专利名称：半抗原修饰的肿瘤细胞膜和制备及应用半抗原修饰的肿瘤细胞膜的方法
有关政府基金的参考文献此处描述的本发明是在国家卫生研究所-国家癌症研究所基金号CA-39248的许可或授权下的工作中进行的。美国政府可具有本发明的某些权利。
Fujiwara等人，免疫学杂志，1984132，1571表示，某些半抗原化的肿瘤细胞，即与半抗原三硝基苯(TNP)结合的肿瘤细胞，能在鼠系统中诱导对未修饰的肿瘤细胞的系统性免疫，只要该小鼠首先在无半抗原特异的抑制T细胞的情况下对该半抗原致敏。被治疗小鼠的脾细胞在未治疗的受者动物中完全并特异地阻止了肿瘤的生长。Flood等人，免疫学杂志，1987，138，3573显示，用TNP结合的紫外线诱导的“退化”肿瘤加以免疫的小鼠能排斥TNP结合的“进行性”肿瘤，这是非免疫性的。而且，这些小鼠随后耐受未结合的“进行性”肿瘤的攻击。在另一个实验系统中，Fujiwara等人，免疫学杂志，1984，133，510证明，在环磷酰胺预处理后用三硝基氯苯(TNCB)致敏的小鼠通过对肿瘤细胞的原位半抗原处理能治愈较大(10mm)的肿瘤；随后，这些动物特异地耐受未结合的肿瘤细胞的攻击。
Fujiwara等人的教导由于包括下列的几个原因而不同于本发明A．Fujiwara的组合物中使用的细胞来源于诱导的可移植鼠肿瘤，而不是来源于自发的人类肿瘤；B．Fujiwara的组合物用于免疫预防，而本发明使用免疫治疗；C．Fujiwara的组合物作为局部治疗施用，而本发明的组合物通过全身接种施用；D．Fujiwara的组合物不引起肿瘤退化，而本发明的组合物至少在相当一部分所治疗患者中引起退化和／或使存活时间延长；和E．Fujiwara施用肿瘤细胞，而本发明教导肿瘤细胞膜的施用。
最近证明了存在能与未修饰的组织交叉反应的T细胞。Weltzien及同事显示，从用TNP修饰的同源淋巴细胞免疫的小鼠中产生的I类MHC限制性T细胞克隆能应答MHC相关的、TNP修饰的“自身”肽。Ortmann，B．等人，免疫学杂志，1992，148，1445。另外，已经明确，用TNP修饰的淋巴细胞免疫小鼠引起可在体外显示次级增殖反应和对TNP修饰细胞有细胞毒性反应的脾T细胞的发展。Shearer，G．M．，欧洲免疫学杂志，1974，4，527。由用DNP或TNP修饰的自体细胞免疫引起的、以应答未修饰的自体细胞的淋巴细胞的潜能是相当有意义的，因为这可能与两种临床问题有关1)药物诱导的自身免疫病，2)癌症免疫治疗。对于前者，曾经建议用口服药作为半抗原，它与正常的组织蛋白质结合形成可被T细胞识别的免疫复合物。Tsutsui，H．等人，免疫学杂志，1992，149，706。随后，能发展为自身免疫病，例如，系统性红斑狼疮，甚至在取消不喜欢的药物之后仍持续。这将意味着可与未修饰的组织交叉反应的T淋巴细胞的最终产生。
这些实验的共同特征是在不诱导抑制细胞的环境下用半抗原致敏。环磷酰胺预处理的、TNCB致敏的小鼠的脾细胞显示抗辐射性“增强的辅助功能”，即，它们特异地增强抗TNP细胞毒性的体外产生。而且，一旦这些增强的辅助功能被体外接触TNP结合的自体淋巴细胞所激活，则它们也能增强对非相关抗原包括肿瘤抗原的细胞毒性(Fujiwara等人，1984)。Flood等人(1987)，同上文，显示这种增强的辅助活性由具有Lyt-1+、Lyt-2-、L3T4+、I-J+表型的T细胞所介导，并提出这些细胞是反抑制细胞，一种新类型的免疫调节T细胞。
对黑素瘤患者的免疫治疗显示，在用初级抗原匙孔戚血蓝蛋白致敏三天前施用高剂量(1000mg／M2)或低剂量(300mg／M2)的环磷酰胺，显著增强了对该抗原的迟发型过敏反应的获得(Berd等人，癌症研究(Cancer Res．)，1982，42，4862；癌症研究，1984，44，1275)。低剂量环磷酰胺预处理使转移性黑素瘤患者应答自体黑素瘤疫苗注射，产生对自体黑素瘤细胞的迟发型过敏反应(Berd等人，癌症研究，1986，46，2572；癌症研究，1988，6，335)。环磷酰胺施用导致外周血淋巴细胞非特异性T抑制功能的降低(Berd等人，癌症研究，1984，44，5439；癌症研究，1987，47，3317)，这可能是由于耗贫了CD4+、CD45R+抑制诱导T细胞(Berd等人，癌症研究，1988，48，1671)。该免疫治疗方案的抗肿瘤作用似乎受开始施用疫苗与形成对肿瘤细胞的迟发型过敏反应之间的过长间隔所限制(Berd等人，美国癌症研究学会学报(Amer．Assoc．Cancer Res．)，1988，29，408(#1626))。因此，仍需要提高这种疫苗的治疗效率以使其更具免疫原性。
大多数肿瘤免疫学家现在赞同，T淋巴细胞-负责肿瘤免疫的白细胞-向肿瘤块中的浸润是免疫系统破坏肿瘤的先决条件。因此，许多注意力已经集中于已知如NCI的Stephen Rosenberg博士所开创的“TIL”治疗。Rosenberg博士和其他人从人类转移癌中提取出少量T淋巴细胞，这些T淋巴细胞天然存在，通过与白细胞介素2(IL2)-T淋巴细胞的一种生长因子-一起体外培养能大大增加其数量。Topalian等人，临床肿瘤学杂志(J．Clin．Oncol．)，1988，6，839。然而，这种治疗还不是十分有效的，因为注射的T细胞的能力仅限于向肿瘤部位的“回归”。
在大量研究中在治疗上利用了高浓度IL2诱导淋巴细胞成为非特异性细胞毒性杀伤细胞的能力(Lotze等人，生物学反应杂志(J．Biol．Response)，1982，3，475；West等人，新英格兰医学杂志(New Engl．J．Med．)，1987，316，898)。然而，由于高剂量静脉内IL2的强毒性，使该方法具有局限性。已将少量注意力投向以下现象，相当低浓度的IL2能通过诱导抗原活化T细胞的扩充而作为免疫佐剂(Talmadge等人，癌症研究，1987，47，5725；Meuer等人，柳叶刀(Lancet)，1989，1，15)。因此，仍然需要理解并努力开发IL2作为免疫佐剂的用途。
据认为，人类黑素瘤表达可被T淋巴细胞识别的独特表面抗原。Old，L．J．，癌症研究，1981，41，361；Van der Bruggen，P．等人，科学，1991，254，1643；Mukherji，B．等人，免疫学杂志，1986，136，1888；和Anichini，A．等人，免疫学杂志，1989，142，3692。然而，在体内诱导对这些抗原的有效T细胞介导反应的困难限制了在本发明人进行工作之前的免疫疗法。
提出了几种模型来解释似乎什么是对人类肿瘤相关抗原的耐受性。包括1)下调初期抗肿瘤反应的肿瘤抗原特异性抑制细胞。Mukherji等人，同上文；Berendt，M．J．和R．J．North．，实验医学杂志(J．Exp．Med．)，1980，151，69。
2)人类肿瘤细胞不能引发T辅助细胞或为这些T细胞提供共刺激信号。Fearon，E．R．等人，细胞(Cell)，1990，60，397；Townsend，S．E．和J．P．Allison，科学，1993，259，368；和3)主要组织相容性产物在肿瘤细胞上降低的表面表达，这限制了其被T细胞的识别。Ruiter，D．J．，癌症生物学研讨会(Seminars in CancerBiology)，1991，2，35。这些假说中还没有一个在临床系统中证实。
无论这些解释是否真实，仍继续需要对多种恶性肿瘤的更有效治疗。
