专利名称：：用于引发肿瘤细胞致死的核酸的制作方法
技术领域：
：本发明属于寡核苷酸/DNA片段在生物学和治疗学应用中的用途领域，更具体的是属于核酸干扰DNA损伤信号传导和修复途径，特别是双链断裂(DSB)修复的非同源性末端连接(NHEJ)途径的领域。本发明涉及用作引发接受抗癌治疗的肿瘤的细胞致死的工具的核酸。单独的放疗、化疗，或者结合手术是对抗人类癌症的主要治疗手段。电离辐射直接或间接地引起双链DNA断裂(DSBs)，并引发细胞/组织死亡(坏死或凋亡)。电离辐射的细胞毒性效应形成了广泛应用于人类癌症治疗的放疗的基础。某些肿瘤(例如，恶性胶质瘤)的辐射抗性和辐射对附近正常组织的副作用(例如，在乳腺癌和子宫颈癌的治疗中)目前限制了放疗的功效。在过去几年中，很多研究集中与电离辐射应答有关的生物学机制，是为了洞察肿瘤细胞的放射敏感性或放射抗性现象之下的复杂性。对于精细调节对电离辐射的应答的不同途径的理解是迈向鉴定新的药物和疗法的分子靶的重要一步，所述新的药物和疗法与放疗结合，可以提高从对辐射具有高度抗性的肿瘤例如脑或头和颈部肿瘤痊愈的机会。化疗药剂的使用可引起DNA损伤，包括直接或间接的DSBs。最广泛使用的化疗药剂(化学细胞毒素)家族的实例为拓扑异构酶I或II的抑制剂(喜树碱/拓扑替康，表柔比星/依托泊苷)(camptothecin/topotecan，epirubicin/etoposide)，DNA交联剂(顺铂/卡铂/奥沙利铂)(cisplatin/carboplatin/oxaliplatin)，DNA烷基化试剂(卡莫司汀/卡达巴嗪)(carmustine/dacarbazine)或抗新陈代谢的试剂(5-氟尿嘧啶/吉西它滨/卡培它滨)(5-fluorouracil/gemcitabine/capecitabine)，以及有丝分裂纺锤体的抑制剂(紫杉醇/多西它赛/长春瑞滨)(paclitaxel/docetaxel/vinorelbine)。生物细胞毒素(单克隆抗体，细胞因子/激酶抑制剂，免疫治疗剂/疫苗)开发的新近进展证明了它们对一部分肿瘤具有有效性和特异性。但是它们经常与化学细胞毒素结合使用。尽管在新的细胞毒素药物开发上有很多进展，对化疗的耐药性仍然是在癌症治疗中主要的临床忧虑。对涉及药物吸收/流出、代谢降解、靶的突变、增强的修复、细胞死亡(细胞凋亡和坏死)的信号传导的耐药机制的理解对于保证化疗的功效是非常重要的并提高了治疗指数，尤其是抗性肿瘤的治疗。化疗与放疗相结合被广泛应用于癌症的治疗。虽然仍未完全阐明，细胞毒素作用的生物学基础依赖于细胞机制，例如细胞周期或者DNA损伤，它们在射线诱导的细胞死亡中也是重要的因素，在癌症治疗中，通过组合不同的治疗方法，引起加和的或者甚至更好的协同效益。在过去十年中，在本领域展开了许多研究。有人开始对辐射应答的信号转导的复杂性进行描述。电离辐射靶向的特别重要的基因是那些参与调节辐射诱导的致死机制，如细胞凋亡或DNA修复的基因。电离辐射诱导的细胞死亡主要依赖于DSBs的修复。有两个机制参与这些损害的修复非同源性末端连接(NHEJ，不依赖序列的途径)和同源重组(HR，依赖序列的途径)(Jackson的综述，2002)。靶向参与这两种主要的DSB修复途径的基因导致少许或者中等的辐射敏感度，这依赖于使用的方法和癌症细胞系(Belenkov等，2002；Marangoni等，2000；Ohnishi等，1998)。Ku70和Ku80，DNA-PKsc蛋白在辐射或化学诱导的DNA损伤的修复中起重要作用。如果损伤不能被及时修复，则细胞死亡。因此，它们是使靶细胞和组织对放疗和化疗敏感的令人感兴趣的分子靶。已经设想并实施了很多方法用于抑制这些参与NHEJ途径的关键蛋白(Ku70/Ku80，DNA-PKsc等)，而NHEJ途径被认为在哺乳动物细胞中占主导地位的1)PI3K的抑制剂(磷脂酰肌醇-3-激酶)(即DNA-PKsc，PARP-1，ATM，ATR)(Boulton等，2000；Durant&Karran，2003；Willmore等，2004；Vauger等，2004)2)负显性(Negativedominant)和肽(KU80的C-末端)(Marangoni等，2000；Kim等，2002)3)单链抗体可变片段(scFv)(DNA-PKsc)(Li等，2003)4)RNA适体(SELEXRNA结合Ku)(Yoo&Dynan，1998)5)反义(Antisense)(Ku70，Ku80，DNA-PKsc)(Li等，2003b；Marangoni等，2000；Sak等，2002)6)siRNA(DNA-PKsc)(Peng等，2000).尽管付出了这些极大的努力，DNA修复基因靶向与癌症治疗的结合迄今为止仍处于早期实验阶段，尚未有临床研究显示任何被证实效益。值得注意的是，以上描述的方法具有共同的特征它们靶向参与可能具有旁路的复杂级联途径(例如NHEJ)的单一的效应器(蛋白)。本发明的发明人发现，通过使用化学修饰的或者非双链的核酸分子，充当断裂的DNA片段的模拟物并被识别为DNA损伤治疗诱导的DSB位点，可以提高肿瘤针对直接的或间接的DNA损伤抗癌治疗的敏感度。经上述修饰的分子应该有非复制结构。因而本发明的一个目的是为了提供这样的双链核酸片段，下面也称“DNA修复诱导的致死”(简称DRIL)分子，可以增强治疗抗性的肿瘤对放疗和化疗的应答。更具体的是，本发明旨在提供与能引起DNA的直接或者间接DSBs的物理和化学药剂组合应用的新的DRIL分子，并提供一种治疗癌症的方法，将上述DRIL分子的应用与直接或间接引起DNA损伤的抗癌疗法结合使用。本发明的另一个目的涉及DRIL分子在制备用于提高癌症疗效，尤其是用于对放疗和/或化疗具有高度抗性的肿瘤的抗肿瘤治疗佐剂中的应用。本发明的DRIL分子是参与NHEJ途径(不依赖序列的途径)的蛋白，尤其是Ku蛋白的底物，包括一个至少4-10000个碱基对(bp)，尤其是4-1000bp的不依赖序列的主链。它们具有如下的特性-当与药物载体一起使用时，双链DRIL分子可以被细胞/组织体吸收到细胞核中；-DRIL分子的游离末端可被参与双链断裂修复和损伤信号传导的DNA结合蛋白所识别；-DRIL分子的游离末端可被上述的酶整合到肿瘤细胞的基因组DNA中。根据DRIL分子通过NHEJ途径起作用的机制，除应用上的考虑以外，它们的长度本身没有限制，但必须包括至少4bp，更优选至少8bp。因而，本发明的DRIL分子优选8-500bp，最优选16-200bp。