与水稻高杆qtl紧密连锁的ssr分子标记与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记与应用，特别涉及水稻简单重 复序列（SSR，Simple sequence repeats)分析标记及其在水稻高杆基因遗传分析和精细定 位中的应用，属于DNA分子标记技术和分子生物学技术领域。
【背景技术】
[0002] SSR(simple sequence repeat，简单重复序列），又叫微卫星位点 (Microsatellites)，是由1-6个核苷酸的重复单元串联重复而成的序列（Sharma et al.， 2007)，也是一种基于PCR(polymerase chain reaction)的DNA分子遗传标记，广泛分布于 整个植物基因组。同一物种中不同材料的SSR基序重复次数不同，用重复区两侧相对保守的 单拷贝序列设计引物，对基因组总DNA进行扩增，扩增片断的长度多态性可作为不同材料的 特异分子标记。现已证实SSR存在于真核生物和绝大部分原核生物中。与RFLP、RAPD、AFLP等 分子标记相比，SSR具有多态性高、结果重复性高、稳定可靠、操作简便等特点，已成为遗传 分析和植物育种中应用最广泛的一类共显性分子标记(Plieske and Struss，2001)。传统 获得SSR标记的方法需通过建立、筛选基因组文库、克隆测序、引物设计等一系列实验，耗费 许多人力、物力。随着基因组测序越来越便捷，由基因组数据中直接开发SSR标记的方法也 被运用得越来越多。目前已在大豆、玉米、水稻、小麦、番茄、棉花等许多作物中开发出大量 的SSR引物，用于这些作物的遗传多样性评价以及其它工作中（Ziekiewicz et al. ,1994; Varshney et al.,2005)〇
[0003] 水稻是人类赖以生存的主要粮食作物，全世界约有1/2的人口以大米为主食。水稻 也是一种重要的战略性物资，占我国粮食总产的一半以上，保障水稻生产对确保我国粮食 安全和农业可持续发展有十分重要的战略意义。水稻由于具有基因组较小、遗传转化系统 建立完善以及与其它禾本科植物存在较好的共性等优点，已经成为禾本科植物以及单子叶 植物的模式植物（Izawa and Shimamoto，1996)。目前，根据水稻基因组测序结果已经开发 了大量SSR标记（McCouch et al.，2002;Saini et al.，2004;Nonoue et al.，2008; Matsubara et al.，2008;Maas et al.，2010)，但对水稻SSR标记的开发仍未饱和。鉴于水 稻在粮食安全和农业可持续发展方面重要性，开发新的特异性水稻SSR标记引物，对于构建 高密度遗传图谱和品种指纹图谱具有重要意义，对于水稻分子育种、新品种开发、种子资源 评价和栽培技术创新具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的不足，提供与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记与应 用。上述SSR分子标记为提供多态性，弥补目前水稻SSR标记较为缺乏的不足，为水稻种质鉴 定研究及其群体遗传学提供了有力的研究工具。本发明提供了 3对水稻第1染色体上SSR标 记，并将它们应用于水稻高杆基因遗传分析和精细定位中。
[0005] 本发明技术方案如下：
[0006] 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06，该分子标记为一对，上游标记核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007] 上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06在构建水稻第1染色体高密度遗 传图谱和品种指纹图谱中的应用。
[0008] 上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06在水稻第1染色体高杆基因遗传 分析和精细定位中的应用。
[0009] 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08，该分子标记为一对，上游标记核苷酸 序列如SEQ ID N0.3所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0010] 上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08在构建水稻第1染色体高密度遗 传图谱和品种指纹图谱中的应用。
[0011] 上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L08在水稻第1染色体高杆基因遗传 分析和精细定位中的应用。
[0012] 与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10，该分子标记为一对，上游标记核苷酸 序列如SEQ ID N0.5所示，下游标记核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0013] 上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在构建水稻第1染色体高密度遗 传图谱和品种指纹图谱中的应用。
[0014] 上述与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L10在水稻第1染色体高杆基因遗传 分析和精细定位中的应用。
[0015] 有益效果
[0016] 本发明首次筛选出了 3对与水稻尚杆QTL紧密连锁的SSR分子标记L06、SSR分子标 记L08、SSR分子标记L10。通过对水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24和轮回亲本HJX74基 因组DNA进行扩增，并利用6%变性聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测，发现上述3对与水稻高杆 QTL紧密连锁的SSR分子标记的扩增产物带型明显，且在品种间具有很好的多态性，利用上 述3对SSR标记能够将水稻高杆基因进行遗传分析和精细定位，可用于构建水稻第1染色体 高密度遗传图谱和品种指纹图谱。