对于急性骨髓性白血病(AML)，将AML的治疗分为一个或两个初期诱导阶段和几个缓解后过程，也称为巩固化学治疗。初期诱导化学治疗根据所用的方案可在55-88％的患者中诱导完全的应答。然而，这些患者中的大多数复发，长期(5年+)存活的AML患者仅为20-30％。在第一次缓解期间在治疗方案中加上高剂量化学治疗和骨髓移植(BMT)结果能引起适度的改善。例如，经受同种异体BMT的患者在5年存活率上有5-10％的增长。然而，BMT的严格合格标准(例如年龄、HLA匹配供体的可获得性)严重限制了可治疗的患者的数量。一旦AML患者复发，只有30％的机会实现第二次缓解，并且极少患者能最后成为无病的。对复发的治疗形式包括与实现第一次缓解所用的类似的方案(诱导治疗，随后是几个疗程的巩固化学治疗)，尽管也能使用高剂量的单一药剂和BMT(Keating等人)。
骨髓移植方面的经验提示，免疫排斥可能在疾病的控制中起作用。移植物抗宿主疾病(GVHD)和复发是用BMT治疗的患者死亡的两个主要原因。如果发生弱的GVHD，则复发的危险降低(Horowitz等人)。因此曾经假定移植的淋巴细胞能够免疫排斥宿主白血病细胞(移植物抗白血病反应，GVL)。对特定白血病细胞抗原的T细胞反应能介导该GVL反应，尽管免疫原性人白血病抗原尚未得到证明(对于黑素瘤同样如此)。已知人AML细胞强烈表达Ⅰ类和Ⅱ类主要组织相容性复合体(MHC)抗原(Ashman等人；Andreasen等人)，这是分别诱导CD8-和CD4-介导的T细胞反应的先决条件。然而，针对白血病细胞的T细胞反应的诱导尚未成功。
有几种免疫学方法曾用于急性白血病的治疗(Foon等人；Caron和Scheinberg)。这些方法分为非特异的方法，如卡介苗(BCG)、白细胞介素2、左旋咪唑、结核杆菌的甲醇抽提残余物；和特异性的方法，如单克隆抗体和疫苗(收集的白血病细胞、无细胞提取物和培养的细胞)。这些研究中的大多数在已经缓解的患者中进行，其中免疫治疗可成功用于控制剩余的疾病。
二十世纪六十年代后期和二十世纪七十年代早期，英格兰St．Barthlomew医院的R．Powles研究组进行了一系列在化学治疗诱导的缓解后用疫苗治疗AML患者的研究(Powles，1974；Powles等人，1977)。他们使用同种异体AML细胞，以BCG作为佐剂。进行了几次试验，全部是小样本容量(N=10-15)。与单独的化学疗法相比，使用化学疗法与免疫疗法的组合使存活期有所延长，而无复发的存活不延长。未观察到严重的毒性；未见自身免疫(例如，对正常骨髓的毒性)。回想起来，这些试验有许多技术问题1)使用同种异体的而不是自体的白血病细胞；2)疫苗中白血病细胞的剂量是过量的(高达109细胞／剂量)；3)BCG剂量极高，并且BCG施用被时间和白血病细胞疫苗的位置所分开；4)当患者接受细胞毒性药物时施用疫苗(维持或巩固化学治疗)。
上述治疗的有限成功的免疫化学基础还有待思考，但正在检验几种假说。Kim和Jang(1992)建议，对特定表位的T细胞反应的缺乏可能不是由于T细胞所有成分的缺乏，而是由于产生特定表位的困难。Martin等人(1993)通过假定存在由于对“自身”肽亲和力较低而可逃脱胸腺选择的自身反应性T细胞，解释了他们的结果。
治疗人类癌症的常规尝试尚未成功。如上所述例举的组合物的施用不能可靠地诱导细胞介导的免疫的发展，如迟发型过敏反应(DTH)、T细胞浸润和炎性免疫应答所示。
因此，不管在癌症治疗中报道的基于免疫作用提出的多种理论的尝试数量如何，仍需要一种组合物，其在施用于哺乳动物后，能引发浸润肿瘤的T淋巴细胞、引发对肿瘤的炎性免疫应答、并引发对肿瘤的迟发型过敏反应。申请人现在已经惊奇地发现，使用从同源或同种异体肿瘤细胞中分离的膜具有这些希望的特性。
一方面，本发明涉及一种分离的半抗原修饰的哺乳动物(优选地为人)肿瘤细胞膜。该半抗原可选自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磷酰胆碱、磺胺酸、阿散酸和二硝基苯-S-芥及其组合。
另一方面，本发明涉及一种单独含有半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞膜或同时含有半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞的组合物。
再另一方面，本发明提供一种含有治疗有效量的哺乳动物(优选地人)肿瘤细胞膜的疫苗组合物，用于向患有与该肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤的哺乳动物施用。
本发明的另一方面，该组合物含有一种佐剂，如卡介苗、QS-21、脱毒的内毒素和细胞因子如白细胞介素2、白细胞介素4、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素12、白细胞介素15和GM-CSF。
本发明的膜和组合物(当对患有与分离该膜的肿瘤细胞相同类型恶性肿瘤的哺乳动物(优选地人)施用时)至少具有下列性质之一(ⅰ)引发浸润所治疗的哺乳动物肿瘤的T淋巴细胞，(ⅱ)引发对该哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答，(ⅲ)引发对该哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应。本发明的膜和组合物也具有在体外刺激T细胞的性质。
再另一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，包括向哺乳动物(优选地人)施用一种含有治疗有效量的半抗原修饰的人肿瘤细胞膜的组合物，其中该哺乳动物患有与该肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤。
另外，本发明涉及一种方法，包括引发具有浸润该哺乳动物(优选地人)肿瘤的性质的T淋巴细胞，和任选地，测定浸润该哺乳动物肿瘤的T淋巴细胞。本发明进一步涉及一种方法，包括引发对该哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答，和任选地，测定该炎性免疫应答，或者涉及一种方法，包括引发对该哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应，和任选地，测定该迟发型过敏反应。本发明也涉及一种在体外刺激T细胞的方法。
在本发明的再另一方面，本发明涉及一种制备半抗原修饰的肿瘤细胞膜的方法。发明详述在此引用的所有专利、专利申请和参考文献都引入作为参考。如果出现矛盾，以本公开内容为准。
本发明涉及一种分离的修饰的和未修饰的肿瘤细胞膜、一种含有这种膜的新型组合物、分离和制备该膜和含有该膜的组合物的方法、和使用本发明的膜和组合物的方法。
本发明的膜和组合物可用于治疗哺乳动物优选地人的癌症，包括转移和原发性癌症、实体瘤和非实体瘤，如直肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、肾癌和前列腺癌。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期癌症可以用分离修饰的膜、本发明的组合物和方法来治疗，优选的是Ⅲ期和Ⅳ期，再更优选的是Ⅲ期。患有前述类型的转移癌的哺乳动物，特别是人，可以用本发明的膜、组合物和方法治疗。在一个实施方案中，用本发明治疗家畜如猫、犬、马和牛科的成员。
本发明的膜和组合物也可用于引发具有浸润哺乳动物肿瘤的性质的T淋巴细胞，引发对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答，引发对哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应，和／或在体外刺激T淋巴细胞。
