ 细胞和NK细胞的去除不降低pFAP治疗的效杲，表明CD8+ T细胞在 免疫应答中起重要作用。
为了评估用本发明的FAP DNA组合物治疗能够打破外周T细胞 对FAP自身抗原耐受的程度，纯化来自用pFAP或空载体转染的细菌 治疗的动物的CD8+ t细胞。这些细胞然后用经y照射的肿瘤靶细胞 剌激，并与用作为对照的GFP或GFP/pFap瞬时转染的肝脏肿瘤靶细 胞孵育。如图3,分图B所示，根据通过用Hoechst-33342染料对经 pFap转染的靶细胞进行染色的评估，只有从用pFap治疗的小鼠纯化 的CD8+T细胞能够诱导细胞核的凋亡。
经治疗小鼠的脾细胞也用于常规的"Cr-释放试验。为了该目的， 来自用组合物1和对照疫苗治疗的小鼠的脾细胞与用pFap进行逆转 录病毒感染的经Y照射的A31成纤维细胞孵育5天。经刺激的脾细胞 然后与标记的A31-pFap细胞孵育4小时，并计算溶解的百分比。在 耙细胞对效应细胞的比例为1:100和1:25时，来自用组合物1治疗的 小鼠的脾细胞能够比空载体对照显著溶解更多的成纤维细胞(图3,分 图C)。与抗-MHCI类抗体共孵育消除该效应(图3，分图D)。
33在此外的评估中，用组合物1或对照疫苗治疗小鼠3次，然后用
约3x 104 CT26肿瘤细胞攻击，以研究在经pFap治疗的小鼠的胂瘤中 的CD8+T细胞浸润。在3周之后，采集肿瘤，并对单细胞悬浮液中 的CD3+和CD8+细胞染色，并通过FACS分析。当与空载体对照比较 时，用组合物1治疗的小鼠显示肿瘤组织中的CD3+、 CD8+细胞显著 增加(图3，分图E)。
也用抗-CD8 FITC和DAPI核染剂对肿瘤切片染色。使用共聚焦 显微镜，用组合物1治疗的小鼠的肺瘤比用实施例1的对照疫苗接种 的小鼠显示更显著的CD8+细胞浸润(图3,分图F)。总之，这些发现 证明輩巴向FAP的本发明的DNA组合物可以克服外周T细胞对FAP 自身抗原的耐受。
I型胶原表达的抑制增加瘤内的染料吸收。成纤维细胞是I型胶 原的原始来源，已经报道该分子的表达与不同分子量的化合物的瘤 内吸收呈反向相关。为了评价该同样的机制是否能应用至本发明的 DNA组合物，经治疗的疫苗的小鼠的肿瘤切片用抗FAP的抗体(图4， 分图A，上面的照片)或抗I型胶原的抗体(图4，分图A,下面的照片) 染色。用组合物1治疗的小鼠组别与仅用对照疫苗(实施例l)治疗的小 鼠组别相比，在前者中检测到FAP以及I型胶原表达的减少。用相同 抗体染色的这些肿瘤提取物的相应蛋白印迹显示FAP表达减少约 82.63 ± 2.54%(图4,分图B，上面的照片)而I型胶原表达减少约76.36 ±2.01%(图4,分图B,下面的照片)。
然后用大小和结构上不同的三种化合物注射小鼠即如上所述的 萤光素(376Da)(图4,分图C)、伊文思蓝白蛋白(68,500 Da)(图4，分 图D)或化疗药物5-氟尿嘧啶(130 Da)(图4,分图E)。用pF叩DNA组 合物1治疗的小鼠的肿瘤比给予对照疫苗的小鼠的肿瘤显著结合更多 (pO,05)的这些相应的分子。
DNA组合物和化学疗法的联合导致肿瘤排斥。用本发明的DNA 组合物免疫接种与D2F2细胞部分敏感的化学治疗药多柔比星联合，开发了治疗方案(图l,分图C)。用实施例1的对照疫苗、或实施例1
的组合物1治疗BALB/c小鼠("=8)。然后用D2F2乳腺癌细胞原位攻 击经治疗的小鼠。然后在肺瘤攻击之后5、 10和15天用多柔比星或 作为对照的PBS治疗这两组小鼠。如图5，分图A所示，用免疫疗法 (组合物1)或化学疗法单独治疗仅能抑制肺瘤生长、但不能根除。相反， 用组合物1和多柔比星联合治疗的小鼠组不仅显示肿瘤生长的显著抑 制，而且在8只小鼠中的4只中完全排斥肿瘤(图5,分图A)。
