专利名称：不同产地明党参植物的分子鉴别方法
技术领域：
本发明涉及不同产地明党参植物的分子鉴别方法，属于生药学领域。
技术背景-
明党参C/z""g/謂扁;;m/ozWM Wolf始见于《本草纲目拾遗》，是伞形科明党参属单种植物， 分布于我国华东地区的江苏、浙江、安徽、湖北、江西等狭小的范围，干燥根因具有滋补强 壮、润肺化痰、平肝解毒、安中和胃等功效被收载在《中国药典》中，是我国特有的名贵中 药材，同时也是江苏道地药材之一。
道地药材是该药材原物种在其产地的种系与区系的发生发展过程中，长期受着孕育该物 种的历史环境条件与人类活动作用而形成的特殊产物，是具有特定的生产区域(地理学及生态 学)，悠久的产销历史(商品集散地)，其产品具有良好的社会信誉并能产生可观经济效益的药 材，其产品货真、质优，品质稳定可靠，为世人称道者。中药的产地及其质量、疗效间有密 切关系，在传统上， 一贯对药材是否来自原产地给予很大重视，往往以地产、地道药材作为 质优的标志。由于同种药用植物的外形在其分布区内基本没区别，从形态上很难对它们的来 源进行鉴别。道地产区与非道地产区的明党参在形态上没差别，仅在质量上有差距，运用形 态学手段不可能对其进行来源鉴别。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴别不同产地明党参植物的分子鉴别方法，其特证在于用特定
的DNA序列对明党参进行来源鉴别，使明党参的来源鉴别更可靠、准确，同时为道地药材 的鉴别提供高特异性鉴别方法。
本发明首先对不同产地明党参的rDNAITS区进行测序，得到部分ITS1序列及完整的5.8S 和ITS2的序列，再通过序列比对找到不同产地明党参的鉴别性位点，并在此基础上对道地产 区江苏句容的明党参进行了高特异性PCR鉴定。
本发明中利用rDNAITS区DNA序列对明党参进行来源鉴别所采用的歩骤如下
(1) 总DNA提取
取待检明党参植物新鲜的叶片，用无菌水处理后，在液氮中研磨成细粉，用CTAB法提取 总DNA，然后用北京莱博生物实验材料研究所生产的DNA纯化回收试剂盒纯化，溶解于灭菌 双蒸水中。
(2) PCR扩增
明党参ITS区扩增的引物为ITS区通用引物ITS4和ITS5，引物序列为 ITS4: 5、-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3、，位于18S上； ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3、，位于26S上。 利用该对引物对总DNA进行扩增反应，并以ddH20代替模版DNA作空白对照。
(3) DNA序列测定
采用PCR产物直接测序法，单向测序，测序引物为PCR引物ITS5，测序反应在ABI 3730 全自动测序仪上进行。
(4) DNA序列数据分析及植物来源的鉴别 将所得rDNAITS区的序列用对位排列软件(CLUSTAL软件)进行对位排列，并辅以人
工校对，用遗传分析软件(MEGA软件)分析待检样品DNA序列与数据库中各序列的差异， 通过分析比较，最终判定检明党参植物的来源。
本发明还利用高特异性PCR鉴别引物对道地产区江苏句容的明党参进行了來源鉴别。首 先参照不同产地明党参的rDNAITS区序列，设计一对江苏句容明党参的高特异性鉴别引物， 上游鉴别引物JR: 5、-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'的设计参考了江苏句容明党参rDNA ITS区的5.8S和ITS2部分，江苏句容3个明党参样品ITS2序列的第8个位点的碱基都为C， 而其他产地的18个明党参样品在该位点的碱基都为T，故将该位点定为上游鉴别引物3'端的 第一个碱基，鉴于该特异性位点前的一段序列的GC含量较高，所以在设计上游鉴别引物时 对3个位点的碱基进行了改动，所以上游鉴别引物与江苏句容明党参的rDNA ITS区序列并 不完全互补。下游鉴别引物为ITS区扩增的通用引物ITS4。
在进行高特异性PCR鉴别之前，首先用引物ITS4和ITS5对不同來源的明党参进行扩增， 检测是否所有样品都能扩增出约700bp左右的片段以及扩增片段的亮度，以验证模版DNA 的质量、调整模版DNA的浓度，然后用鉴别引物JR和ITS4对模版DNA进行扩增，当退火 温度控制在68'C时，只有江苏句容的明党参能被扩增出来，而其他产地的明党参均为阴性， 用琼脂糖凝胶电泳即可检测扩增反应的结果。
根据类似方法可以设计出其他产地明党参的鉴别引物。
本发明有益效果