应当理解，本说明书中有关应用分离的肿瘤细胞的任何公开内容同样适用于肿瘤细胞膜的应用，或适用于肿瘤细胞和肿瘤细胞膜的组合。肿瘤细胞膜及其组合物本发明的分离的修饰的肿瘤细胞膜由哺乳动物优选地人的肿瘤细胞制备。在本发明的一个实施方案中，从猫、犬、马或牛科动物的肿瘤中分离肿瘤细胞膜。
对于本发明，肿瘤细胞的定义中包括完整的和破裂的肿瘤细胞。分离膜的肿瘤细胞可以是活细胞、减毒细胞或被杀伤的细胞。本发明中能使用在对患者施用后不生长和分裂从而基本上保持非生长状态的肿瘤细胞。如果对患者单独施用或与分离的肿瘤细胞膜结合施用，则这些细胞是优选的。应当理解，“非生长状态的细胞”意思是在体内不分裂的活的、减毒的或被杀伤的、完整或破裂的(或者同时有完整和破裂的)细胞。悬浮非生长状态的细胞的常规方法为技术人员所知，并可用于本发明。例如，可以在使用前照射细胞使其不能生长和分裂。肿瘤细胞可以以例如2500R照射，以阻止细胞在施用后生长。另外，也可从能在体内生长并分裂的肿瘤细胞中分离肿瘤细胞膜。优选地，在该情况中，肿瘤细胞膜制品未被能在体内分裂的肿瘤细胞所污染。
肿瘤细胞膜分离自与欲治疗的癌症相同类型的肿瘤细胞。例如，用于治疗卵巢癌的膜分离自卵巢癌细胞。优选地，肿瘤细胞来源于欲治疗的同一患者。肿瘤细胞优选地是与患者同源的(例如自体的)，但也可以是同种异体的。为定义为“同源的”，肿瘤细胞不需与所治疗患者的肿瘤细胞或非肿瘤体细胞完全(即100％)遗传学上相同。(分离出膜的)肿瘤细胞与患者之间的MHC分子遗传同一性通常是充分的。另外，在用作膜来源的肿瘤细胞上的特定抗原与患者肿瘤细胞上存在的抗原之间可有遗传同一性。遗传同一性可以按照本领域公知的方法测定。同源的肿瘤细胞意思也可是一种经遗传改变(例如利用重组DNA技术)而使其在例如患者特定MHC分子和／或患者癌细胞上特定抗原方面遗传学上相同的细胞。也可使用来源于相同种的动物而遗传学上不同的肿瘤细胞，如同种异体细胞，制备本发明的肿瘤细胞膜。肿瘤细胞可以是但不限于从活检标本或从组织培养物中分离的细胞。从同种异体细胞和干细胞分离的膜也在本发明的范围之内。
肿瘤细胞膜可包括所有细胞膜，如外膜、核膜、线粒体膜、液泡膜、内质网膜、高尔基复合体膜和溶酶体膜。在本发明的一个实施方案中，超过大约50％的膜是肿瘤细胞质膜。优选地，超过大约60％的膜由肿瘤细胞质膜组成，超过大约70％是更优选的，80％是甚至更优选的，90％是甚至更优选的，95％是甚至更优选的，99％是最优选的。
优选地，分离的膜基本上不含细胞核和细胞。例如，如果在大约2×108细胞当量(c．e．)的膜物质中含有少于大约100个细胞和／或细胞核，则膜制品为基本上不含细胞核或细胞。细胞当量是从所示数量的细胞中分离的膜的数量。基本上不含细胞和／或细胞核的分离的肿瘤细胞膜可以含有淋巴细胞和／或淋巴细胞膜。
优选地，分离的肿瘤细胞膜是细胞外膜，即，肿瘤细胞质膜。本发明的膜制品可含有完整的外膜或其部分。含有一部分外膜的本发明分离的膜包含有外膜的至少一种MHC分子部分和／或一种热激蛋白部分。膜片段的大小不是重要的。
同种异体肿瘤细胞膜也可在本发明的方法中与同源(例如自体)抗原呈递细胞一起使用。该方法允许用来源于非患者自身肿瘤的肿瘤细胞膜来免疫患者。同源抗原呈递细胞加工同种异体膜，使得患者的细胞介导的免疫系统可对其应答。
例如，可以用半抗原修饰分离的肿瘤细胞膜以及肿瘤细胞。这些修饰的肿瘤细胞膜(和肿瘤细胞)至少具有下列性质之一(ⅰ)引发浸润所治疗哺乳动物的肿瘤的T淋巴细胞，(ⅱ)引发对该哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答，以及(ⅲ)引发对该哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应。修饰的肿瘤细胞膜和细胞也具有在体外刺激T细胞的性质。
本说明书中涉及的(修饰的或未修饰的)肿瘤细胞膜包括膜制品可以贮存或施用的任一形式，例如，重悬浮于稀释剂中的膜、膜沉淀或冷冻的或冻干的膜。
本发明的膜可以在本发明的方法中单独使用，或与其它化合物包括但不限于本发明的其它组合物一起使用。因此，肿瘤细胞和肿瘤细胞膜可以单独使用或共同施用。对于本发明，共同施用包括同时和连续施用。此外，肿瘤细胞和肿瘤细胞膜可以与其它化合物，包括但不限于细胞因子如白细胞介素2、白细胞介素4、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素12、白细胞介素15和GM-CSF共同施用。本发明的肿瘤细胞和肿瘤细胞膜也可以与其它癌症疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法、抗体疗法和反义寡核苷酸疗法结合使用。然而，本发明的优点在于它能单独用作癌症治疗，使得不必需要其它治疗。
本发明的组合物可含有本发明的分离的肿瘤细胞膜(修饰的或未修饰的)和一种药学可接受的载体或稀释剂，如但不限于Hanks溶液、盐水、磷酸缓冲盐液、蔗糖溶液和水。通常，根据预期的施用途径和标准制药实践选择药学可接受的载体。有效成分与载体的比例自然取决于组合物的化学性质、溶解度和稳定性以及预计的剂量，并且能用本领域的常识优化。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的组合物是一种含有有效量的分离的修饰肿瘤细胞膜的疫苗组合物。对于本公开内容，“有效量”是达到希望的结果所需的量。例如，在一种治疗癌症的方法中，“有效量”意思是分离的修饰肿瘤细胞膜的量，该量具有至少导致下列情况之一的性质(ⅰ)引发浸润肿瘤的T淋巴细胞，(ⅱ)引发对肿瘤的炎症反应，(ⅲ)引发对肿瘤的迟发型过敏反应，和(ⅳ)肿瘤退化。同样，在体外刺激T细胞的方法中，“有效量”是导致T细胞刺激的膜的量。
疫苗组合物可含有，例如，每剂量至少104c．e．分离的膜，优选地至少105c．e．，最优选地至少106c．e．。剂量是在单次施用中所施用的疫苗组合物的量。在一个实施方案中，疫苗组合物含有每剂量约105-约2．5×107c．e．的膜。更优选地约5×106c．e．。所用的本发明的肿瘤细胞和肿瘤细胞膜的量通常取决于如化合物对癌细胞的亲和力、存在的癌细胞的量和组合物的溶解度等因素。可根据患者的体重、临床状况设定剂量。
本发明的疫苗组合物可以包装为适于皮内、静脉内、腹膜内、肌内和皮下施用的剂型。此外，该剂型也可含有分离的肿瘤细胞膜，在施用时例如用适当的稀释剂重建。半抗原本发明的肿瘤细胞和肿瘤细胞膜可以作为修饰的、未修饰的肿瘤细胞和肿瘤细胞膜使用，或作为修饰的、未修饰的肿瘤细胞和肿瘤细胞膜的组合使用。对于本发明，修饰包括但不限于用半抗原修饰。不单独诱导免疫应答(但增强对结合或以其它方式附着的另一分子的免疫应答)的任一小分子可起半抗原的作用。通常，所使用的分子应小于大约1000mw。
本领域中已知多种半抗原，例如TNP(Kempkes等人，免疫学杂志1991 1472467)；磷酰胆碱(Jang等人，欧洲免疫学杂志1991 211303)；镍(Pistoor等人，实验皮肤病学杂志(J．Invest．Dermatol．)199510592)；砷酸(酯)(Nalefski和Rao，免疫学杂志1993 1503806)。