特别优选的DRIL分子包括16-100bp，更优选24-100bp。本发明的DRIL分子，有一个天然的磷酸二酯主链，或者一个化学修饰的磷酸二酯主链，或者带有化学基团或化学基团混合物的另一主链，只要所述修饰的寡聚物保持了作为参与NHEJ途径的蛋白，尤其是Ku蛋白，和涉及DSB损伤信号传导途径的蛋白的底物。优选地，化学修饰的目的在于，在如果发生了基因组整合后，给DRIL分子赋予稳定性和/或阻止它们的进一步的复制(诱变效应的可能原因)。也可以用糖模拟物如′-O-烷基核糖、2′-O-烷基-C4′支链核糖、环己基或者其他的碳环或己糖醇来取代戊糖呋喃糖基。它们可以被制备成线性的或者发夹双链核酸，其中的环可以是核酸，或者是本领域技术人员熟知的其他化学基团，优选连接物，诸如六甘醇或者四脱氧胸苷酸(T4)。本发明的DRIL分子可由至少一个游离的dsDNA末端制成；上述的游离末端可以是平末端或者5′-/3’-突出的末端，并包括修饰的核酸主链或者本领域技术人员所熟知的其他的化学基团或化学基团的混合物。优选的片段在每条链的末端包括一个或者几个化学基团。优选的化学基团包括硫代磷酸酯。或者，优选的片段具有3′-3′核苷酸键。本发明的其他修饰主链包括甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、吗啉代核酸、2′-O，4′-C亚甲基/亚乙基桥连的锁核酸，肽核酸(PNA)，和短链烷基，或环烷基糖间键合(cycloalkylintersugarlinkages)或短链杂原子或长度可变的杂环糖内键合(intrasugarlinkages)，或本领域技术人员熟知的任何修饰的核苷酸。美国专利5,677,437描述了杂芳香(heteroaromatic)的寡核苷键合(linkages)。氮连接物或含氮基团也可用于制备寡核苷酸模拟物(美国专利5,792,844和5,783,682)。美国专利5,637,684描述了氨基磷酸酯和硫代磷酸酰胺寡聚化合物。还预见了具有吗啉代主链结构的寡核苷酸(美国专利5,034,506)。在其他的实施方案中，诸如肽核酸(PNA)主链，寡核苷酸的磷酸二酯主链可以被聚酰胺主链取代，碱基直接或间接地结合到聚酰胺主链的氮杂氮原子上。其他人工合成的寡核苷酸可包含取代的糖部分，该糖部分在2′位置上包括下述的其中一个基团OH，SH，OCH3，SCH3，F，OCN，OCH2CH2OCH3，O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n代表1到约10；C1到C10的低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或者芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-；S-；或N-烷基；O-，S-，或N-链烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基(polyalkylyamino)；取代的甲硅烷基；或者能提高寡核苷酸的药代动力学和/或药物动力学性质的基团，和其他的具有类似性质的取代基。DRIL分子本质上是基于天然核苷酸，2′-脱氧核苷酸或2′-核糖核酸，并且任选包括一个或者几个修饰的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶之外的核碱基。除常见碱基外，合适的核碱基有例如C5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、假异胞嘧啶、C5-丙炔基尿嘧啶、N7-脱氮鸟嘌呤、N7-糖基化鸟嘌呤，或α端基异构体，或其他修饰的核碱基或碱性残基。当被辐射或被化疗处理时，将存在于组织或身体的细胞中的化学修饰的DRIL分子将会在DSB位点整合到基因组DNA中，或者通过细胞的DNA修复机制如NHEJ，被识别为由电离辐射诱导的DSB位点。因而，他们将被DSB修复蛋白结合，整合到断裂的染色体中，或者使修复系统饱和。根据本发明的一个实施方案，上述的DRIL分子此外包括至少一个插入元件，其阻碍DNA复制、DNA修复、或损伤信号传导过程。所述的非复制元件可以整合到双链片段的内部位置或者末端。它(它们)可包括a)不能作为DNA复制模板的单元，例如聚乙二醇链，优选六乙二醇链，或任何碳氢链，最终被一个或多个杂原子所阻断和/或取代，例如氧、硫、氮、或包括一个或多个杂原子的杂原子或杂环基团；b)作为阻滞元件的单元，不受DNA聚合酶或核酸外切酶的影响，诸如任何3′-修饰的核苷酸，或本领域技术人员熟知的其他核苷酸；c)天然的寡核苷酸，例如Tn，当用于发夹片段的环中时，优选四脱氧胸苷酸(T4)。上述的链通过化学合成、半生物合成或者生物合成、一些扩增的方法，然后用一些提取和制备方法，并进行一些化学修饰来进行制备。对培养的细胞、裸鼠的异种移植肿瘤和遗传改良的小鼠进行的实验显示上述的DRIL分子引发接受放疗和/或化疗的肿瘤的细胞/组织致死。因此本发明也涉及与DNA阻断治疗结合使用的佐剂成分，所述成分包括如上定义的DRIL分子，连同药物载体，以有效量导入肿瘤细胞的细胞核中。本发明也涉及提高肿瘤对抗癌症疗法的敏感度的方法，它包括，联合，-将如上定义的DRIL分子导入癌症细胞/组织，以及-在细胞中诱导，通过DNA损伤方法使DNA断裂。根据本发明的一个实施方案，在上述的导入步骤中使用了转染剂。基于体内研究中使用的方案，本发明提供了合理的方法，以建立DRIL分子与放疗或化疗结合使用的临床方案。任何一种方案下的合理性在于当发生DNA损伤事件时，DRIL分子应该被递送到细胞核中。因此，DRIL分子必须先于放疗几个小时施用，然而，它们可以随同化疗药剂一起施用，这依赖于施用模式和每种成分的药代动力学。对于小鼠的方案包括，辐射之前几小时施用DRIL分子，例如5小时，且每周3次，超过6周治疗的辐射总剂量相当于30Gy。分成几部分进行辐射尤其有效。优选地，所述方法包括将用DRIL分子治疗与双倍的化疗结合。例如5-FU和CPT11一起被注射3次，连续三天，休息的间隔为一整周。或者用DRIL分子的治疗与放疗结合。本领域技术人员很容易将其适用于人类，特别是取决于病人的体重。在一个优选的实施方案中，DRIL分子是化学修饰的DRIL分子，如上述定义及人类治疗中其他实践的DRIL分子。在另一个实施方案中，DRIL分子不是化学修饰的，并与天然的核酸片段对应，但是显示化学修饰片段的特征，尤其是具有所述化学修饰的DRIL分子的碱基对的数目和性质。