在按治疗设置的另 一联合治疗方法中，用D2F2肿瘤细胞静脉内 (i.v.)攻击BALB/c小鼠("=8)。在5天之后待转移一旦确立，就用组合 物l每周1次治疗小鼠。在每次治疗之后一天，用多柔比星静脉内(i.v.) 注射小鼠。该联合治疗导致这些小鼠的寿命超过对照小鼠的3倍，所 述对照小鼠单独用多柔比星或组合物1治疗，并在35 -45天后已经 死亡(图5,分图B)。
本发明的FAPDNA组合物增加多柔比星的瘤内吸收。为了测定 肿瘤组织中的多柔比星浓度，用组合物1以1周的间隔治疗小鼠(n-4) 3次，7天以后用5 x 105 D2F2肿瘤细胞进行攻击，并在16天以后用 多柔比星进行静脉内(i.v.)注射。用液相色谱/质谱法(LC-MS)测定瘤内 的药物浓度。与对照相比，用组合物1治疗的小鼠的组织显示肿瘤中 多柔比星吸收的显著增加(图6，分图A)。这些结果与在用萤光素、白 蛋白和5-氟尿嘧啶治疗的小鼠中观察到的肿瘤的化学渗透一致(图4， 分图C-D)。
针对FAP的DNA疫苗不削弱伤口愈合或损伤正常组织。因为在
伤口愈合期间FAP会过量表达，所以要研究本发明的DNA组合物对 伤口愈合的作用。在经治疗的BALB/c小鼠("=4)的背上施以直径约3 mm的圆形伤口。令人意想不到的是，观察到经治疗小鼠和未治疗小 鼠之间的伤口愈合无显著性差异(图6，分图B)。由小鼠病理学家在不 同的时间点之后对这些伤口的組织学鉴定显示在伤口愈合过程中无 任何定性的异常情况。为了排除由本发明的DNA组合物诱导的任何自身免疫反应，对以下組织和器官进行广泛组织学鉴定皮肤、脑、
脊髓、肌肉、骨、滑膜、心脏、主动脉、肺动脉、胸腺、脾脏、淋巴 结、骨髓、曱状旁腺、肾上腺、肾脏、子宫、阴道、阴蒂腺、舌、肝 脏、肺脏、胰脏、胃、小肠和结肠。观察到与对照小鼠相比没有可辨 别的差异。
上述实施方案的许多变更和修改可以在不脱离本发明新颖特征 的精神和范围下起作用。就本文举例说明的具体实施方案而论，无意 或不应该推断任何限制。
权利要求
1. 包含DNA构建体的DNA组合物，所述DNA组合物有效刺激对抗肿瘤基质细胞的免疫应答，所述肿瘤基质细胞表达成纤维细胞激活蛋白(FAP)，所述DNA构建体编码可在免疫细胞中表达的FAP的至少一个表位且被掺入药学上可接受的载体中。
2. 权利要求1的DNA组合物，其中所述DNA构建体编码人FAP(SEQ ID NO: 2)或与其有至少80%序列相似性且包括人FAP的至少一个表位的蛋白。
3. 权利要求1的DNA组合物，其中所述DNA构建体编码人FAP(SEQ ID NO: 2)。
4. 权利要求1的DNA组合物，其中所述DNA构建体为棵DNA构建体。
5. 权利要求4的DNA组合物，其中所述棵DNA构建体为质粒的形式。
6. 权利要求1的DNA组合物，其中所述DNA构建体净皮掺入减毒的病毒载体中。
7. 权利要求1的DNA组合物，其中所述DNA构建体被纟参入减毒的细菌性载体中。
8. 权利要求7的DNA组合物，其中所述减毒的细菌性载体为减毒的鼠伤寒沙门氏菌(5Wwo"e〃a (v/ /n'mwn'ww,
9. 权利要求1的DNA組合物，其中所述DNA构建体为基本上纯化的DNA，所述DNA具有由SEQIDNO:l组成的多核苷酸序列、或与其具有至少约80%序列相似性的多核苷酸序列。
10. 权利要求9的DNA组合物，其中所述DNA构建体被掺入减毒的鼠伤寒沙门氏菌fSa/mowe〃a 0^p/u'mwn'wm」载体。
11. 权利要求1的DNA组合物，其中所述组合物还包含编码可在免疫细胞中表达的免疫效应蛋白的DNA构建体。
12. 权利要求11的DNA组合物，其中所述免疫效应蛋白为细胞因子。
13. 权利要求12的DNA组合物，其中所述细胞因子为CCL21、IL-2、或CD40LT。