通常，适用于本发明的半抗原具有可结合亲水性氨基酸(例如赖氨酸)的性质。半抗原可通过赖氨酸的ε-氨基或-COOH基与细胞结合。另外，也可使用能通过二氮(diaza)偶联结合疏水性氨基酸如酪氨酸和组氨酸的半抗原。适用于本发明的半抗原的实例包括二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磷酰胆碱、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥(Nahas和Leskowitz，细胞免疫学(Cellular Immunol．)198054241)及其组合。一旦学习了本公开内容，技术人员就能选择用于本发明的半抗原。例如，能用迟发型过敏反应(DTH)试验常规测试半抗原。佐剂在一个优选实施方案中，肿瘤细胞或肿瘤细胞膜与一种免疫佐剂一起施用。该佐剂具有增强对半抗原修饰的肿瘤细胞和膜的免疫应答的性质。佐剂的代表性实例是卡介苗，BCG，或合成佐剂，包含从皂树(quillajasaponaria)皮纯化的均质皂苷、小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)的QS-21，McCune等人，癌症(Cancer)1979 431619，一般是皂苷、脱毒的内毒素和细胞因子如白细胞介素2、白细胞介素4、γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素12、白细胞介素15、GM-CSF及其组合。
应当理解，可对佐剂进行优化。换句话说，技术人员可以利用常规实验确定使用的最佳佐剂。制备本发明的肿瘤细胞膜的方法本发明使用的肿瘤细胞可如下制备。如Berd等人(1986)同上文、Sato等人(1997)、美国专利号5，290，551和美国申请系列号08／203，004、08／479，016、08／899，905、08／942，794或相应的PCT申请PCT／US96／09511所述加工肿瘤，其每一项都在此完整引入作为参考。简言之，经分裂提取细胞，如用胶原酶和DNA酶酶促分裂，用搅拌器机械分裂，用镊子起毛，使用研钵和研杵，用手术刀片切成小块，等等。对于液体肿瘤，可收集血液或骨髓样品，并经密度梯度离心分离肿瘤细胞。
通过破裂细胞由肿瘤细胞制备肿瘤细胞膜，例如，利用低渗休克、机械分裂和酶促分裂，及经离心分离不同的细胞成分。简言之，可使用下列步骤裂解肿瘤细胞，从裂解的肿瘤细胞中除去细胞核获得无细胞核的肿瘤细胞，获得不含细胞和细胞核的基本上较纯的膜，使该肿瘤细胞膜与半抗原作用以获得半抗原修饰的肿瘤细胞膜。可按照Heike等人的方法进行膜分离。
在本发明的一个实施方案中，完整细胞和细胞核可通过连续离心去除，直到经显微镜检查基本上不含细胞核和细胞。例如，裂解的细胞可以以低速度，如约500-2000g离心约5分钟。该分离方法使得在大约2×108细胞当量(c．e．)的膜物质中保留少于约100个细胞和／或细胞核。例如，可通过约100000g约90分钟的超速离心沉淀含有膜的核后(postnuclear)上清液。沉淀中含有全部膜。例如，可将膜重悬浮于约8％蔗糖、5mM Tris，pH7．6的溶液中，并冷冻于约-80℃直至使用。可以使用任一稀释剂，优选的是作为稳定剂的稀释剂。为了测定膜制品的质量，可以定期培养(约6×107c．e．膜)。不应生成细胞集落，用光学显微镜也应当检测不到细胞或细胞核。
用DNP或另一种半抗原对所制备的细胞或膜的修饰可以按已知的方法进行，例如，Miller和Claman的方法，免疫学杂志，1976，117，1519，在此完整引用作为参考，该方法包括肿瘤细胞或膜与一种半抗原在无菌条件下温育30分钟，随后用无菌盐水洗涤。用单克隆抗半抗原抗体经流式细胞术可证实半抗原修饰。
分裂的细胞或分离的膜可以新鲜使用或者例如在可控速度的冷冻机或在液氮中冷冻贮存备用。细胞和膜一旦融解后立即使用。优选地，融解细胞或膜后马上向患者施用。例如，可在对患者进行皮肤试验或治疗当天，融解细胞或膜。任选地，可洗涤细胞或膜，并任选地照射2500R。可以再次洗涤，然后悬浮于不含酚红的Hanks平衡盐溶液中。
同种异体肿瘤细胞膜可如上所述制备。然而，在向受试者施用之前，应与同源(例如自体的)抗原呈递细胞共温育。同源抗原呈递细胞加工同种异体膜，使得患者的细胞介导的免疫系统可对其应答。该方法使得可以用来源于非患者自身肿瘤的肿瘤细胞膜来免疫患者。同种异体肿瘤细胞膜与抗原呈递细胞温育约数小时到约数天的一段时间。然后洗涤膜脉冲(cmembrane-pulsed)的抗原呈递细胞，并对患者注射。
可以用多种方法制备抗原呈递细胞，包括例如Grabbe等人，1995和Siena等人，1995的方法。简言之，例如通过静脉穿刺从欲免疫的患者中获得血液。此外，也可获得骨髓。此外，也可通过白细胞除去法获得血液白细胞。经梯度离心可从这些来源的任一个中分离单核白细胞。白细胞进一步可用抗原CD34的单克隆抗体经正选择纯化。
在组织培养基(例如，补充有血清如胎牛血清、合并的人血清或自体血清的RPMI-1640)中培养并扩大纯化的白细胞。此外，也可使用无血清培养基。为了刺激抗原呈递细胞的生长，可以向培养基中加入细胞因子。细胞因子包括但不限于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素4(IL4)、TNF(肿瘤坏死因子)、白细胞介素3(IL3)、FLT3配体和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
在培养中分离并扩大培养的抗原呈递细胞可以表征为例如树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和朗格汉斯细胞。使用肿瘤细胞膜和组合物的方法治疗癌症的方法本发明涉及一种治疗诊断或怀疑患有癌症的哺乳动物优选地人的方法，包括施用一种药学可接受量的半抗原修饰的肿瘤细胞膜、半抗原修饰的肿瘤细胞或其组合。膜和／或细胞可与免疫佐剂和／或药学可接受的载体混合。在施用该组合物之前可施用药学可接受量的低剂量环磷酰胺或另一种低剂量的化疗剂。半抗原化的组合物之后任选地可施用药学可接受量的非半抗原化的肿瘤细胞或肿瘤细胞膜。也可按照本发明的方法施用非半抗原化的组合物。
可根据本发明治疗任一恶性肿瘤，包括转移和原发性癌症，实体瘤和非实体瘤。实体瘤包括癌，非实体瘤包括血液恶性肿瘤。癌包括但不限于腺癌和上皮癌。血液恶性肿瘤包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。下面是按本发明的方法可用分离的修饰肿瘤细胞膜治疗的癌症的非限制性实例卵巢癌包括晚期卵巢癌、白血病包括但不限于急性骨髓性白血病、结肠癌，包括转移至肝的结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、肾癌和前列腺癌。卵巢癌可能是腺癌或上皮癌。结肠和前列腺癌是腺癌。白血病可能来源于髓样骨髓或淋巴结。白血病可能是急性的，表现为最初发育阶段的成熟停止，也可能是慢性的，表现为成熟淋巴样细胞或髓细胞的过度生长。可根据本发明治疗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ或Ⅳ期癌症，优选地Ⅲ和Ⅳ期，再更优选地Ⅲ期癌症。
患有前述类型的转移癌的哺乳动物，特别是人类，可以用本发明的膜、组合物和方法来治疗。在本发明的一个实施方案中，可以治疗家畜。
在施用本发明的疫苗组合物之前，可通过将其施于皮肤而使患者对用来修饰肿瘤细胞和膜的半抗原免疫。例如，可使用二硝基氟苯(DNFB)。随后(例如，大约2周后)，可给患者注射一种肿瘤细胞膜组合物。该组合物可施用(如再注射)总共至少三次治疗，优选地至少六次治疗。在一个实施方案中，施用的总数(包括最初施用)可以是8次，在另一个实施方案中可能是10次。接种方案可由主治医师设计，以适应特定患者的病情。例如，可以每2周，优选地每周施行疫苗注射。可施用一次加强疫苗。优选地，加强免疫一次或两次。例如，可在最初施用大约6个月之后或大约1年之后加强免疫。
可用药物增强患者的免疫应答。例如，每次施用之前可施用环磷酰胺(CY)。