更具体的是，通过电离辐射(放疗)或化学反应(化疗)实现了DNA链的断裂。这样的方法是一种新的治疗佐剂与DNA损伤疗法结合的针对肿瘤的方法。本发明也涉及所述非化学修饰的DRIL分子在制备用于治疗肿瘤，尤其是对放疗和/或化疗高度抗性的肿瘤的抗肿瘤药物中的应用，，所述药物与DNA阻断治疗尤其是放疗或化疗结合使用。体内，化学修饰或非修饰的DRIL分子同适当的载体一起，通过适当的途径给药，例如口服、静脉内、或肿瘤内给药、或皮下注射、或其他途径。本发明的其他特征和优点将在如下的实施例中给出，参考图1到5及表1和2，上述的图分别代表图1.1在Hep2细胞的不同量的核提取物存在下，对不同的32p放射-标记的DRIL分子上进行的条带迁移分析；图1.2在含有Hep2细胞核提取物中的蛋白不同的32p放射-标记的DRIL分子的延滞条带中鉴定Ku蛋白的存在；图2.1在用γ-射线对DRIL分子进行辐射后，Hela细胞的克隆发生存活率分析；图2.2携带新霉素抗性编码基因的线性质粒片段(2μg)被DRIL32-PEG分子抑制其辐射增强的不合理整合；图2.3Hela细胞在辐射后被带荧光的DRIL32-FITC分子转染；图3.1未处理的GMA32细胞，被脂质转染胺单独转染，或被不同的DRIL分子通过脂质转染胺转染，但未经进一步的辐射或有丝分裂抑制剂处理的细胞的FACS分析；图3.2在未处理的GMA32细胞，被脂质转染胺单独转染，或被不同的DRIL分子通过脂质转染胺转染的细胞中，通过γ-H2AX标记免疫检测DNA修复灶；图3.3未处理的GMA32细胞，被脂质转染胺单独转染，或被不同的DRIL分子通过脂质转染胺转染，但未经进一步的辐射或有丝分裂抑制剂处理的细胞的p53的15位丝氨酸残基的磷酸化状态的Western印迹分析；图3.4未处理的和经过辐射或不同的有丝分裂抑制剂处理的GMA32细胞的克隆发生存活率；图4异种移植的人喉肿瘤在小鼠中的生长，监控接受治疗或不接受治疗的肿瘤在时间t时的体积与最初体积的比值(Vt/Vi)；图5.1在K-RasV12G×Apc1638N转基因小鼠中诱导的消化道肿瘤治疗的化学致敏作用；和图5.2通过肉眼观察或组织学检查的每个动物的消化道肿瘤的平均数。图5.3A组方案图解(i.p.腹膜内注射；o.口服给药)。B组5μm切片上的DRIL32-FITC的荧光(左)和免疫荧光标记的γ-H2AX(右)的荧光，所述切片来自根据A组的方案处理过的动物的肿瘤组织。下面部分显示了(使用63×镜头)上面部分(使用1O×镜头，白色框)指定区域的放大图。发荧光的DRIL32-FITC和标记的γ-H2AX的colocalization在DAPI复染的细胞核中以亮点出现。一经请求将提供彩图。对裸鼠异种移植的人放射线抗性肿瘤(头和颈，恶性胶质瘤)和转基因小鼠的RasV12G×Apc1638N双突变在消化道中诱导的肿瘤进行分子和细胞学研究，目的是i)评价DRIL分子的生物学活性；ii)通过使用DRIL分子使抗癌疗法敏感而使DNA诱饵法有效；iii)阐明观察到的DRIL作用效果下的分子和细胞机制。这些研究的结果在以下部分被描述和总结(实施例)实施例1DRIL分子的设计、合成和制备设计了两种类型的DRIL分子线性或发夹dsDNA片段。对于发夹DRIL分子而言，一个六乙二醇连接物(缩写为PEG)或一个四脱氧胸苷酸(缩写为T4)被用作环。dsDNA茎的末端通过整合硫代磷酸酯，或3′-3′核苷酸键可以保护其不被3′-核酸外切酶化学降解。原则上，可使用其他化学修饰，条件是能Ku70/Ku80-DNAPKsc结合相匹配(Martensson&Hammarten，2002)。使用不同茎长的DRIL分子，为8bp(DRIL8-PEG)、16bp(DRIL16-PEG)、24bp(DRIL24-PEG)和32bp(DRIL32-PEG)，也使用不同的茎序列。也设计了一个哑铃形的dsDNA片段(DRIL32-2×PEG)作为对照，其两个末端被两个PEG环密封。一些DRIL分子由一个用荧光素(DRIL32-FITC)、花菁3(DRIL32-Cy3)、或生物素(DRIL32-Bt)标记的T而被标记。表1.1和1.2总结了本研究中使用的DRIL分子的序列和化学结构。DRIL分子序列和化学结构DRIL325′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3′3′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5′DRIL32po-PEGDRIL32-PEGDRIL24-PEGDRIL16-PEGDRIL8-PEGDRIL32ss5′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT-3′DRIL32-T4DRIL32-2×PEGDRIL32s33-PEGDRIL32-NH25′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCT3′-NH23′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA5′-NH2DRIL32-FITCDRIL32-Cy3DRIL32-Btt＝荧光素(FITC)，花菁3(Cy3)或生物素(Bt)-标记的T表1.1DRIL分子的序列和化学结构。粗体字母是具有硫代磷酸酯主链的核苷酸。实线代表六乙二醇连接物(PEG)。DRIL32-T4含有T4作为连接物，替代PEG连接物。DRIL32-2×PEG是一个哑铃形(闭合)分子。DRIL32s33-PEG含有一个倒置序列(碱基组成相同但顺序不同)和一个3′-3′键。DRIL分子序列和化学结构DRIL645′ACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCGGATCTACGCACGGTCGTTTGTTCGGTGTTGGCGATCT3′3′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGATGCGTGCCAGCAAACAAGCCACAACCGCTAGA5′DRIL64-PEG5′ACACGGGTGTTGGCTGTCGTTTGTTCGGATCT-ACGCACGGTCGTTTGTTCGGTGTTGGCGTACT3′3′TGCGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-TGCGTGCCAGCAAACAAGCCACAACCGCTAGA5′表1.264-bpDRIL分子的序列和化学结构。