本发明利用特定的重复多拷贝rDNAITS区序列，通过CLUSTAL、 MEGA等分析软件进 行分析比较，最终实现了明党参的来源鉴别。序列分析比较结果显示，不同产地明党参的rDNA ITS区序列之间有较大差异，同一产地(居群)明党参个体间的rDNAITS区序列差异在0-3 个碱基之间，变异不大，序列附表仅列出各居群明党参一个样品的rDNA ITS区序列。通过 分析比较得到的变异位点能很好地对其进来源鉴别，因此，利用本方法对明党参进行来源
别具有高度的准确性。近年来，DNA测序成本不断降低，利用测序的方法进行鉴别已成为一 种趋势。
由于测序费用相对较高、且需要一定的仪器设备，在对大批量药材进行來源鉴别的实际 操作中受到很大的限制。本发明还根据不同产地明党参的rDNA ITS区序列，设计出鉴别道 地产区(江苏句容)明党参的鉴别引物，从而进行高特异性PCR鉴别，为道地药材的鉴别提 供快速、实用的方法。
具体实施例方式
实施例
利用高特异性PCR鉴别引物鉴定江苏句容明党参植物
本实施例取7个产地共32个明党参个体的新鲜叶片或硅胶干燥的叶片，依次编号为JR1 -JR5 (江苏句容)，NJ1-NJ5 (江苏南京)，AQ1-AQ5 (安徽安庆)，QY1-QY5 (安徽青阳)， HZ1-HZ5 (浙江杭州)，NB1-NB5 (浙江宁波)，PZ1-PZ2 (江西彭泽)，均通过以下歩骤进行 鉴别
(1 )待检植物总DNA提取 取待检明党参植物样品新鲜的叶片，用无菌水处理后，在液氮中研磨成细粉，用CTAB法 提取总DNA，然后用北京莱博生物实验材料研究所生产的DNA纯化回收试剂盒纯化，溶解于 灭菌双蒸水中。
(2) 模版DNA的质量检测
用ITS区通用引物ITS4和ITS5对待检明党参样品总DNA进行扩增反应，检测是否所 有样品都能扩增出约700bp左右的片段以及扩增片段的亮度，以验证模版DNA的质量、调 整模版DNA的浓度。
PCR扩增反应在PE-9600 PCR仪上进行，20 (^L反应体系的组分及终浓度为lx丁aq DNA酶缓冲液(10 mmol/LTris-HCl ， 5Ommol/LKC1 ， 0.1%Trion x-100 ， pH8.4 )， 2.5mmol/LMgC12， lUTaq酶，约50ng模板，0.3pmol/L引物，0.15mmol/L dNTP。扩增程序 为94°C，预变性3.0min; 94。C变性45s， 68。C退火30s， 72。C延伸1 min， 35个循环，以 ddH20代替模版DNA作空白对照。
(3) 运用鉴别引物JR和ITS4对模版DNA进行扩增
PCR扩增反应与模版DNA的质量检测中的操作一样，仅将其中的扩增引物ITS5更换为 JR。当退火温度控制在68'C时，只有江苏句容的5个明党参样品能被扩增出来，而其他产地 的明党参样品均为阴性，用琼脂糖凝胶电泳即可检测扩增反应的结果。
综上所述，本发明设计的高特异性PCR鉴别引物和PCR方法可以准确鉴别道地产区江苏句容的明党参。建立不同产地明党参植物的rDNAITS区，包括部分ITS1序列及完整的5.8S和ITS2 的序列数据库及各产地明党参植物的特异性鉴别位点，其特征是按如下歩骤进行
(a) 总DNA提取
取待检明党参植物新鲜的叶片，用无菌水处理后，在液氮中研磨成细粉，用CTAB法提取 总DNA，然后用北京莱博生物实验材料研究所生产的DNA纯化回收试剂盒纯化，溶解于灭菌 双蒸水中
(b) PCR扩增
明党参ITS区扩增的引物为ITS区通用引物ITS4和ITS5，引物序列为 ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3、，位于18S上； ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'，位于26S上。 利用该对引物对总DNA进行扩增反应，并以ddH20代替模版DNA作空白对照。
(c) DNA序列测定
测序采用PCR产物直接测序法，单向测序，测序引物为PCR扩增引物ITS5，测序反应 在ABI 3730全自动测序仪上进行。
(d) DNA序列数据分析及植物来源的鉴别 待检明党参植物的rDNAITS区的序列一经测定，用对位排列软件(CLUSTAL软件)进
行对位排列，并辅以人工校对，用遗传分析软件(MEGA软件)分析待检样品DNA序列与 数据库中各序列的差异，通过分析比较，最终判定待检明党参植物的来源。 2.道地产区(江苏句容)明党参植物的高特异性PCR鉴别方法，其特征是通过比较不同产地 明党参植物的rDNAITS序列，设计出鉴别江苏句容明党参植物的高特异性引物。江苏句容明 党参植物的鉴别引物为上游鉴别引物为JR: 5'-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'，下游鉴别 引物为ITS区扩增的通用引物ITS4。具体步骤为 O)总DNA提取
