专利名称：：三种红鲤遗传渐渗的分子鉴别方法
技术领域：
：本发明涉及红鲤遗传渐渗的分子鉴别方法，具体地，涉及我国三种著名红鲤，艮卩兴国红鱼里(Q/rp/wi^ca，》var.Wwgwowew57、)、荷包红趣(Q^t/"wsc"r/7/ovar.ww7w"wem7X)禾口玻璃红旁里(Cy77/wwscarp/ovar.wcmtmews/力发生杂交，产生遗"[专参透曰寸的分子遗传鉴别方法，属于遗传学领域
背景技术：
：红鲤是指体色为红色的鲤鱼，它相对于青灰色(或黑色)的普通鲤而言，体色上具有显著区别，是普通野鲤的体色相关基因发生突变而来的。红鲤是我国鲤中的一个特殊类群，是重要的鲤科鱼类种质资源，是我国优良的鱼类育种材料，参与构建了生产上许多具有较高经济价值和社会效益的杂交组合，产生了巨大的生产、经济价值和社会效益。表l为全国水产原、良种审定委员会审定通过的由红鲤构建的杂交种表l由红鲤做父本或母本所生产的杂交种<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>除上述杂交种外，其它地方性杂交种或培育品种也均采用兴国红鲤或荷包红鯉作杂交亲本，如1990年《遗传学报》17巻第l期34-37报道了以河南省淇河县的淇鲫为母本，兴国红鲤为父本而获得的雌核发育子代一异育淇鲫。此外我国著名的建鲤在育成过程中也采用了荷包红鲤的遗传因子。在外形上，兴国红鲤、玻璃红鲤为纺缍形。兴国红鲤体长与体高之比在2.65以上；玻璃红鲤幼鱼阶段的鱼体肌肉和鳃盖透明，肉眼可见其内脏和鳃，成鱼阶段仍可透视鳃部轮廓，体长与体高之比2.70以上。荷包红鲤与上述二种红鲤差异明显，表现头小、尾短、背高、体宽，背部隆起，腹部肥大，形似荷包，体长与体高之比在2.02.30之间。表2为三种红鲤外部形态可量性状的比例变化。从总体上，在外形上能将三种红鲤较好地区别开来。表2三种红鲤外部形态的可量性状比例<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>由于鱼类属低等的脊椎动物，具有非凡的杂交能力，许多鱼类在种间甚至属间均可能杂交，这给鱼类的遗传管理带来了很大困难。同时，鱼类的这种超强杂交能力，还会给不同品种的遗传渐渗提供了广泛机会，造成对优良品种的遗传保护极为困难。兴国红鲤(品种登记号GS01001-1996)、荷包红鲤(品种登记号GS01002-1996)和玻璃红鲤(品种登记号GS01002-2000)是我国著名的优良水产品种，是经过多年系统选育而成的良种，具有优良的遗传育种价值。在引进地的生产实践中，由于管理不当，很易造成它们相互间的遗传渐渗，但却无法区别它们遗传渐渗的方式，即无法区别谁为杂交父本，谁为杂交母本。需发展一种检测技术与方法来鉴别它们间的遗传渐渗方式，同时为这三种红鲤的遗传管理与保护提供一项技术手段。由于这三种红鲤在外形上很容易鉴别，研究中往往重视它们的遗传多样性状况和相互间的亲缘关系，而对它们间的特异性分子遗传差异却研究很不足，尤其是缺乏可用于它们间相互鉴别、可靠的特异性分子标记。申请者在对这三种红鲤进行遗传多样性和系统进化分析时，通过线粒体con基因序列分析，发现在这三种鱼中存在特异性的单核苷酸差异位点(SNP)(具体如SEQIDNo.3至SEQIDNo.5所述，其中带方框的为特异性的单核苷酸差异位点)。进而应用较大的样本数量进行验证(每种鱼各25尾样本)，确认在2个位点存在可靠的单核苷酸差异位点(SNP)，可以用于它们的种群鉴定和遗传渐渗标记。由于线粒体DNA为母性遗传方式，通过检测它们间线粒体COII序列的差异来鉴别它们间的遗传渐渗。
发明内容本发明的目的在于提供一种鉴别兴国红鲤、荷包红鲤和玻璃红鲤及其相互间杂交而产生遗传渐渗的方法，该方法是通过扩增它们线粒体DNA的COII(细胞色素c氧化酶亚基II)基因序列，检测这些DNA序列的单核苷酸多态性位点(SNP)而实现。本发明提供的技术方案是一种鉴别兴国红鲤、荷包红鲤和玻璃红鲤相互间遗传渐渗的方法，包括下列步骤(1)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA;尤其是怀疑存在遗传渐渗的红鲤。(2)以提取的基因组DNA为模板，根据COII基因设计引物以进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，纯化和克隆，其中扩增片段包含COII基因的第279和408位核苷酸；(3)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对；(4)检测SNP位点首先检测COII基因的第279位点(COII-279)，若该位点为核苷酸C，则为玻璃红鲤或杂交种中含有玻璃红鲤作母本的遗传因子；若该位点为核苷酸T，需进一步检测第408位点(COII-408)。