粗体字母是具有硫代磷酸酯主链的核苷酸。实线代表六乙二醇连接物(PEG)。所有的DRIL分子通过自动化的固相寡核苷酸合成来制备(Eurogentec，Belgium)。通过变性的反相HPLC纯化。变性毛细管凝胶电泳和MALDT-TOF/LC-MS被用于做质量控制。超过90％的寡核苷酸是全长的。在运输之前所有的样品都被冻干。一经接收，将所有的样品都溶解于双蒸水中。未标记的DRIL分子的浓度在变性条件下(60℃-90℃取决于DRIL分子的热稳定性)通过分光光度法测定(Cantor&Warshaw，1970)。将带有PEG环和3′突出及互补末端的两半发夹退火，并通过DNAT4连接酶(BioLabs)连接，制备哑铃形dsDNA片段(DRIL32-2×PEG)。基于对热力学和动力学的考虑，根据它们的分子量，用如下方案制备DRIL分子的样品-对于双分子的DRIL分子(DRIL32、DRIL64和DRIL64-PEG)溶于双蒸水的每股链的1∶1母液(可能是最高浓度)的混合物必须在90℃加热5分钟，使每股链完全变性。温和地恢复至室温进行退火(样品一般置于水浴中)，并将产生的双链分子等分量贮存于-20℃。-对于单分子DRIL分子(发夹)而言溶于双蒸水的含有200μM发夹DRIL分子的溶液必须在90℃加热5分钟以完全变性。必须通过将样品置于冰水浴(0℃)骤冷却进行退火。等分量贮存于-20℃。实施例2DRIL分子的生物化学分析作为剖析DRIL分子作用机制的第一步，根据标准方案，在Hep2细胞核蛋白提取物的存在下，用不同的32p放射-标记的DRIL分子进行一系列条带迁移分析。一般地，10nM32p放射-标记的DRIL分子在不同浓度的核蛋白(0，10，20，40，80，160和320ng/μl)存在下于30℃温育在TBE缓冲液中10分钟。然后将样品上样到5％丙烯酰胺非变性凝胶上。在95V、4℃电泳2小时。将凝胶干燥，并用磷光成像器扫描(MolecularDynamics)。图1.1显示，除8-bpDRIL8-PEG分子(最短的DRIL分子)外，观察到具有共同的条带(条带1)的较长DRIL分子的高达3条延滞条带。在长DRIL分子存在时出现其他条带。用32-bp长DRIL分子(DRIL32-PEG，DRIL32po-PEG和DRIL32)滴定的Hep2核蛋白提取物的延滞条带谱更加复杂。随着蛋白浓度增加，延滞条带1的强度增加并随后降低。延滞条带2和3的强度作为蛋白浓度的函数增加，直至达到稳定值。用小鼠单克隆抗-Ku70抗体进行结合相互作用和条带迁移分析(SantaCruzBiotechnology)，结果显示，延滞条带1和2包含Ku复合体(图1.2在向胶上上样之前，向结合反应中加入(+)或不加(-)抗-Ku抗体时，线α-Ku显示了Ku复合体。条带以1、2和3编号，在条带的数字上加上星号，代表抗Ku结合之后的迁移)。在加入抗-Ku70抗体后，条带1和2被超迁移至条带1*和2*。很可能是条带1有1个结合至DRIL的Ku70/80复合体，条带2有两个结合至DRIL的Ku70/80复合体。以纯的Ku蛋白进行的对照实验证明了这种解释。注意到加入抗-Ku70抗体后，条带3消失(用DRIL24-PEG和DRIL32po-PEG清晰可见)，表明条带3也含有Ku复合体。Ku蛋白的鉴定明确地显示了DRIL分子与NHEJ机制相互作用。实施例3DRIL分子的体外活性对来自女性子宫颈癌(HeLa)和喉癌(Hep2)的两个放射-抗性的人类癌症细胞系，通过克隆发生存活率分析结合电离辐射，对培养的细胞中DRIL分子的活性进行了研究。3.1)诱导的细胞致死对HeLa细胞转染DRIL分子8小时并以源自137Ce的□-射线进行四次辐射，每间隔2小时辐射一次，每次辐射剂量为0.5Gy(4×0.5Gy)，可以观察到，与非转染的细胞相比，转染细胞克隆发生存活率的显著减少。结果见图2.1，其中的A组给出在DRIL32和DRIL32-PEG存在时，标准化存活克隆数的剂量依赖关系，而B组给出当存在不同的DRIL分子，浓度为83nM时(培养基中的浓度)的标准化存活克隆数。在剂量依赖方式中，实验效果取决于DRIL分子的化学性质。在本分析中，发夹DRIL分子(DRIL32-PEG，DRIL32-T4和DRIL24-PEG)和线性双链DRIL分子(DRIL64-PEG和DRIL64)大大降低了克隆发生存活率。值得注意的是，缺乏游离dsDNA末端(由六乙二醇连接物在两末端加帽)的哑铃形DRIL分子(DRIL32-2×PEG)不显示任何效果。环的化学性质不重要(例如，DRIL32-PEG与DRIL32-T4相比)。这些观察结果表明，一些DRIL分子可以使细胞对电离辐射敏感化。用添加10％血清的MEM进行细胞培养。根据厂商的说明书用Superfect(Qiagene)作为转染剂。以处理过的细胞形成的克隆数量与未处理的细胞形成的克隆数量的比值来评价克隆发生存活率。3.2)DRIL分子对外源DNA的不合理整合的抑制众所周知，电离辐射可促进外源DNA的转染，该过程被称为辐射增强的整合。Hela细胞物被用于本分析。在8小时期间，用2μg的线性质粒(携带新霉素抗性编码基因)以三种不同比值的DNA/superfect(1∶2，1∶5，1∶10)转染细胞。在转染期间，细胞被暴露于不同的辐射方案无辐射，1Gy和2Gy的单一辐射，以及2Gy分为每间隔2小时辐射0.5Gy剂量的电离辐射(4×0.5Gy)。通过对生长在含0.6mg/mlG418的培养基中的NeoR细胞的选择，来检测质粒的整合。分开的辐射方案大大增加了质粒的整合。当将2μg的DRIL32-PEG分子被加到转染混合物中时，可完全破坏辐射增强的整合(图2.2)。本实验表明，需要Ku、DNA-PK和ATM蛋白(Nimura等，2002)的外源DNA的辐射增强的不合理整合如所预期被DRIL分子抑制，其作用机制与DRIL32-PEG分子一样，通过捕获涉及NHEJ途径的蛋白起作用。3.3)DSBs修复的诱导抑制细胞核中DSB损伤可以通过使用标记DNA断裂的γ-H2AX抗体进行免疫检测。大部分的H2AX灶在辐射后迅速出现，并随着DSBs修复过程的推进而消失。在非转染细胞中，在辐射后两小时几乎检测不到H2AX灶。图2.3给出2Gy辐射2小时后Hela细胞被荧光DRIL32-FITC分子转染的结果。