取待检明党参植物新鲜的叶片，用无菌水处理后，在液氮中研磨成细粉，用CTAB法提取 总DNA，然后用北京莱博生物实验材料研究所生产的DNA纯化回收试剂盒纯化，溶解于灭菌 双蒸水中。
(2)模版DNA的质量检测
用ITS区通用引物ITS4和ITS5对待检品总DNA进行扩增，以验证DNA模版质量、调 整模版DNA的浓度。ITS4和ITS5序列为
ITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，位于18S上；
ITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3、，位于26S上。(3) 运用鉴别引物JR、 ITS4对模版DNA进行扩增，将退火温度升至68'C，能被扩增 出来的即来源于江苏句容，而其他来源的明党参均为阴性。
(4) 利用高特异性PCR鉴别引物对道地产区江苏句容的明党参进行了来源鉴别，参照 不同产地明党参的rDNA ITS区序列，设计一对江苏句容明党参的高特异性鉴别引物，上游 鉴别引物JR: 5'-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'的设计参考了江苏句容明党参rDNAITS区 的5.8S和ITS2部分，江苏句容3个明党参样品ITS2序列的第8个位点的碱基都为C，而其 他产地的18个明党参样品在该位点的碱基都为T。
序列表
〈110〉江苏省中国科学院植物研究所 〈120〉不同产地明党参植物的分子鉴别方法 〈160〉 9
<210> 1 <211〉 555 <212〉 DNA
〈213〉来源于明党参(C/^"g/wwwy;r"ioz^fey)-江苏句容居群 〈400〉1
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〈210〉 2
<211〉 555
〈212〉 DNA
<213〉来源于明党参(Cto"g山m sm;^m'o/^y)-江苏南京居群
〈400〉 2
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<211> 555
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〈213〉来源于日月党参(C72awg/ww sm少厂"/cw'&"-安徽安庆居群
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〈210〉 4
〈211〉 555
〈212〉 DNA
<213〉来源于明党参(C/2""g/wm wy^m'oz'^y)-安徽青阳居群
〈400〉 4
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〈210〉 5
〈211〉 555
<212> DNA
〈213〉來源于明党参(0 a/7g7'咖-浙江杭州居群
〈400〉 5
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〈210〉 6
<211〉 555
〈212〉 DNA
<213>来源于明党参(C/j朋g/www7""/o/fl^)-浙江宁波居群
〈400> 6ggcaagcgtcggtgggcttgattcccccgttgcgaacccc郷caggtgggcgctcccgg60
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〈210〉 7 <211> 555 〈212>腿
〈213〉来源于明党参(C7w g/wwj/^ATO'oW^)-江西彭泽居群 <400> 7
ggcaagcgtcggtgggcttggttcccccgttgcgaaccccgcgctcccgg60
gcgctcgtcggccgacgaaatcaaccgggcgcgg犯tgcgccaaggaaat120
ttgtacgtttgcttcccgttcgtggg鄉cggcgtctttcacgactctcg180
tcccggctcttgcatcgatgaagaacgtagcga幼tgcgatacttggtgt240
gaattgcagaatcccgtg犯ccatcgagtctttg33CgC￡Lagttgcgcccgaagccgcta300
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<210〉 8 <2il> 20 〈212〉 DNA 〈213〉人工引物 <400> 8