可在常规癌症治疗如手术后应用本发明。对于实体瘤，如卵巢癌，可最佳或次最佳地摘除(debulking)肿瘤。最佳地摘除是指切除肿瘤使得被治疗的患者中只留有小肿瘤块。次最佳地摘除是指切除肿瘤而在患者中留有大块。对于非实体瘤，可收集合适的血液或骨髓样品，并用任何参考文献中已知的技术分离癌细胞。切除的肿瘤或收集的肿瘤细胞可用来制备如上所述的肿瘤细胞膜。
可通过任一合适的途径施用肿瘤细胞膜，包括接种和注射，例如皮内、静脉内、腹膜内、肌内和皮下注射。每次疫苗治疗可以有多个施用部位。例如，每次施用可以皮内注射两个优选地三个相邻部位来施用疫苗组合物。在本发明的一个实施方案中，在上臂或腿上施用疫苗组合物。
施用多种生物反应调节物可提高疫苗的效能。这些药剂通过直接或间接地刺激免疫应答而起作用。本发明的生物反应调节物包括但不限于白细胞介素12、白细胞介素15和γ干扰素。在一个实施方案中，在每次疫苗注射后施用IL12。对具有炎症反应的患者施用IL12可使肿瘤块内的T淋巴细胞增殖并且更具活性。增加的T细胞数和功能性引起肿瘤的免疫破坏和消退。
大量工作者已经发展并测试了人癌症疫苗。尽管它们有时能诱导对患者癌症的弱免疫力，但很少能导致肿瘤消退或延长存活时间。应用本发明的疫苗惊人地发现了炎症反应的证据。用显微镜观察到T淋巴细胞的浸润。因此，能增强炎症反应和淋巴细胞数量的该方法在本领域中具有明显的进步。因此，本发明也提供了引发至少具有下列性质之一的T细胞的方法施用时(ⅰ)引发浸润所治疗哺乳动物的肿瘤的T淋巴细胞，(ⅱ)引发对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答，(ⅲ)引发对哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应。
刺激T细胞的方法可以用分离的肿瘤细胞膜在体外刺激T细胞。该试验能用来评价例如应用特定肿瘤膜的治疗是否可能成功。该试验中使用的T细胞可以按照下列方法获得，该方法是描述用于人的，但是可应用于任何哺乳动物受试者。
通过对诊断患有某种类型癌症的患者施用一种药学可接受量的组合物，其中含有半抗原修饰的肿瘤细胞、肿瘤细胞膜或其组合，由此产生T细胞。该组合物任选地可含有一种免疫佐剂和／或一种药学可接受的载体。在施用第一次肿瘤细胞组合物之前，任选地可施用一种药学可接受量的低剂量环磷酰胺或另一种低剂量的化疗剂，如但不限于大约5-10mg／M2的苯丙氨酸氮芥。半抗原化的组合物之后任选地可施用一种药学可接受量的非半抗原化的疫苗组合物，其含有非半抗原化的膜、肿瘤细胞或其组合。可以按照本发明的方法施用非半抗原化的组合物。
可以从在施用半抗原修饰的自体细胞或膜后对其发生强烈迟发型过敏(DTH)反应的患者中获得外周血淋巴细胞(PBL)。DTH反应优选地有大约10mm的直径，再更优选地大约大于10mm。通过用半抗原修饰的癌细胞重复刺激可由PBL建立T细胞系。T细胞能用公知的方法分离，如单细胞悬液的制备，过滤，单核细胞的排除和表达特定T细胞受体(TCR)类型的亚群的分离，方法是使该亚群在TCR亚型特异抗体的存在下和／或在IL-2存在下和／或在超抗原存在下扩增。目的T细胞可在体内扩增，因为它们是从已经富集了目的T细胞的肿瘤的浸润液中收集的。
修饰的肿瘤细胞和肿瘤细胞膜都具有刺激T细胞的性质。对于本发明，“刺激”是指诱导T细胞的增殖以及T细胞在体外的细胞因子产生。膜和肿瘤细胞都独立地具有刺激T细胞的能力。可通过T细胞对修饰核苷酸的摄取来检测并测定T细胞的增殖，这些修饰核苷酸如但不限于3H胸苷、125I UDR(碘代脱氧尿嘧啶核苷)；和染料，如能使活细胞染色的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)。另外，细胞因子如但不限于IFNγ、肿瘤坏死因子(TNF)和IL-2的产生可用于显示T细胞增殖。细胞因子的产生应当高于背景水平，通常高25皮克／ml，优选地高100皮克／ml。
T细胞是介导两种免疫功能-效应物功能和调节功能、分泌蛋白质(淋巴因子)和杀伤其它细胞(细胞毒性)-的淋巴细胞。效应物功能包括反应性)，迟发型过敏反应、同种异体移植排斥、肿瘤免疫和移植物抗宿主反应性。淋巴因子产生和细胞毒性由T细胞效应物功能证明。T细胞的调节功能表现为扩增其它T细胞介导的细胞毒性的能力和B细胞的免疫球蛋白产生。调节功能也需要淋巴因子的产生。T细胞应答诱导刺激物(如但不限于促分裂原、抗原或凝集素)产生γ干扰素(IFNγ)。
在本发明的一个实施方案中，可如下建立T细胞系。PBL(1×106)与自体DNP结合的B淋巴母细胞(1×105)在24孔平底培养板中在淋巴细胞培养基中混合，培养7天后，加入100U／ml IL2(Cetus Oncology，Emeryville，CA)。将扩充的T细胞培养物保存于含有IL2的培养基中，需要时将其分开，以保持22mm直径孔中大约2×106个细胞的浓度。每14天通过加入自体DNP结合的B淋巴母细胞再刺激培养物。用单克隆抗体表(panel)(Becton-Dickinson，San Jose，CA)通过流式细胞术可确定表型。CD8+和CD4+T细胞的分离通过间接淘选完成，其中，按照Wysoki，L．J．和V．L．Sato，美国国家科学院院报，1978，75，2844的方法，用标准技术使抗CD8或抗CD4单克隆抗体包被的T细胞附着于抗免疫球蛋白包被的平皿上，该文在此完整引用作为参考；分离附着的细胞，并用DNP修饰的刺激物包括但不限于以下所述、黑素瘤细胞和β淋巴母细胞和IL2扩充。
例如，通过在圆底微量滴定板的淋巴细胞培养基中以有限稀释度培养，获得表型均一的T细胞亚群，该培养基中含有2×105个照射的同种异体饲养细胞、200 U／ml IL-2和植物凝集素。针对应答DNP修饰的B淋巴母细胞的增殖能力，筛选含有生长的淋巴细胞集落的孔。阳性孔用IL2扩充，并用自体DNP结合的B淋巴母细胞每14天重复刺激。
可作为效应细胞测试外周血淋巴细胞(PBL)。将其悬浮于淋巴细胞培养基(RPMI-1640、10％合并的人AB+血清、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸盐培养基添加物(Sigma Chemical Co．)、2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、25mM HEPES缓冲液、青霉素+链霉素)中，并以1×105细胞／孔的浓度加入96孔圆底微量滴定板中。也加入刺激细胞，包括1)自体或同种异体PBL，2)通过用EB病毒转染制备的自体或同种异体B淋巴母细胞系，3)自体培养的黑素瘤细胞；通过照射(5000R)灭活。在大多数实验中，效应物∶刺激物比优选地为1∶1。培养板在CO2培养箱中37℃温育5天；然后用125I标记的IUDR(ICN Radiochemical，Costa Mesa，CA)使这些孔接受脉冲6小时，用自动收集装置收集，并用γ计数仪计数。计算三个重复孔的平均值。也按照上述方法检测培养的T细胞的淋巴细胞增殖反应。
融解在对DNP修饰的自体细胞的最大DTH反应性时从患者获得并冷藏的PBL，并检测体外增殖反应。单独的DNFB应用不能产生可检测数量的循环效应细胞。预期反应性PBL在两次DNP-疫苗注射后(第63天)可检测到，并将在疫苗治疗期间持续检测到，这基于以前应用DNP修饰的黑素瘤细胞的经验。
为了检测细胞因子的产生，可向圆底微量滴定板中以1×105细胞／孔加入T细胞。加入等量刺激物(DNP修饰的自体B淋巴母细胞)，温育18小时后收集上清液。用可商品获得的ELISA试剂盒测定γ干扰素(Endogen，Boston，MA；灵敏度=5pg／ml)。