左侧实验组由细胞核中γ-H2AX抗体的荧光免疫检测的DRIL32-FITC的荧光(亮点和斑点)和DNA修复病灶的荧光；右侧实验组由γ-H2AX抗体的荧光免疫和DAPI复染检测的DNA修复灶的细胞核的同一图像。左下角的箭头显示细胞核中DRIL32-FITC和γ-H2AX信号的缺乏。右上角的箭头显示共同定位的DRIL32-FITC和γ-H2AX信号。如图2.3所示，被DRIL32-FITC分子转染的Hela细胞中，在辐射(2Gy)2小时后，未修复的DSB断裂持久存在，如DRIL32-FITC及γ-H2AX抗体的加倍的荧光标记所示。值得注意的是，同一培养物中，在未有效转染DRIL32-FITC的细胞中几乎检测不到DSB修复灶，表明这些细胞中完成了DNA修复。转染和辐射方案与上述描述的相似。对于免疫检测，细胞在直径为5cm培养皿内的盖玻片表面生长，以2μgFITC标记的DRIL32-FITC分子用Superfect(Qiagene)根据厂商的说明书进行转染。转染开始后四小时，辐射细胞(2Gy)，然后在培养基中于37℃静置2小时。洗涤3次后，用2％PFA固定细胞10分钟。再洗涤1次后，用在1×PBS、1％BSA中1/100稀释的兔抗-□-H2AX抗体(4411-PC，Trevigen)检测□-H2AX的存在。以1×PBS、0.5％TritonX-100将细胞洗涤3次，然后用在1×PBS、1％BSA中1/100稀释的若丹明结合的山羊抗-兔抗体，在室温温育1小时。通过表面荧光显微术观察细胞。实施例4GMA32细胞系中DRIL分子及它们与辐射或有丝分裂抑制剂结合使用的效果将允许DNA断裂的GMA32中国仓鼠成纤维细胞培养于添加1mM丙酮酸钠、2mM谷酰胺、1×MEM非必需氨基酸、1×青霉素/链霉素和10％马血清的MEM培养基(Gibco)中中。一般，在根据厂商的说明书用脂质转染胺2000(LifeTechnologies)作为转染剂(比值为1∶3)转染不同的DRIL分子(4.5μg)之前24小时，将2×105到4×105的细胞接种到直径为5cm的培养皿中不含抗生素的培养基上。转染结束时，辐射细胞(4Gy)或者以以下有丝分裂抑制剂处理诺考达唑(nocodazole)(200nM)，长春瑞滨(navelbine)(100nM)或紫杉醇(taxol)(200nM)。约16小时后，移去药物，再生细胞。以源自137Ce的γ-射线进行细胞辐射。再生24小时后，收集细胞，用于FACS、western印迹分析或测定克隆发生率(存活率)或每个处理的效果。图3.1显示了未处理的GMA32细胞，由脂质转染胺单独转染的细胞，或由脂质转染胺转染不同的DRIL分子，但未经进一步的辐射或有丝分裂抑制剂处理的细胞的FACS分析。M1期代表在显示细胞死亡的亚-G1期细胞的百分比。只有当双链DRIL32分子和发夹DRIL32-PEG分子存在时，才可观察到大量细胞的死亡，而发夹DRIL16-PEG和单链DRIL32ss分别诱导中度的和中等的细胞死亡。与对照(被脂质转染胺单独转染的细胞)相比，最短的发夹DRIL8-PEG不能引发细胞死亡。本实验用FACScalibur流动细胞计数器来完成(BectonDickinson)。收集细胞，悬浮在1ml预冷的GM缓冲液(6.5mM葡萄糖，137mMNaCl，5.4mMKCl，2mMNa2HPO4，1mMKHPO4，0.5mMEDTA)中，加入3ml预冷的100％乙醇后，贮存于4℃至少2小时。在那个步骤，最后以1×PBS洗涤细胞，然后在PI溶液(50μg/ml碘化丙锭，溶于1×PBS缓冲液的25μg/mlRNaseA)中，在室温下染色30分钟。以Cellquest软件分析了10000个结果，并对细胞集合进行了门控。记录了含有DNA的亚-G1内容物的细胞的百分比。在同样的条件下，在未处理的GMA32细胞，脂质转染胺单独转染的细胞，或被不同的DRIL分子通过脂质转染胺转染的细胞中，由γ-H2AX标记(细胞核中的亮点或斑点)对139位丝氨酸上被磷酸化的H2AX的DNA修复灶的免疫检测。以FITC-DiOC6和DAPI对细胞膜和细胞核进行复染。观察到了DRIL分子的类似效果(图3.2)。本实验表明，双链DRIL32和发夹DRIL32-PEGc均可有效地引发相似的细胞应答，好象细胞核中发生了DNA损伤一样。这为这些DRIL分子可被用于捕获参与通过NHEJ途径的DSB修复的蛋白提供了直观的证据。在用不同的DRIL分子转染之前24小时，使细胞在直径为5cm培养皿的盖玻片上生长，用于免疫检测。转染后一天，在培养基中加入FITC-DiOC6(分子探针)，在37℃保持5分钟(对膜进行复染)。洗涤3次之后，以4％PFA固定细胞20分钟。再洗涤后，用以1/100稀释在1×PBS、1％BSA中的兔抗γ-H2AX抗体(4411-PC，Trevigen)检测139位丝氨酸上磷酸化的H2AX(γ-H2AX)。用1×PBS、0.5％TritonX-100洗涤细胞3次，然后用以1/100稀释在1×PBS、1％BSA中的山羊抗-兔抗体Alexa594(分子探针)在室温温育1小时。通过表面荧光显微镜术观察细胞。为寻找DNA损伤信号传导的证据，进行了进一步的实验。蛋白p53是一种已知的通过改变其磷酸化状态，介导DNA损伤的信号传导和调整适当的应答(DNA修复、细胞凋亡等)的主要蛋白。尤其是，15位丝氨酸残基的磷酸化参与它与起反馈控制作用的MDM2蛋白的相互作用。因此，通过Western印迹来评价p53的15位丝氨酸的磷酸化状态。图3.3显示，当细胞被双链DRIL32或发夹DRIL32-PEG分子转染时，p53的15位丝氨酸被高度磷酸化，然而，较短的发夹DRIL16-PEG诱导中等的磷酸化。最短的DRIL8-PEG和单链DRIL32ss分子均不能诱导p53蛋白的15位丝氨酸的显著磷酸化。本实验提供了额外的证据，证明双链DRIL32和发夹DRIL32-PEG在GMA32细胞中的存在，被检测作为DNA损伤，并给转导蛋白应答诱导信号，如p53蛋白磷酸化，这很可能通过ATM激活途径进行。使细胞溶解在Laemmli缓冲液中，用于Western印迹分析。将等量的溶解产物溶解在12％的聚丙烯酰胺凝胶中。将蛋白转化到硝化纤维膜上，在用含5％非脱脂牛奶的TBST缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，0.1％Tween20)稀释500倍的抗-p53Ser15的抗体(9284，细胞信号传导)温育过夜前，以5％脱脂牛奶封闭(1小时)。