若位点COII-408为核苷酸A，则为兴国红鲤或杂交种中含有兴国红鲤作母本的遗传因子，若为核苷酸G，则为荷包红鲤或杂交种中含有荷包红鲤作母本的遗传因子；或者先检测COII基因的第408位点(COII-408)，若该位点为核苷酸A，则为兴国红鲤或杂交种中含有兴国红鲤作母本的遗传因子，若为G，则进一步检测第279位点(COII-279)，若第279位点(C0II-279)为C，则为玻璃红鲤或杂交种中含有玻璃红鲤作母本的遗传因子，若为T，则为荷包红鲤或杂交种中含有荷包红鲤作母本的遗传因子。COII基因的SNP位点如下表3所示表3兴国红鲤、玻璃红鲤和荷包红鲤的COII基因的SNP位点<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所述引物序列为SEQIDNo.l和SEQIDNo.2所述，即COII-F(5，-TAATGGCACACCCAACGCAAC-3，)禾BCOII-R(5，-AGCTTCCTAGCGAGGCGTCTT-3，)。本发明具有如下优点可有效、准确地进行鉴别兴国红鲤、荷包红鲤和玻璃红鲤相互间遗传渐渗方式，从而为我国红鲤的遗传管理与保护提供一项技术手段，具有重大的实用价值。图l为部分个体线粒体coii基因的扩增图谱，其中l15为样本号(1-5为兴国红鲤，6-10为玻璃红鲤，11-15为荷包红鲤)，M为ADNA+EcoRI+HindlIIDNA分子量标记。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施l:样本采取取兴国红鲤、荷包红鲤和玻璃红鲤样本，或取怀疑它们间存在遗传渐渗的个体。本发明人选择了兴国红鲤、荷包红鲤和玻璃红鲤的成鱼阶段样本(规格500-800克)各25尾，有足够数量，因此获得的结果具有统计学意义，准确可靠。实施2:DNA提取取每尾鱼的尾鳍组织约0.2cm2，装入1.5ml的离心管中，加入400pLSTE缓冲液(3Ommol/LTris-HCl，pH8.0,200mmol/LEDTA,5Ommol/LNaCl)。混匀后加入浓度为10。/。的SDS卯nL和20mg/mL的蛋白酶K10|aL,55。C消化810h;加入等体积饱和酚于转轮上缓慢转动lh，10,000r/min离心8min，吸取上清液加入等体积的混合液(酚氯仿异戊醇=25:24:1);缓慢转动30min，10,000r/min离心8min，取上清液加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿异戊醇=24:1)，缓慢转动5min，10,000r/min离心5min，取上清液后，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗涤，干燥，加入30(VL的TE液溶解备用。实施3.PCR扩增与产物克隆、测序根据已有鲤线粒体基因组全序列，设计一对用于扩增COII基因的引物，引物序列为COII-F(正向弓|物)如SEQIDNo.l所述，艮卩5'-TAATGGCACACCCAACGCAAC-3'，以及COII-R(反向引物)5'-AGCTTCCTAGCGAGGCGTCTT陽3'，即如SEQIDNo.2所述。以提取的DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为50)iL，内含5iaLPCR缓冲液(10mmol/LTris-HCL，pH9.0，5Ommol/LKCL，3Ommol/LMgCL2，0.01%的明胶)，2nLdNTP混合液(每种dNTP0.1mmol/L)，4pL的引物(0.2pmol/L)，2)iL基因组DNA(50ng/|al)，2pLTaq酶(2IU)，35pL的蒸馏水。扩增反应条件为94。C预变性5min，接下来进行30个循环，每个循环包括94'C30s，54°C30s，72°Clmin，30个循环后，72'C延伸5min。扩增的目的序列产物以琼脂糖电泳检査，其片段大小如附图l所示。纯化PCR扩增产物，连接插入载体pUC18，转化大肠杆菌感受态细胞DH5c，筛选重组子进行内切酶酶切和PCR检验。然后选取重组子于3730型Bigdye-Terminator全自动测序仪上进行测序。实施4:测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对用BioEdit软件对测序结果进行重排和同源比较，与GenBank中的鲤线粒体DNA全序列(序列号NC—001606)对照，确定COII基因的启始位置和启始密码子ATG。三种红鲤的con基因序列见附后序列表，兴国红鲤、荷包红鲤、玻璃红鲤的con基因序列分别见SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5(带方框的为特异性的单核苷酸差异位点)。具体地，三种红鲤的COII基因的SNP位点如表3所述。因此，可以査找上述单核苷酸变异位点，根据位点差异鉴定三种红鲤的遗传渐渗情况。