为了测定该反应的MHC依赖性，在加入效应细胞之前，刺激细胞可与浓度为10μg／ml的MHCⅠ类(W6／32)或MHCⅡ类(L243)单克隆抗体预温育1小时。可检测相同浓度的非特异性小鼠免疫球蛋白，作为阴性对照。
通过淘选大量群体获得的DNP反应性CD8+T细胞能够通过用DNP修饰的自体B淋巴母细胞重复刺激，长期(＞3个月)培养于含IL-2的培养基中；它们保留稳定的表型，CD3+、CD8+。两条证据表明其反应是MHCⅠ类限制性的1)刺激细胞与抗Ⅰ类构架抗体预温育，可阻断γ干扰素产生，而与抗Ⅱ类抗体温育不能阻断，2)T细胞能应答一个或两个HLA-A基因座匹配的同种异体DNP修饰的刺激物，但不能应答HLA-A不匹配的刺激物。
为了测定T细胞的γ干扰素产生，可从患者的血液中获得淋巴细胞。大约1，000，000个淋巴细胞与DNP修饰的自体黑素瘤细胞膜混合，用来刺激T细胞。每7天加入100U／ml白细胞介素2。通过传代扩充T细胞。然后用DNP修饰的自体黑素瘤细胞膜重新刺激T细胞。得到富集的T细胞群，其可对DNP修饰的自体黑素瘤细胞起反应。根据T细胞的γ干扰素产量测定刺激。通常认为高于15皮克／ml的γ干扰素产生即是明显的。
通过下列实施例进一步说明了本发明，其意图只在于说明，而不是欲将本发明限定于这些具体的实施方案。实施例1分离的黑素瘤膜对T细胞的体外刺激T细胞系的建立按照本方法进行DNP-疫苗施用后，从对DNP-修饰的自体黑素瘤细胞具有强烈迟发型过敏(DTH)反应的患者中获得外周血淋巴细胞(PBL)。通过密度梯度离心从血液中分离PBL，将其悬浮于冷冻培养基，如含有2．5％人白蛋白和DMSO的RPMI-1640中，在可控速度的冷冻机中冷冻，并贮存于液氮中直至使用(Sato等人，1995)。
通过用DNP-修饰的自体黑素瘤细胞(DNP-Mel)重复刺激由这些PBL建立T细胞系，并用重组白细胞介素2(IL-2)维持(Sato等人，1995)。
黑素瘤细胞如上所述，从由同一患者中手术取出的转移块中酶法提取黑素瘤细胞，并用前述方法冷藏(Sato等人，1997)。由该黑素瘤细胞悬液建立自体黑素瘤细胞系。简言之，从转移块中酶法分离出黑素瘤细胞，将其悬浮于组织培养基(含有胎牛血清或人血清的RPMI-1640)中，并加于组织培养板上。数天后，除去未附着的肿瘤细胞，并加入新鲜的培养基。数周后，附着的黑素瘤细胞开始快速增殖。当细胞生长到铺满培养板时，通过用EDTA取下细胞，并加至新鲜的组织培养板中来使细胞分离。
用Miller和Claman的方法用DNP修饰该黑素瘤细胞系细胞。这包括肿瘤细胞与二硝基氟苯(DNFB，Sigma Chemical Co．)在无菌条件下温育30分钟，随后用Hanks溶液洗掉过量的DNFB。用小鼠单克隆抗DNP抗体(SPE-7；Sigma Immunochemicals，St．Louis，MO)经流式细胞术证实DNP修饰(100％的细胞显示被DNP修饰)。
作为一种备择方法，可如上所述用DNP修饰冷藏的黑素瘤细胞，而不需建立细胞系的中间步骤。
细胞膜提取用Heike等人的方法从DNP修饰的黑素瘤细胞(DNP-Mel)中提取细胞膜。简言之，通过在5倍体积的30mM碳酸氢钠缓冲液、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)中低渗休克，并由Dounce匀浆化(10-20次)，裂解DNP修饰的细胞。通过以1000g连续离心5分钟除去剩余的完整细胞和细胞核，直到上清液不含细胞核和细胞。然后，经100，000g离心90分钟沉淀膜。将沉淀中的全部膜以每毫升107细胞当量单位(即，从107个细胞中提取的膜)重悬浮于8％蔗糖、5mM Tris，pH7．6中，-80℃下冷冻直至使用。
作为一种备择方法，用上述相同方法从未修饰的黑素瘤细胞中分离细胞膜。将膜以不同的细胞当量浓度(105-109细胞当量／ml)悬浮于不含白蛋白的Hanks溶液中。然后如上所述加入DNFB。然后，经100，000g离心90分钟沉淀膜，并用盐水洗两次。
膜制品引起的细胞因子产生根据IFN-γ产生，测定DNP修饰的黑素瘤膜诱导的T细胞反应。将从患者PBL中获得的T细胞以105细胞／孔平板接种于96孔圆底培养板中，每孔100μl培养基(补加有10％人AB血清、2mM L-谷氨酸、100mg／ml／100U／ml链霉素／青霉素、10mM HEPES、1％非必需氨基酸的RPMI 1640)。向每孔中加入不同量(约105-约108细胞当量)的细胞膜，并加入其它培养基使每孔的总体积为250μl。
温育18小时后收集上清液进行IFN-γ测定。用可商品获得的ELISA试剂盒(Endogen，Boston，MA；敏感度=5pg／ml)测定上清液中IFN-γ的浓度。
与自体DNP-Mel膜温育后检测到明显的T细胞的IFN-γ产生(750pg／ml)。T细胞的IFN-γ产生与共温育的DNP-Mel膜的量有关。未引发对未修饰的Mel膜的明显反应。通过用正淘选技术富集CD4+和CD8+T细胞建立两种T细胞亚系。由于IFN-γ产生，每种亚系可对DNP-Mel膜起反应。CD4+T亚系与DNP-Mel膜的反应可被MHCⅡ类的抗体所阻断，CD8+亚系的反应可被MHCⅠ类的抗体所阻断(分别为73％和80％阻断)。
这些结果表明，半抗原修饰的肿瘤细胞膜可成功地用于接种需要肿瘤治疗的患者。实施例2用修饰的肿瘤细胞膜治疗Ⅲ期卵巢癌最初可按标准医疗实践(摘除(debulking)手术，随后是化学治疗)治疗患者。待化学治疗完成后，可以应用含有半抗原二硝基苯(DNP)修饰的卵巢癌细胞膜的疫苗施行6周疗程的治疗。第一次注射前可施用低剂量的环磷酰胺。待疗程结束后，可检测患者对DNP修饰的和未修饰的癌细胞膜的迟发型过敏反应性。用冷藏的从转移性肿瘤提取的和／或从外周血分离的淋巴细胞可进行体外研究。
例如，可选择接受手术摘除的患者或化学治疗后显示肿瘤减小的患者进行治疗。从每名患者上切下的肿瘤块足够获得至少100×106个活肿瘤细胞。这名患者可接受化学治疗，如卡铂和紫杉醇，在化学治疗完成后优选地是临床上无肿瘤的(即，体检和CT研究正常，血清CA-125＜35IU／L)。
患者可不接受本发明的治疗，这是依据对于制备疫苗和皮肤试验不足量的肿瘤细胞(＜100×106个细胞)，低于80的Karnovsky表现状态，以前6个月内的主要区域放射治疗，系统性皮质类固醇的当前施用，血细胞比容＜30％或WBC＜3000，年龄＜18，活动性自身免疫病，活动性重症感染，另一种活动性恶性肿瘤，感染乙型肝炎病毒(循环抗原)或HIV(循环抗体)的证据，或不能提供承诺。
对患者进行肿瘤的手术切除及转移灶的去除。进行最佳或次最佳地去除的患者是符合条件的。可将肿瘤组织送至实验室并加工以获得膜。该膜可以冷藏并贮存于液氮中。
同源的和同种异体的肿瘤细胞膜都可如本说明书所述制备并使用。
从手术后六(6)周内开始，患者可开始化学治疗，如应用卡铂或顺铂+紫杉醇，按照下列剂量方案每3周卡铂AUC 7．5mg／M2或顺铂75mg／M2，每3周紫杉醇175mg／M2静脉内超过3小时。可施行六个循环的化学治疗。也可施行另外任一种化学治疗。
完成化学治疗大约四周后，可对患者进行转移评价，包括胸-腹-骨盆计算机X射线断层造影(CT)。只有证明无复发癌的患者才适合选择进行疫苗治疗。假如CT研究为复发阴性，则血清CA125水平升高的患者是符合条件的。肿瘤细胞膜治疗可以在施行最后一次化学治疗至少4周、最迟12周之后开始。