然后用在TBST中以1/5000稀释的辣根过氧化物酶-结合的山羊抗-兔IgG次级抗体(PO448，Dako)温育印迹。用增强的化学荧光(RPN2106ECL，Amersham)来检测蛋白-抗体复合物。通过克隆发生率(克隆存活率)分析来评价DRIL分子在GMA32细胞中的放射致敏化作用和化学致敏化作用的效果。图3.4显示，在以双链DRIL32或发夹DRIL32-PEG分子转染的GMA32细胞中，观察到了对4Gy辐射的放射致敏化作用。另外，在以双链DRIL32或发夹DRIL32-PEG分子转染的GMA32细胞中，当它们被有丝分裂抑制剂(200nM诺考达唑(nocodazole)，100nM长春瑞滨(navelbine(vinorelbine))或200nM紫杉醇(taxol(paclitaxel)))处理时，也能观察到化学致敏化作用。这些药物阻断了微管的聚合作用或解聚作用，也可间接诱导DNA断裂。对细胞进行计数之后，制备一系列稀释物，将不同数量的细胞接种到直径为5cm培养皿中，用于克隆发生率分析。细胞数在100-200(对照细胞)到3000(被转染的或/和已处理过的细胞)间波动。10天以后，用4％多聚甲醛固定(20分钟)细胞(形成克隆)，然后用亚甲基蓝染色(15分钟)，对每个平皿上(三个重复)的克隆进行计数。实施例5裸鼠中异种移植的人肿瘤的治疗的放射致敏化作用通过使用由皮下注射放射抗性的细胞系(来自喉癌的Hep2)或肿瘤片段(先前通过皮下注射来自恶性胶质瘤的U87细胞系而得到的)而异种移植有人类肿瘤的裸鼠，与放疗相结合来评价DRIL分子的体内活性。为了建立体内原理的证据，主要对异种移植了放射抗性的人喉肿瘤的小鼠进行了研究。用源自137Ce的γ-射线进行辐射，为了实行对肿瘤的局部辐射，对小鼠采取适当的保护。典型的分析条件包括，在辐射之前5小时，根据厂商的说明书，肿瘤内注射适量的1nmoleDRIL分子与转染剂(阳离子树枝状聚合物(dendrimer(Superefct，Qiagene))，双十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS，Polyplustransfection)，聚乙烯亚胺(polyethyleneimine(PEI，PolyplusTransfection)))。在4-5周内，辐射的总剂量为30Gyi)3×2Gy/周(大约每两天一次)；ii)5Gy/周；iii)15Gy/2周。每周测量肿瘤的大小2-3次。辐射和肿瘤内注射MEN培养基(DRIL稀释缓冲液)的处理，被用于作为无DRIL(MEM)的辐射处理的对照。计算肿瘤体积(V＝(a+b2)/2，其中a＝长度，b＝宽度)。以时间t测量的体积与最初体积的比值(Vt/Vi)作为肿瘤发展的指标。跟踪小鼠直至100天。至少测试了4个独立的系列，每个系列有6只动物。结果见图4(A组未处理组(n＝38)；B组对照组，20μ1培养基(MEM)+3×2Gy/周的辐射(n＝30)；C组1nmole(20μg)DRIL32-PEG+3×2Gy/周的辐射(n＝35)。MEM或DRIL32-PEG在辐射之前5小时通过肿瘤内注射提供。每两天提供一次分开的辐射剂量(2Gy)，每周3次。处理持续5周，总辐射剂量为30Gy。圆点代表每只小鼠的肿瘤体积的时间进程。实线是最好的多项式拟合。D组显示肿瘤体积(Vt/Vi)＜5)增大的所有小鼠的Kaplan-Meyer图。对于3×2Gy/周辐射(C组，n＝5)的DRIL32-PEG组积累了大量的数据，与对照组未处理的(A组，n＝38)，MEM+3×2Gy(B组，n＝30)相比清楚地显示了放射致敏化作用。DRIL32-PEG+3×2Gy对MEM+3×2Gy组的Man和Whitney统计检验得出p值＝0.00067。在肿瘤体积(Vt/Vi＜5)比最初的体积小5倍(D组)的小鼠的Kaplan-Meyer图上观察到了同样的趋势。为了阐释DRIL分子的分子特征和体内活性的最佳方案，随后对异种移植了人喉肿瘤的小鼠进行了进一步的研究。从研究的组中得到的数据与生物化学和体外研究中(比较实施例2，3和4)观察到的DRIL分子的分子特征一致。另外，还表明1)回顾人类的临床方案，把辐射分成几部分，每周3×2Gy，产生最好的放射致敏化作用；2)放射致敏化作用是剂量依赖性的1nmole(20μg)DRIL32-PEG＞0.3nmole(6μg)DRIL32-PEG，0.1nmole(2μg)DRIL32-PEG时无效；3)放射致敏化作用依赖于肿瘤内注射DRIL32-PEG和电离辐射之间的停留时间5小时＞＞1小时；4)根据厂商的说明书DRIL分子必须与转染剂(superfect，DOGS或PEI)一起使用。肿瘤横切片的组织染色和磁共振成象显示，在DRIL分子与放疗的结合治疗后，出现了坏死。在异种移植了人类恶性胶质肿瘤的小鼠中也能观察到放射致敏化作用。恶性胶质是最高级别的脑瘤，其特征为发展异常迅速，很快导致死亡，对放射和化疗具有抗性。衍生自人类恶性胶质瘤的2-3百万的U87细胞首先通过皮下注射到裸鼠中。然后取出移植的肿瘤，随后通过皮下移植大约8mm3恶性胶质肿瘤用于接种其他裸鼠。表2显示了异种移植了人类恶性胶质肿瘤的裸鼠的实验系列的数据。通过肿瘤内注射接受了DRIL32-PEG(1nmole)和辐射(1×15Gy/周或3×5Gy/周，随后休息一周，然后进行第二个治疗周期，电离辐射的总剂量为30Gy)的小鼠中，在治疗开始后25天，50％小鼠的肿瘤体积＜4cm3，然而，100％对照组(不治疗或辐射并注射盐溶液(PBS))小鼠的肿瘤体积大大超过4cm3，在处理结束之前，根据目前的动物伦理规则，在本分析结束时将他们处死。分析组在第25天肿瘤体积＜4cm3的(异种移植的恶性胶质瘤)小鼠的数量(每组6只小鼠)未处理的0/6PBS+1×15Gy/周0/6DRIL32-PEG+1×15Gy/周3/6PBS+3×5Gy/周0/6DRIL32-PEG+3×5Gy/周3/6表2由DRIL32-PEG(1nmole/肿瘤内注射)分析裸鼠异种移植的人恶性胶质瘤的放射致敏化作用。使用了两种辐射方案1×15Gy/周，或3×5Gy/周，随后休息一周，再进行第二个辐射周期。总辐射剂量为30Gy。对照组为未处理的或接受盐溶液(PBS)注射的组。总之，异种移植到裸鼠的两种人类放射抗性肿瘤(喉和恶性胶质瘤)的发展速度可以大大降低，这提供了证据证明，DRIL分子可以有效地使这些迅速扩散的放射抗性肿瘤对放疗的作用变得敏感。