一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及mRNA原位杂交技术，具体的说是一种适于牙鲜性腺冰冻切片mRNA原位 杂交的方法。
【背景技术】
[0002] 牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国 的重要海水养殖鱼类。牙鲆具有雄鱼比雌鱼生长快、个体大的特点，牙鲆已逐步在性别决定 与分化研究领域成为海水经济鱼类模式物种，研究其性别决定与分化的机制，确定性别决 定与分化相关的基因，并以此为基础，对其实施性别控制，具有重要的理论和实践意义。通 过牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交可以解析性别决定和分化相关基因的表达模式及相互 关系，但由于直接进行mRNA整体原位杂交非常困难，使得该技术难以应用。因此建立牙鲆性 腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法，对于牙鲆性别决定和分化相关规律的阐述具有重要的意 义;另外该发明在其它鱼类性腺等组织的原位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定 应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进行产业化生产。
【发明内容】
[0003] 本发明在于提供一种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法。
[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
[0005] -种适于牙鲆性腺冰冻切片mRNA原位杂交的方法：
[0006] 1)将牙鲆性腺依次经过量浓度为4%PFA溶液固定和100%甲醇溶液通透，而后长 期保存；固定后保存的样品经复水、20-30%蔗糖沉降后，进行0CT包埋和冰冻切片，55°C干 燥2-3h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；
[0007] 2)上述样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去样品切片0CT包埋剂;洗涤、蛋白酶K 消化、固定而后经预杂交，预杂交后与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70°C下杂交过 夜；杂交处理后洗涤，并经抗体孵育，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现 对牙鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。
[0008] 所述固定后样品经过量浓度100 %甲醇溶液洗涤后再用100 %甲醇溶液于-20°C长 期保存。
[0009] 将原位杂交样品经过量DEPC水洗涤3-5min以除去0CT包埋剂;洗涤后用过量无 RNA 酶的1 X PBST缓冲液洗涤反复洗涤，洗涤后加入蛋白酶K( 10μg/ml)于37 °C消化处理3-20min，消化处理后于过量浓度为4%PFA溶液再固定20-60min，固定后经过量无 RNA酶的1 X PBST缓冲液反复洗涤;洗涤后用PAP笔圈出样品区域，使样品与过量预杂交液于50-70 °C预 杂交2-5h。
[0010] 所述预杂交液为50(v)%去离子甲酰胺，25(v)%20XSSC(生工，中国），50μg/ml肝 素，500μg/ml酵母tRNA，0.1 (v) %Tween_20，1M的梓檬酸460μ1，加无 RNA酶水定容至50ml。
[0011] 所述含有牙鲆RNA探针的杂交液是将用预杂交液稀释RNA探针至终浓度为l-2ngAi 1，再将其置于80 °C变性30min，变性后，待用。
[0012] 所述探针为RNA探针，是以在性腺内表达基因的cDNA为模板构建探针载体，在体外 转录合成的带有地高辛标记的、并与该基因的核苷酸序列互补结合的一段单链cRNA分子。 其中，nr5a2、nr0bl、〇7口193、(11]11'1:1、;1；'(?12等性腺发育相关基因均可用来构建并合成1?嫩探 针。