于第-7天，可用下列物质对患者进行皮肤试验1)DNP修饰的自体卵巢癌细胞或膜，2)稀释剂(含有0．1％人白蛋白的Hanks平衡盐溶液)，和3)PPD中间物。可在第-5天测定DTH反应。在第0天，患者可进行300mg／M2环磷酰胺的快速静脉内输液。三天后，他们可皮内注射一种肿瘤细胞膜组合物，这可每周重复持续六(6)周。疫苗可能包含与BCG混合的DNP修饰的卵巢癌细胞膜。可向上臂内注射疫苗。如果由于某种原因已切除了左腋窝淋巴结，可使用右臂。
第6次接种两周半之后，可对患者进行临床评价，包括CBC、SMA-12、CA125和胸部X射线。可测试他们对下列物质的DTHDNP修饰的和未修饰的自体癌细胞、DNP修饰的和未修饰的自体外周血淋巴细胞、稀释剂和PPD中间物。也可测试对二硝基氟苯(DNFB)的接触敏感性。
可在第6个月时(从疫苗计划开始时算起)给予保持无复发的患者第7次(加强)疫苗。对于每名患者，可贮存至少一个冷藏瓶的肿瘤细胞膜进行第6个月的加强注射。如果预计可用的细胞数不足以进行6次每周疫苗加第6月的加强，则每周注射的开始过程可减为5次。可在一年后施用另一次加强疫苗，但这只是在有足量的细胞可用时。恰在一年加强免疫之前，可用自体肿瘤细胞或膜对患者进行皮肤试验，确定是否保持其以前的免疫水平。实施例3用修饰的肿瘤细胞膜治疗黑素瘤可如前所述处理肿瘤块。简言之，可通过用胶原酶和DNA酶酶促分裂和通过机械分裂提取细胞。如本说明书中所述分离细胞膜，在可控速度的冷冻机中冷冻，并贮存于液氮中直至需要使用。在治疗患者当天，融解、洗涤膜，重悬浮于不含酚红的Hanks平衡盐溶液中。可按照Miller和Claman(1976)的方法进行DNP修饰。这包括肿瘤细胞与二硝基氟苯(DNFB)在无菌条件下温育30分钟，随后用无菌盐水洗涤。
该疫苗组合物可含有最少2．5×106c．e．台盼蓝排除的黑素瘤细胞膜和最多少7．5×106c．e．黑素瘤细胞膜，其悬浮于0．2ml Hanks溶液中。每次疫苗注射可包括三次向相邻部位的注射。
冷冻干燥的物质可用1ml无菌水或磷酸缓冲盐溶液，pH7．2(PBS)重建。可在无菌缓冲盐溶液中进行适当的稀释。然后在注射前吸取0．1ml与疫苗混合。第一次和第二次疫苗可与0．1ml 1∶10稀释的Tice BCG(“Tice-1”)混合。BCG是从Organon Teknika Corporation(Durham，NC)获得的Tice菌株(巴斯德研究所菌株的次代株)。第三次和第四次疫苗可与0．1ml 1∶100稀释物(“Tice-3”)混合。第五次和第六次和加强疫苗可与0．1ml 1∶1000稀释物(“Tice-5”)混合。理想的疫苗反应是只是有小(＜5mm)中心溃疡的炎性丘疹。
可通过在前臂上皮内注射0．1ml试验物质进行皮肤试验，并通过测定硬结的平均直径估计48小时的DTH。可试验下列物质1)1×106个未修饰的和用DNP修饰的自体黑素瘤细胞膜细胞；可使用酶促分裂的(TCE)和机械分裂的(TCM)肿瘤细胞；2)3×106个未修饰的和用DNP修饰的自体外周血淋巴细胞；3)Hanks溶液；和4)PPD中间物强度。通过对上臂腹面皮肤施用200μg DNFB并检查该区域在48小时的硬结圈，也可检测对DNFB的接触敏感性。可在六周疫苗施用过程后进行全套DTH试验。预处理DTH试验仅限于DNP修饰的黑素瘤细胞膜、PPD和稀释剂。该策略用来避免1)使患者对DNP修饰的淋巴细胞致敏，和2)通过注射未修饰的肿瘤细胞使患者耐受。
每次进行皮肤试验时，可收集所有患者的血液用于淋巴细胞和血清的分离和冷藏。可周期性地检测如通过增殖测定的对自体癌细胞的应答、细胞因子释放和细胞毒性。
可在疫苗治疗开始之前评估患者的转移性疾病。待第一次8周的疫苗治疗结束之后，每三个月进行一次评价。可继续评价直到第二年，第三年每4个月一次，其后每6个月一次。每次评价可进行体检和常规血液检查(CBC、SMA-12和CA125)。可在施用疫苗前，在(加强免疫前)6个月和12个月进行胸-腹-骨盆的CT，作为临床指征。可以确定未复发的和总存活率。所有患者都可进行至少5年或直到死亡时为止。
预计患者可形成对BCG的局部反应，包括排出、2-3月后愈合的压痛脓疱，留下类似天花接种的瘢痕。患者形成对BCG的敏感性时，这些反应的强度可能提高。在接种半抗原处理的疫苗的患者中以未观察到过敏反应、其它变应性现象和自身免疫。
接种部位的反应可如下分级0-无症状；1-痒或不适，但不干扰臂运动或正常活动；2-导致干扰臂运动但不需改变正常活动的不适；3-导致主要干扰臂运动且需要改变正常活动的不适；4-导致不能用四肢进行正常活动的不适。
环磷酰胺可用无菌水重建，并可通过快速静脉内输液施用适当的剂量。一般地，大约三分之一的患者在施用低剂量环磷酰胺后可能感到恶心，大约10％可能会呕吐。该剂量时不会发生白细胞减少、脱发和膀胱炎。预期该方案伴有较低的恶心和呕吐发生率，因为可能只与最后一次疫苗接种结合施用一次环磷酰胺。
可在注射疫苗后观察患者。让具有意外症状或征象的患者联系医生立即评价。导致不适的发热可用乙酰氨基酚治疗。低剂量环磷酰胺引起的恶心可用口服丙氯拉嗪(prochlorperazine)(丙氯拉嗪(Compazine))治疗。如果在接种部位发生严重的局部反应(＞5mm溃疡)，则可降低随后的BCG剂量(见上)。
一年评估时无复发的患者可接受最后的加强疫苗注射。然后可观察其病情而不进行进一步的治疗。发展为转移的患者可不再研究，并按临床指征进行治疗(通常手术或化学治疗)。
也可进行用来确定DNP疫苗是否延长这些患者的无复发和／或总存活时间的效能研究。可以测定存活参数(卡-迈(Kaplan-Meier)法)。
Thomas Jefferson 大学、NIH和FDA关于承诺的所有规定均得到遵守。
我们以前用半抗原修饰的黑素瘤细胞对DNP修饰的自体黑素瘤疫苗的研究得出以下结果治疗后100％的患者(N=60)形成对DNP修饰的自体肿瘤细胞的阳性DTH反应(≥5mm硬结直径)，85％形成强阳性反应(≥10mm硬结直径)。应用DNP修饰的自体癌膜疫苗预期有类似的成功，即，预期患者形成对DNP修饰的和未修饰的自体癌细胞膜的DTH。
从前面的叙述可知，除此处所示及所述之外，本发明的多种修改对本领域的技术人员是显然的。这些修改也处于附加权利要求书的范围之内。
参考文献
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美国专利号5，290，551美国专利申请系列号08／203，004美国专利申请系列号08／479，016美国专利申请系列号08／899，905美国专利申请系列号08／942，794PCT US 96／0951权利要求
1．一种含有半抗原修饰的人肿瘤细胞膜的组合物。
2．权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞膜分离自选自癌细胞和非实体瘤细胞的肿瘤细胞。
3．权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞膜来源于选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、肾癌和前列腺癌的肿瘤。
4．权利要求3的组合物，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
5．权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞膜是选自同源肿瘤细胞膜和同种异体肿瘤细胞膜的肿瘤细胞膜。
6．权利要求5的组合物，其中所述同源肿瘤细胞膜是自体的。
7．权利要求1的组合物，其中所述半抗原选自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其组合。
8．权利要求1的组合物，其还含有佐剂。