14. 抑制哺乳动物中肺瘤生长或肺瘤转移的方法，所述方法包括给予哺乳动物包含DNA构建体的DNA组合物，所述DNA构建体编少二个表位:且被^"入药学上可接受的载体中；按以下的量给予所述的量。 —、、 。、、U';
15. 权利要求14的方法，其中所述哺乳动物为人。
16. 权利要求14的方法，其中所述DNA构建体被掺入减毒的细菌性载体中。
17. 权利要求16的方法，其中所述减毒的细菌性载体为减毒的鼠伤寒沙'门氏菌(5a/wo"e/Zfl妙/n'm鹏'誰,。
18. 权利要求14的方法，其中所述组合物经口服给药。
19. 抑制哺乳动物中肿瘤生长或肿瘤转移的方法，所述方法包括以下步骤给予哺乳动物包含DNA构建体的DNA组合物；和随后给予所述哺乳动物有效抗肿瘤量的抗肿瘤化疗药物，所述DNA构建体编码可在哺乳动物的免疫细胞中表达的成纤维细胞激活蛋白(FAP)的至少一个表位且被掺入药学上可接受的载体中；按以下的量给予所述的量。 —、' '、、、U,;
20. 权利要求19的方法，其中所述哺乳动物为人。
21. 权利要求19的方法，其中所述化疗药物为多柔比星。
22. 权利要求19的方法，其中所述DNA构建体被掺入减毒的细菌性载体中。
23. 权利要求22的方法，其中所述减毒的细菌性载体为减毒的鼠"f另寒沙、门氏菌^SVz/wo"e〃a /^ A/wwn'wwj 。
24. 权利要求19的方法，其中所述组合物经口服给药。
25. 增加哺乳动物摄取化疗药物的方法，所述方法包括以下步骤 给予哺乳动物包含DNA构建体的DNA组合物；和随后给予所述哺乳 动物有效量的化疗药物，所述DNA构建体编码可在哺乳动物的免疫 细胞中表达的成纤维细胞激活蛋白(FAP)的至少 一个表位且^皮掺入药 学上可接受的载体中，按以下的量给予所述组合物足以在哺乳动物 中刺激对抗表达FAP抗原的细胞的免疫应答的量。
26. 权利要求25的方法，其中所述哺乳动物为人。
27. 权利要求25的方法，其中所述化疗药物为多柔比星。
28. 权利要求25的方法，其中所述DNA构建体被掺入减毒的细 菌性载体中。
29. 权利要求28的方法，其中所述减毒的细菌性载体为减毒的鼠 伤寒沙门氏菌(5"a/,"g〃"妙/n'w,'薩」。
30. 权利要求25的方法，其中所述组合物经口服给药。
31. 质粒载体，其包含编码人成纤維细胞激活蛋白(FAP)的至少一 个表位的DNA构建体。
32. 权利要求31的载体，其中所述DNA构建体编码人FAP (SEQ ID NO: 2)或与其有至少80。/。序列相似性且包括人FAP的至少一个表 位的蛋白。
33. 权利要求31的载体，其还包^^编码免疫效应蛋白的DNA构 建体。
34. 权利要求33的载体，其中所述免疫效应蛋白为细胞因子。
35. 权利要求34的载体，其中所述细胞因子为CCL21、 IL-2、或 CD40LT。
全文摘要
有效刺激对抗肿瘤细胞和肿瘤转移的免疫应答的DNA组合物，该DNA组合物包含编码可在免疫细胞中表达的成纤维细胞激活蛋白(FAP)的至少一个表位的DNA构建体，该DNA构建体被掺入药学上可接受的载体中。该组合物可以编码FAP的单个表位、包含FAP的两个或多个表位的多肽、整个FAP蛋白、或其将刺激所需免疫应答的任何部分。在一个优选的实施方案中，该组合物还包括编码免疫效应蛋白例如细胞因子的DNA构建体。本发明的DNA组合物可以单独使用或与化疗药物联用，以治疗疾病例如肿瘤和肿瘤转移。
文档编号C12Q1/68GK101506381SQ200780030551
公开日2009年8月12日 申请日期2007年6月21日 优先权日2006年6月21日
发明者A·G·尼萨默, J·A·克吕格尔, M·勒夫勒, R·A·雷斯菲尔德 申请人:斯克里普斯研究学院