首先检测COII基因的第279位点(COII-279)，若该位点为核苷酸C，则为玻璃红鲤(或杂交种中含有玻璃红鲤作母本的遗传因子)；若该位点为核苷酸T，需进一步检测第408位点(COII-408)。若位点COII-408为核苷酸A，则为兴国红鲤(或杂交种中含有兴国红鲤作母本的遗传因子)，若为核苷酸G，则为荷包红鲤(或杂交种中含有荷包红鲤作母本的遗传因子)。或者，首先检测COII基因的第408位点(COII-408)，若该位点为核苷酸A，则为兴国红鲤或杂交种中含有兴国红鲤作母本的遗传因子，若为G，则进一步检测第279位点(COII-279)，若第279位点(COII-279)为C，则为玻璃红鲤或杂交种中含有玻璃红鲤作母本的遗传因子，若为T，则为荷包红鲤或杂交种中含有荷包红鲤作母本的遗传因子。核苷酸序列表(注带方框的为特异性的单核苷酸差异位点)〈110〉王成辉〈120〉三种红鲤遗传渐渗的分子鉴别方法〈160〉5〈210〉1〈211>21〈212〉腿<213>人工序列<220〉<223>人工序列的描述人工合成的序列<400〉1TAATGGCACACCCAACGCAAC21〈210〉2〈211〉21〈212>DNA〈213〉人工序列〈220><223>人工序列的描述人工合成的序列〈400〉2AGCTTCCTAGCGAGGCGTCTT21<210〉3<211〉691〈212〉DNA<213>兴国红鲤〈400〉3ATGGCACACCCAACGCAACTAGGTTTCCAAGACGCGGCCATACCCGTTATAGAAGAACTT60CTTCACTTCCACGACCACGCATTAATAATTGTGCTCCTAATTAGCACTTTAGTGTTATAT120ATTATTACTGCAATGGTATCAACCAAACTTACTAATAAATATATTCTAGACTCCCAAGAA180ATCGAAATTGTATGAACCATTCTACCAGCCGTCATTTTAGTACTAATCGCCCTGCCCTCC240CTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAAATTAACGACCC@CACCTGACAATTAAAGCAATA300GGACACCAATGATACTGAAGTTACGAGTATACAGACTATGAAAATCTAGGATTCGACTCC360TATATAGTACCAACCCAAGACCTTGCCCCCGGACAATTCCGACTTCT囚GAAACAGACCAC420CGAATAGTTGTTCCAATAGAATCCCCAGTCCGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA480CATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTAAAAATGGACGCAGTCCCAGGACGACTAAAT540CAAGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGTGTTTTACGGACAATGCTCTGAAATTTGT600GGAGCTAATCACAGCTTTATACCAATTGTAGTTGAAGCAGTACCTCTCGAACACTTCGAA660AACTGATCCTCATTAATACTAGAAGACGCCT691<210>4<211>691〈212〉DNA<213>荷包红鲤〈400〉4ATGGCACACCCAACGCAACTAGGTTTCCAAGACGCGGCCATACCCGTTATAGAAGAACTT60CTTCACTTCCACGACCACGCATTAATAATTGTGCTCCTAATTAGCACTTTAGTGTTATAT120ATTATTACTGCAATGGTATCAACCAAACTTACTAATAAATATATTCTAGACTCCCAAGAA180ATCGAAATTGTATGAACCATTCTACCAGCCGTCATTTTAGTACTAATCGCCCTGCCCTCC240CTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAAATTAACGACCC@CACCTGACAATTAAAGCAATA300GGACACCAATGATACTGAAGTTACGAGTATACAGACTATGAAAATCTAGGATTCGACTCC360TATATAGTACCAACCCAAGACCTTGCCCCCGGACAATTCCGACTTCT回GAAACAGACCAC420CGAATAGTTGTTCCAATAGAATCCCCAGTCCGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA480CATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTAAAAATGGACGCAGTCCCAGGACGACTAAAT540CAAGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGTGTTTTACGGACAATGCTCTGAAATTTGT600GGAGCTAATCACAGCTTTATACCAATTGTAGTTGAAGCAGTACCTCTCGAACACTTCGAA660AACTGATCCTCATTAATACTAGAAGACGCCT691〈210〉5〈211〉691〈212〉腿〈213〉玻璃红鲤〈400〉5ATGGCACACCCAACGCAACTAGGTTTCCAAGACGCGGCCATACCCGTTATAGAAGAACTT60CTTCACTTCCACGACCACGCATTAATAATTGTGCTCCTAATTAGCACTTTAGTGTTATAT120ATTATTACTGCAATGGTATCAACCAAACTTACTAATAAATATATTCTAGACTCCCAAGAA180ATCGAAATTGTATGAACCATTCTACCAGCCGTCATTTTAGTACTAATCGCCCTGCCCTCC240CTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAAATTAACGACCC回CACCTGACAATTAAAGCAATA300GGACACCAATGATACTGAAGTTACGAGTATACAGACTATGAAAATCTAGGATTCGACTCC360TATATAGTACCAACCCAAGACCTTGCCCCCGGACAATTCCGACTTCT§GAAACAGACCAC420CGAATAGTTGTTCCAATAGAATCCCCAGTCCGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA■CATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTAAAAATGGACGCAGTCCCAGGACGACTAAAT540CAAGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGTGTTTTACGGACAATGCTCTGAAATTTGT600GGAGCTAATCACAGCTTTATACCAATTGTAGTTGAAGCAGTACCTCTCGAACACTTCGAA660AACTGATCCTCATTAATACTAGAAGACGCCT69权利要求1、一种鉴别兴国红鲤、荷包红鲤或玻璃红鲤，或所述三种红鲤相互间遗传渐渗的方法，包括下列步骤(1)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA；(2)以提取的基因组DNA为模板，根据COII基因设计引物以进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，纯化和克隆，其中扩增片段包含COII基因的第279和408位核苷酸；(3)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对；(4)结果判定先检测COII基因的第279位点，若该位点为核苷酸C，则为玻璃红鲤或杂交种中含有玻璃红鲤作母本的遗传因子；若该位点为核苷酸T，需进一步检测第408位点，若第408位点为核苷酸A，则为兴国红鲤或杂交种中含有兴国红鲤作母本的遗传因子，若为核苷酸G，则为荷包红鲤或杂交种中含有荷包红鲤作母本的遗传因子；或者先检测COII基因的第408位点，若该位点为核苷酸A，则为兴国红鲤或杂交种中含有兴国红鲤作母本的遗传因子，若为G，则进一步检测第279位点，若第279位点为C，则为玻璃红鲤或杂交种中含有玻璃红鲤作母本的遗传因子，若为T，则为荷包红鲤或杂交种中含有荷包红鲤作母本的遗传因子。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于所述引物序列正向引物为SEQIDNo.l所述和反向引物如SEQIDNo.2所述。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述待鉴定的红鲤是怀疑存在遗传渐渗的红鲤。全文摘要本发明公开了在兴国红鲤(Cyrpinuscarpiovar.singuonensis)、荷包红鲤(Cyrpinuscarpiovar.wuyuanensis)和玻璃红鲤(Cyrpinuscarpiovar.wananensis)及其相互发生杂交而产生遗传渗透时的分子遗传鉴别方法。采用所述的方法可有效、准确地进行鉴别，从而为我国红鲤的遗传管理与保护提供一项技术手段，具有实用价值。文档编号C12Q1/68GK101413029SQ20081018260公开日2009年4月22日申请日期2008年12月9日优先权日2008年12月9日发明者王成辉申请人:王成辉