[0013] 所述预杂交后样品与含有牙鲆RNA探针的杂交液混合于50-70°C下杂交过夜后于 50-70°C下依次预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)快速漂洗一次(5-20min)、漂洗后用过量的 体积比为1:1的预杂交液(不含肝素和酵母tRNA)和2 X SSC混合液洗涤5-20min、再用过量2 X SSC洗涤10-30min、再用过量含0.1CHAPS的0.2 X SSC两次洗涤，每次15-30min;最后在室 温下用MAB溶液洗涤5-10min。
[0014] 所述MAB溶液为lOOmM马来酸，150mM NaCl，pH7.5。
[0015] 所述杂交处理洗涤后，样品用过量封闭液于室温下水平摇床封闭2-4h，而后加入 碱性磷酸酶抗体在4°C孵育过夜，再洗涤，避光显色，终止显色，再固定，封片，进而实现对牙 鲆性腺相关基因在mRNA水平的表达定位。
[0016] 本发明具有如下优点：
[0017] 本发明在牙鲆中建立了冰冻切片mRNA原位杂交的方法来研究相关基因在性腺中 的表达模式，解决了性腺分化后期及成熟期性腺较大、直接整体原位杂交困难等问题，将有 助于进一步阐述牙鲆性别决定和分化的相关规律;另外该发明在其它鱼类性腺等组织的原 位杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而 进行产业化生产。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明实施例提供的牙鲆nr 5a2基因在性腺中的冰冻切片mRNA原位表达的 示意图。其中，nr5a2在卵巢发育第ΙΠ 期中的表达模式，短箭头所指位置是滤泡细胞，长箭头 所指位置是卵母细胞。
[0019] 图2为本发明实施例提供的牙鲆foxl2基因在卵巢中的冰冻切片mRNA原位表达的 示意图。其中，f〇xl2在卵巢发育第m期中的表达模式，短箭头所指位置是滤泡细胞，长箭头 所指位置是卵母细胞。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合实施例详述本发明的实验步骤。
[0021] 本发明解决了牙鲆性腺组织难于直接进行性腺原位杂交的问题，能够清晰地描述 牙鲆相关基因在性腺中的表达定位(mRNA水平）；另外该发明在其它鱼类性腺等组织的原位 杂交进行基因定位和功能研究方面将有一定应用前景，甚至可以开发相关检测试剂盒而进 行产业化生产。
[0022]实施例
[0023] 1.取样，洗样。剥离的牙鲆性腺样品，用过量无 RNA酶的1 XPBS缓冲液漂洗。
[0024] 2.固定。洗涤以后的性腺样品置于无 RNA酶离心管中，样品与浓度为4%PFA的按体 积比为1:10的比例混合，颠倒混匀以后，平放于4 °C，固定12h。所述PFA由4g PFA溶解于 100ml无 RNA酶的1 X PBS缓冲液得到。
[0025] 3.长期保存。将上述固定后样品用过量浓度100%甲醇溶液漂洗两次，洗涤后置于 过量的浓度100%甲醇溶液中，置于_20°C长期保存。
[0026] 4.冰冻切片。将上述长期保存样品经体积比3: 2和2: 3的，浓度为100%甲醇和无 RNA酶的1 X PBST缓冲液分别进行复水处理10-30min;再用100 洗涤4次，每次5min。洗 涤后复水后样品经30%蔗糖的1XPBS沉降后，沉降后进行0CT包埋，再冰切成14μπι的切片， 粘贴于原位杂交防脱载玻片上，于55°C干燥2h，获得冰冻切片作为原位杂交样品；
[0027] 所述无 RNA酶的1 XPBST缓冲液成分为：136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.24mM Na2HP04，1 · 76mM KH2P04，0 · 1 (v) % Tween-20，由无 RNA酶水配置，PH7 · 4。
[0028] 5.洗涤。将冰冻切片原位杂交样品经DEPC水洗涤5min以除去OCT包埋剂;洗涤后再 用过量无 RNA酶的PBST缓冲液洗涤三次，每次5min。
[0029] 6.蛋白酶K消化。将上述洗脱后冰冻切片样品用蛋白酶K(10μg/ml)于37°C处理 5min〇
[0030] 7.再固定。将上述消化后冰冻切片样品用过量4 % PFA溶液漂洗一次，再用过量4 % PFA溶液于室温水平摇床上再固定20min。
[0031] 8 .洗涤。固定后用过量的浓度100 %无 RNA酶1 X TOST漂洗一次，再用过量的浓度 100 %无 RNA酶1 X PBST洗涤三次，每次5min。
[0032] 9.预杂交。上述洗涤后冰冻切片样品按照每原位杂