tcctccgctt attgatatgc 20
<210〉 9 〈211〉 22 <212> DNA 〈213〉人工引物 〈400〉 9
ggaagtaaaa gtcgt33caa gg 2权利要求
1.一种不同产地明党参植物的DNA分子鉴别方法，建立不同产地明党参植物的rDNAITS区，包括部分ITS1序列及完整的5.8S和ITS2的序列数据库及各产地明党参植物的特异性鉴别位点，其特征是按如下步骤进行(1)总DNA提取取待检明党参植物新鲜的叶片，用无菌水处理后，在液氮中研磨成细粉，用CTAB法提取总DNA，然后用北京莱博生物实验材料研究所生产的DNA纯化回收试剂盒纯化，溶解于灭菌双蒸水中(2)PCR扩增明党参ITS区扩增的引物为ITS区通用引物ITS4和ITS5，引物序列为ITS45`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`，位于18S上；ITS55`-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3`，位于26S上；利用该对引物对总DNA进行扩增反应，并以ddH2O代替模版DNA作空白对照；(3)DNA序列测定测序采用PCR产物直接测序法，单向测序，测序引物为PCR扩增引物ITS5，测序反应在ABI 3730全自动测序仪上进行；(4)DNA序列数据分析及植物来源的鉴别待检明党参植物的rDNAITS区的序列一经测定，用对位排列软件(CLUSTAL软件)进行对位排列，并辅以人工校对，用遗传分析软件(MEGA软件)分析待检样品DNA序列与数据库中各序列的差异，通过分析比较，最终判定待检明党参植物的来源。
2、 根据权利要求1不同产地明党参植物的DNA分子鉴别方法，道地产区(江苏句容)明 党参植物的高特异性PCR鉴别方法，其特征是通过比较不同产地明党参植物的rDNAITS序列， 设计出鉴别江苏句容明党参植物的高特异性引物，江苏句容明党参植物的鉴别引物为上游 鉴别引物为JR: 5' -TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'，下游鉴别引物为ITS区扩增的通用引物 ITS4;具体歩骤为(1) 总DNA提取取待检明党参植物新鲜的叶片，用无菌水处理后，在液氮中研磨成细粉，用CTAB法提取 总DNA，然后用北京莱博生物实验材料研究所生产的DNA纯化回收试剂盒纯化，溶解于灭菌双蒸水中；(2) 模版DNA的质量检测用ITS区通用引物ITS4和ITS5对待检品总DNA进行扩增，以验证DNA模版质量、调 整模版DNA的浓度；ITS4和ITS5序列为ITS4: 5、-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3',位于18S上； ITS5: 5' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 、，位于26S上；G)运用鉴别引物JR、 ITS4对模版DNA进行扩增，将退火温度升至68'C，能被扩增 出来的即來源于江苏句容，而其他来源的明党参均为阴性。
3、根据权利要求1不同产地明党参植物的DNA分子鉴别方法，本发明的特证是利用高 特异性PCR鉴别引物对道地产区江苏句容的明党参进行了来源鉴别，参照不同产地明党参的 rDNA ITS区序列，设计一对江苏句容明党参的高特异性鉴别引物，上游鉴别引物JR: 5、-TGAGTGTCATGTATCGTGTC-3'的设计参考了江苏句容明党参rDNA ITS区的5.8S和 ITS2部分，江苏句容3个明党参样品ITS2序列的第8个位点的碱基都为C，而其他产地的 18个明党参样品在该位点的碱基都为T。
全文摘要
本发明涉及不同产地明党参植物的分子鉴别方法。该方法在对不同产地明党参植物进行总DNA提取、PCR扩增、rDNA ITS序列测定、分析等过程的基础上，找到了鉴别不同产地明党参植物的碱基位点。当待检测明党参植物的rDNA ITS序列与本发明公开的各产地明党参的DNA序列相符或有该产地明党参的特异性位点时为该产地的明党参。根据不同产地明党参植物的rDNA ITS序列，设计出可鉴别道地产区(江苏句容)明党参的高特异性鉴别引物，能成功进行道地产区明党参植物的高特异性PCR鉴别。
文档编号C12Q1/68GK101182572SQ200710135290
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月15日 优先权日2007年11月15日
发明者吴宝成, 杭悦宇, 赵亚美, 韦阳连, 顾子霞, 兴 高 申请人:江苏省中国科学院植物研究所