因此，在体内得到了DNA诱饵方法的原理的证据。实施例6K-RasV12G×Apc1638N转基因小鼠诱导的消化道肿瘤治疗的化学致敏化作用选择了一种内源性的小鼠肿瘤模型来评价DRIL分子使抗癌化疗致敏化的能力。为此目的，使用了携带K-RasV12G和Apc1638N突变的转基因小鼠。通过两只转基因小鼠的繁殖得到一只携带由小鼠绒毛蛋白启动子(pVill/K-RasV12G)控制的K-RasV12G突变(Janssen等，2002)，另一只含有在一个等位基因中的Apc1638N突变(Fodde等，1994)。具有pVill/K-RasV12G×Apc1638N突变的转基因小鼠在大约5月龄时，在消化道中生成了自发的肿瘤，并且迅速死亡。在它们的平均12周龄时，根据图5.1A组所示的方案，接受化疗(5FU+CPT11)与DRIL32-PEG相结合的治疗，与单独的化疗相比较。本方案包括3个治疗周期。每个周期包括在腹膜内注射0.6mg5FU和0.6mg的CPT11，连同口服施用0.1mg的DRIL32-PEG，每周3次，随后休息一周。5FU(5-氟尿嘧啶，Teva)以浓度为50mg/ml配置在0.9％NaCl溶液中。CPT11/Irinotecan(Campto，Aventis)以浓度为20mg/ml配置在0.9％NaCl溶液中。跟踪小鼠的健康状态和存活情况直至其死亡。没有观察到由于DRIL分子而产生了额外的毒性效应的临床迹象。结果见图5.1。A组在平均12周龄时，对三组的K-RasV12G×Apc1638N转基因小鼠实施的治疗方案对照组(未处理的)，以5FU+CPT11处理的组，以5FU+CPT11和DRIL32-PEG.处理的组。进行三个周期的治疗。每个周期包括在腹膜内注射0.6mg5FU和0.6mgCPT11，连同口服施用0.1mgDRIL32-PEG，每周3次，随后休息一周。每组小鼠的数量显示在括号中。终点是存活的时间；B组三组的存活曲线的Kaplan-Meyer图；C组B组中所示的三组的存活时间的中值。尽管是简化的组，与单独接受化疗(存活中值＝173天)和对照组(存活中值＝175天)(B和C组)相比，在接受化疗(5FU+11CPT)与DRIL32-PEG相结合的治疗组中可以观察到存活时间的显著提高(存活中值＝226天，p值＝0.2)。为了提高统计显著性，目前正在进行补充分析以增加5FU+CPT11+DRIL32-PEG和5FU+CPT11组的数目。为了估计每只动物肿瘤的平均数，在治疗结束后两周(平均18周龄)，处死一系列的小鼠。通过肉眼观察和组织学检查的检查肠(用Hematoxyline-Eosine-Safran进行标准染色)。结果见图5.2。每组动物的数量显示于括号中。在图5.1A组中所示的方案完成后两周，将所有的小鼠处死。对照组(未处理组，n＝101)的平均数为30.8/动物。两种检查结果一致显示，与单独接受化疗的组(n＝7)相比，接受5FU+CPT11与DRIL32-PEG(n＝8)相结合的组的肿瘤数量显著减少(＞30％)(图5.2)。值得注意的是，对照组(未处理组，n＝101)的平均数为30.8/动物。通过免疫荧光染色法分析由用荧光素标记的DRIL分子(DRIL32-FITC)和5FU+CPT11处理的动物制备的肿瘤样品。在回顾体外发现(比较实施例3.3和4)中，H2AX标记的灶与荧光DRIL分子共染色。图6.3显示一个补充的分析，其中18周龄的K-RasV12G×Apc1638N转基因小鼠由化疗(5FU+CPT11)和DRIL32-FITC连续治疗3天，在完成最后一次治疗2小时后被处死，如A组所示。取出肠，用PBS洗涤。然后对肿瘤组织取样并冻在-80℃。通过低温恒温器制备来自冷冻肿瘤组织的5μm的组织学样品，用于分析。用以1/500稀释在PBS中的多克隆兔抗-γ-H2AX抗体(Trevigen)，然后用以1/200稀释在PBS中以花菁3(Jackson)标记的山羊抗-兔抗体免疫萤光检测DNA修复灶。样品也以DAPI(Sigma)复染。通过表面荧光显微术观察样品。发现DRIL32-FITC的荧光异质地散布于肿瘤组织(腺结构之间的上皮细胞和基质)，并有优选的核定位(图6.3，B组，左图)。γ-H2AX位点发现相似的图谱(图6.3，B组，右图)。观察到的共定位的DRIL32-FITC和γ-H2AX信号几乎差不多。总之，存活率的提高和每只动物肿瘤数量的减少，一致性地显示了携带K-RasV12G×Apc1638N突变的转基因小鼠的消化道肿瘤的治疗被DRIL分子(DRIL32-PEG)引起化学致敏化作用的证据。对被处理动物的肿瘤组织的深入分析为DRIL分子参与DNA修复过程提供了证据。应该指出的是，本研究中DRIL32-PEG分子的口服施用不包括任何转染剂。总而言之，生物化学和体外的数据明显符合DRIL分子的作用机制，即通过参与经NHEJ途径的DSB修复和由直接或间接DNA损伤(电离辐射和化疗剂)引起的修复信号转导途径起作用。由于NHEJ途径的性质(不依赖序列的途径)，对DRIL分子的序列和长度没有限制(Jackson，2002；Barnes，2001，Downs&Jackon，2004)。体内的研究证实了小鼠的肿瘤被DRIL分子引起有效的放射和化学致敏化作用。总之，所有的数据一致性提供了证据支持DNA诱饵方法的概念，描绘了DRIL分子的分子特征。参考文献Barnes，D.E.Non-homologousendjoiningasamechanismofDNArepair.Curr.Biol.(2001)11，R455-7.BelenkovAI，PaiementJP，PanasciLC，MoniaBP，ChowTY.AnantisenseoligonucleotidetargetedtohumanKu80messengerRNAsensitizesM059Kmalignantgliomacellstoionizingradiation，bleomycin，andetoposidebutnotDNAcross-linkingagents.CancerRes.(2002)，62，5888-96.BoultonS；KvleS；Drkacz，R.W.Mechanismsofenhancementofcytotoxicityinetoposideandionisingradiation-treatedcellsbytheproteinkinaseinhibitorwortmannin.Eur.JCancer(2000)，36，535-41.Cantor，C.R.