9．权利要求8的组合物，其中所述佐剂选自卡介苗、QS-21、脱毒的内毒素和细胞因子。
10．权利要求1的组合物，其具有当对患有与所述肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤的人施用时，能引发浸润该病人肿瘤的T淋巴细胞的性质。
11．权利要求1的组合物，其具有当对患有与所述肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤的人施用时，能引发对该病人肿瘤的炎性免疫应答的性质。
12．权利要求1的组合物，其具有当对患有与所述肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤的人施用时，能引发对该病人肿瘤的迟发型过敏反应的性质。
13．权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞膜是同种异体的，该组合物进一步包含一种抗原呈递细胞。
14．权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞膜是同种异体的，所述抗原呈递细胞是同源的。
15．权利要求1的组合物，其中所述肿瘤细胞膜是同种异体的，所述抗原呈递细胞是自体的。
16．一种治疗癌症的方法，包括对人施用一种含有治疗有效量的半抗原修饰的人肿瘤细胞膜的组合物，其中该病人患有与该肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤。
17．权利要求16的方法，包括引发浸润该病人肿瘤的T淋巴细胞和测定浸润该病人肿瘤的T淋巴细胞。
18．权利要求16的方法，包括引发对该病人肿瘤的炎性免疫应答和测定该炎性免疫应答。
19．权利要求16的方法，包括引发对该病人肿瘤的迟发型过敏反应和测定该迟发型过敏反应。
20．权利要求16的方法，其中所述恶性肿瘤选自癌和非实体瘤。
21．权利要求16的方法，其中所述恶性肿瘤选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、肾癌和前列腺癌。
22．权利要求21的方法，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
23．权利要求16的方法，其中所述肿瘤细胞膜是选自同源肿瘤细胞膜和同种异体肿瘤细胞膜的肿瘤细胞膜。
24．权利要求23的方法，其中所述同源肿瘤细胞膜是自体的。
25．权利要求16的方法，其中所述半抗原选自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其组合。
26．权利要求16的方法，其中所述组合物还含有一种佐剂。
27．权利要求26的方法，其中所述佐剂选自卡介苗、QS-21、脱毒的内毒素和细胞因子。
28．权利要求16的方法，其中所述肿瘤细胞膜是同种异体的，所述组合物进一步含有一种抗原呈递细胞。
29．权利要求16的方法，其中所述肿瘤细胞膜是同种异体的，所述抗原呈递细胞是同源的。
30．权利要求16的方法，其中所述肿瘤细胞膜是同种异体的，所述抗原呈递细胞是自体的。
31．一种引发浸润哺乳动物肿瘤的T淋巴细胞的方法，包括对该哺乳动物施用一种治疗有效量的半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞膜，其中该哺乳动物患有一种与该肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤。
32．权利要求31的方法，其中所述哺乳动物是人或选自犬、猫、牛和马科的动物。
33.一种引发对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答的方法，包括对该哺乳动物施用一种治疗有效量的半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞膜，其中该哺乳动物患有一种与该肿瘤细胞相同类型的恶性肿瘤。
34．权利要求33的方法，其中所述哺乳动物是人或选自犬、猫、牛和马科的动物。
35．一种引发对哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应的方法，包括对该哺乳动物施用一种治疗有效量的半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞膜，其中该哺乳动物患有一种与该肿瘤细胞膜相同类型的恶性肿瘤。
36．权利要求35的方法，其中所述哺乳动物是人或选自犬、猫、牛和马科的动物。
37．一种制备半抗原修饰的肿瘤细胞膜的方法，包括裂解肿瘤细胞获得裂解的肿瘤细胞，从该裂解的肿瘤细胞中除去细胞核获得无细胞核的肿瘤细胞，由该无细胞核的肿瘤细胞获得基本上无细胞的肿瘤细胞膜，并使该肿瘤细胞膜经一种半抗原处理，获得半抗原修饰的肿瘤细胞膜。
38．权利要求37的方法，其中所述裂解选自低渗休克、机械分裂和酶促分裂。
39．权利要求37的方法，其中所述半抗原选自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其组合。
40．一种分离的半抗原修饰的哺乳动物肿瘤细胞膜。
41．权利要求40的膜，其中所述哺乳动物是人或选自犬、猫、牛和马科的动物。
42．权利要求41的膜，其中所述哺乳动物是人。
43．权利要求42的膜，其中该膜分离自选自癌细胞和非实体瘤细胞的肿瘤细胞。
44．权利要求42的膜，其中该膜来源于选自白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳癌、肺癌、肾癌和前列腺癌的肿瘤。
45．权利要求44的膜，其中所述白血病是急性骨髓性白血病。
46．权利要求40的膜，其选自同源肿瘤细胞膜和同种异体肿瘤细胞膜。
47．权利要求46的膜，其中所述同源肿瘤细胞膜是自体的。
48．权利要求40的膜，其中所述半抗原选自二硝基苯、三硝基苯、N-碘乙酰基-N’-(5-磺基-1-萘基)乙二胺、三硝基苯磺酸、异硫氰酸荧光素、砷酸苯异硫氰酸酯、三硝基苯磺酸、磺胺酸、阿散酸、二硝基苯-S-芥及其组合。
49．权利要求40的膜，其至少具有下列性质之一(ⅰ)引发浸润哺乳动物肿瘤的T淋巴细胞，(ⅱ)引发对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答，(ⅲ)引发对哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应和(ⅳ)在体外刺激T细胞。
50．权利要求40的膜，其中该膜是一种细胞外膜。
51．权利要求40的膜，其中该膜包括含有MHC分子、热激蛋白或其组合的膜部分。
52．一种包含权利要求40的膜的组合物。
全文摘要
本发明涉及分离的肿瘤细胞膜、其组合物、制备该膜和组合物的方法、和治疗癌症的方法。本发明的组合物包括由半抗原修饰的肿瘤细胞制备的组合物。本发明的肿瘤细胞膜和组合物具有下列性质:当向患有与所述肿瘤细胞相同类型的恶性肿瘤的哺乳动物施用时,能引发浸润哺乳动物肿瘤的T淋巴细胞,引发对哺乳动物肿瘤的炎性免疫应答,引发对哺乳动物肿瘤的迟发型过敏反应。本发明的膜和组合物也能在体外刺激T细胞。本发明的方法涉及治疗癌症,包括施用一种治疗有效量的肿瘤细胞膜。本发明也涉及一种制备半抗原修饰的肿瘤细胞膜的方法和含有该膜的剂型。
文档编号A61K39/385GK1291105SQ99803065
公开日2001年4月11日 申请日期1999年2月17日 优先权日1998年2月17日
发明者D·伯德, 佐藤隆美 申请人:托马斯杰斐逊大学