【附图说明】
[0017] 图1为水稻单片段代换系上SSR标记亲本多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的 结果；
[0018] 其中：1为轮回亲本HJX74,2为水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24，a为RM315多 态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，b为RM104亲本多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测的结果，c为RM529多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，d为PSM331多态性筛选 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果，e为PSM423多态性筛选聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的结果； [00 19]图2为水稻SSR标记PSM331，RM1068在F2群体中的分离中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测的结果；
[0020] 其中：（a)和(b)分别为利用SSR标记对PSM331和RM1068在HJX74(P1)和单片段代换 系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PH-1 (t)基因扩增结果，l-2〇SF2群体个体；
[0021]图3为轮回亲本HJX74与水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24杂交发展的作图群 体定位的株高基因 PH-l(t)的遗传图；
[0022]图4为水稻SSR标记L06，L08和1^10在?2群体中的分离中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测的结果；
[0023] 其中：（a)、（b)和(c)分别为利用SSR引物对L06，L08和L10在HJX74(P1)和单片段代 换系W27-14-1-2-03-24(P2)分离群体中的PH-1 (t)基因扩增结果，l-2〇SF2群体个体；
[0024]图5为显性高杆基因在水稻第1染色体短臂上的分子连锁图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保 护的范围不限于此。
[0026]实施例中涉及的生物材料来源如下：
[0027] 水稻单片段代换系W27-14-1-2-03-24和轮回亲本HJX74购自华南农业大学农学 院；
[0028]实施例中涉及的酶、试剂及试剂盒均为普通市售产品。
[0029]实施例1与水稻高杆QTL紧密连锁的SSR分子标记的设计
[0030] 1.1引物设计方法：
[0031] 在需要发展微卫星标记的染色体区段进行分子标记的设计。从TIGR网站上（The Institute of Genome Research) (http://www. tigr.org/tdb/rice)下载该区域PAC/BAC 克隆的序列。TIGR将IRGSP(International Rice Genome Sequencing Project，IRGSP)已 测序的PAC/BAC克隆整合到了遗传图谱上，从目标区域下载的PAC/BAC克隆的序列首先需要 利用重复序列搜索软件SSRIT(http: //www · gramene · org/microsat/)进行微卫星序列的搜 索，然后从中选择合适的微卫星序列（一般要求重复数在8以上，同时避免基序为AT)，下载 包含有此微卫星序列的一小段基因组序列（350-500bp)，最后利用此序列进行PCR引物的设 计。利用软件Primer Premier 5.0进行引物的设计。设计的引物一般要求GC含量在45-65% 之间，Tm值在55-65°C之间，无错配、二聚体和发夹结构。
[0032] 在需要发展缺失多态性标记的染色体区域，从TIGR网站上（The Institute of Genome Research)( http://www.tigr.org/tdb/rice)下载该区域日本晴PAC/BAC克隆的序 列。首先选择需要的PAC/BAC克隆，把每个克隆分割成2kb连续的小片段。然后利用这些2kb 的序列与籼稻品种93-11进行序列比对，选择序列比对相似性高而只在某个区段有碱基缺 失(碱基缺失一般在5个碱基以上）的序列做为候选序列，最后利用这些候选序列在碱基缺 失的两端设计前后引物，扩增出的产物一般控制在l〇〇bp到300bp之间。其它按引物设计的 一般要求。
[0033] 分子标记的物理定位以IRSGP建立的日本晴的假染色体模型(Pseudomolecules) 为参照对象。采用直接物理定位法，根据IRGSP发表的日本晴的假染色体模型将各个两个亲 本间具有多态性的分子标记直接定位上去，以构建成分子图谱。具体方法如下：
[0034] 通过NCBI网站BLAST比对工具，对各个分子标记的前后引物序列在日本晴的基因 组序列上进行查找，以确定该分子标记所在的染色体或BAC克隆上，根据比对所得的结果即 可获知该分子标记在各条染色体上的具体位置。
[0035]根据分子标记分析的结果，将具有HJX74和W27-14-1-2-03-24的亲本带型的个体 分别赋值1和3,具有双亲带型（杂合带型）的个体赋值2。将微卫星分析的结果转换成数字形 式，然后输入计算机以便采用MAPMAKER/EXP.Version 3.0软件对定位群体抽穗期和微卫星 标记的分离数据进行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(Centimorgan， cM)，构建出目标基因的局部分子连锁图。
[0036] 根据克隆末端的重复序列，BLASTn软件(http: //www.ncbi .nlm.nih · gov/blast) 把各克隆拼接起来，确定新引物所在克隆的物理位置，整合到遗传图上，并计算两标记间的 物理位置。