；Warshaw，M.M.；Shapiro，H.Oligonucleotideinteractions.III.Conformationaldifferencesbetweendeoxy-andribodinucleosidephosphatesBiopolymers(1970)，9，1059-77.Cary，R.B.；Peterson，S.R.；Wang，J.T.；Bear，D.G.；Bradbury，E.M.&Chen，D.J.DNAloopingbyKuandtheDNA-dependentproteinkinase.Proc.Natl.AcadSci.USA(1997)94，4267-4272.Downs，J.A.；Jackson，S.PAmeanstoaDNAendThemanyrolesofKu.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.(2004)，5，367-78.Durant，S.；Karran，P.Vanillins--anovelfamilyofDNA-PKinhibitors.NucleicAcidsRes.(2003)，31，5501-12.Fodde，R.；Edelmann，W.；Yang，K.；vanLeeuwen，C.；Carlson，C.；Renault，B.；Breukel，C.；Alt，E.；Lipkin，M.；Khan，P.M.Atargetedchain-terminationmutationinthemouseApcgeneresultsinmultipleintestinaltumors.ProcNatlAcadSciUSA.(1994)，91，8969-73.Jackson，S.P.SensingandrepairingDNAdouble-strandbreaks.Carcinogenesis(2002)，23，687-96.Janssen，K.P.；el-Marjou，F.；Pinto，D.；Sastre，X.；Rouillard，D.；Fouquet，C.；Soussi，T.；Louvard，D.；Robine，S.TargetedexpressionofoncogenicK-rasinintestinalepitheliumcausesspontaneoustumorigenesisinmice.Gastroenterology(2002)，123，492-504.Kim，C.H.；Park，S.J.；Lee，S.H.；AtargetedinhibitionofDNA-dependentproteinkinasesensitizesbreastcancercellsfollowingionizingradiation.J.Pharmacol.Exp.Ther.(2002)，303，753-9.Lee，H.；Su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据权利要求1到3任一项的分子，具有一个线性主链，或由发夹双链核酸构成，所述发夹双链核酸具有包括核酸或诸如六乙二醇或四脱氧胸苷酸基团的化学基团的一个环。5.根据权利要求1到4任一项的分子，具有至少一个游离末端。6.根据权利要求1到4任一项的分子，在每条链的末端或者至少在3′末端链包括一个或几个化学基团。7.根据权利要求6的分子，在每条链的末端或者至少在3′末端链包括一个或几个硫代磷酸酯。8.根据权利要求1到7任一项的分子，其中所述的主链包括甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、吗啉代核酸、2′-O，4′-C亚甲基/亚乙基桥连的锁核酸，肽核酸(PNA)，和短链烷基，或环烷基糖间键合或短链杂原子或长度可变的杂环糖内键合。9.根据前述权利要求任一项的分子，其中的片段是基于天然的核苷酸，为2′-脱氧核苷酸或2′-核糖核苷酸，并任选包括一个或几个修饰的核苷酸和/或除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶以外的核碱基。10.根据权利要求9的分子，其中所述的核碱基选C5-甲基胞嘧啶、尿嘧啶、假异胞嘧啶、C5-丙炔基尿嘧啶、N7-脱氮鸟嘌呤、N7-糖基化鸟嘌呤，或α端基异构体，或其他修饰的核碱基或碱性残基。11.根据前述权利要求任一项的分子，进一步包括至少一个插入元件，其妨碍DNA复制、DNA修复或损害信号传导过程，所述的元件被整合到双链分子的中央或者末端。12.根据权利要求11的分子，包括-a)一个聚乙二醇链，优选六乙二醇链，或任一碳氢链，最终被一个或多个杂原子例如氧、硫、氮、或包括一个或几个杂原子的杂原子或杂环基团所中断和/或取代；-b)一个单元，其是阻断元件，不受DNA聚合酶或核酸外切酶的影响，例如任一的3′-修饰的核苷酸；-c)一个天然的寡核苷酸，诸如Tn，当用于发夹片段的环中时，优选四脱氧胸苷酸(T4)。13.与DNA阻断治疗，尤其是放疗或化疗结合使用的佐剂组合物，所述组合物包括以有效量导入肿瘤细胞的细胞核的至少一种如权利要求1到12任一项所限定的DNA修复诱导的致死分子，连同一种药物载体。14.根据权利要求13的佐剂组合物，其中所述的DNA修复诱导的致死分子与任一载体一起，通过任一合适的途径，诸如口服、或静脉内、或肿瘤内施用、或皮下注射施用。15.天然的双链核酸片段与DNA阻断治疗，尤其是放疗或化疗结合在制备用于治疗肿瘤，尤其是对放射和/或化疗具有高度抗性的肿瘤的抗肿瘤药物中的应用。全文摘要本发明涉及双链核酸片段，包括一个化学修饰的主链，至少4－1000bp，优选8－500bp，最优选16－200bp。公开的分子(DRIL分子)可干扰DNA损伤信号传导和修复途径，特别是双链断裂修复的非同源性NHEJ途径。本发明公开了DRIL分子作为佐剂成分与DNA阻断治疗，特别是放疗或化疗结合，连同药物载体，以有效量导入肿瘤细胞核，以引发肿瘤细胞/组织的DNA修复诱导的致死(简称DIRL)的应用。文档编号A61K31/7115GK1871350SQ200480031278公开日2006年11月29日申请日期2004年10月25日优先权日2003年10月24日发明者马里·迪特雷,孙建生申请人:法国居里学院,法国国家科学研究中心,国家自然博物馆,法国国家卫生及研究医学协会