检测机械力对dna与dna聚合酶相互作用影响的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及纳米技术领域，具体地涉及一种检测机械力对DNA与DNA聚合酶相互作 用影响的方法。
【背景技术】
[0002] DNA与DNA聚合酶间的相互作用与细胞、组织的发生，发展和演化等生命过程密切 相关，也为现代生物技术所广泛采用，其中包括DNA测序、法医检验、纳米生物传感检测以及 DNA扩增技术等。DNA与DNA聚合酶作用受到多重因素的调控和影响。如在体内，与单链结合 蛋白、解旋酶、拓扑异构酶等分子功能状态密切相关;在体外，也受到多种环境因素如温度、 离子浓度和pH值等的影响。
[0003] DNA与DNA聚合酶相互作用的最终产物是双链DNA(dsDNA)，也就是DNA聚合酶以亲 代DNA链为模板催化合成子代DNA链的过程。在合成DNA时，马达分子蛋白DNA聚合酶与DNA模 板间存在着多种多样的相互作用，如寻找DNA模板链，特异性结合到引物链3'端的位置上。 然后，沿着DNA模板以5 '端向3 '端的方向移动，合成子代DNA链。合成结束后，脱离DNA链。这 种多步骤的合成过程，任何一个环节上的改变，都可能导致它们间相互作用的影响。已有研 究证明，DNA合成过程也能够受到外部作用力的影响和控制，CARLOS BUSTAMANTE等人利用 光镊手段，研究了不同张力DNA模版链对DNA聚合酶合成速度的影响，发现当对DNA链施加的 力较小时，DNA合成速率加快；作用力达到约6pN时，合成速率到达峰值；而作用力大于约 34pN后，DNA合成速率呈现下降趋势；当作用力增强到一定程度后，会出现合成暂时停滞现 象。目前，光镊方法主要侧重研究基本平行于DNA链纵向拉伸弹性(沿双螺旋方向）的作用力 对DNA合成的影响，而DNA及其DNA聚合酶也有可能受到其他方向作用力的作用，如周围液体 的扰动，蛋白质等生物大分子结合、解离过程的影响，甚至细胞骨架重排和细胞迀移所造成 的周边微环境等的影响。但目前尚缺乏检测非DNA双螺旋方向的机械力对DNA和DNA聚合酶 相互作用影响的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于克服了现有技术中缺少一种检测非DNA双螺旋方 向的机械力对DNA与DNA聚合酶相互作用影响的方法的技术问题，提供了一种检测方法，通 过该检测方法可以获取非双螺旋方向机械力对DNA和DNA聚合酶结构和功能作用的信息，进 而得到机械力对DNA合成的影响。
[0005] 本发明通过以下技术方案来解决上述技术问题：
[0006] 本发明技术方案之一:一种检测机械力对单链DNA模板与DNA聚合酶相互作用影响 的方法，所述方法包括以下步骤:利用原子力显微镜对含有dNTP、单链DNA模板-空心DNA折 纸及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系进行原子力显微镜扫描成 像观察双链DNA的合成;所述缓冲体系在新解离的云母衬底上，所述单链DNA模板-空心DNA 折纸的单链DNA模板两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位置，所述两个不同 位置不位于同一直线边缘上。
[0007] 本发明中，所述空心DNA折纸可以为本领域常规的DNA折纸，所述空心DNA折纸的图 案可根据需要设计，只要图案的中间存在空隙能够容纳待检测DNA链长度即可，较佳地为中 间空心的矩形或中间空心的三角形，更佳地为中间空心的等边三角形，最佳地为边长大于 30nm的中间空心的等边三角形，如边长为35nm的中间空心的等边三角形。所述DNA折纸的制 备方法可以为本领域常规的方法，较佳地由单链脚手架链Ml 3mp 18DNA和订书钉单链自组装 形成，所述订书钉链的序列较佳地为A17与C33两条链分别替换为序列表SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL，所述订书钉链DNA集合ABCL为2010年3月17日发 表在 J Am Chem Soc.第132 卷第10 期第3248-3249 页的题为Gold nanoparticle self-similar chain structure organized by DNA origami的论文的Supportin Online Information中的SI 1-S16页所记载的从A01至Loop的DNA序列的集合，总共208条序列，可自 组装成等边三角形DNA折纸。所述订书钉单链用于固定脚手架链形成目标图形，更佳地包括 以下步骤:将单链脚手架链DNA M13mpl8与A17与C33两条链分别替换为序列表SEQ ID N0.1 与SEQ ID NO. 2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL混合于TAE-Mg2+缓冲体系，从95 °C退火至 20°C，退火速率为0.1°C/10s，其中所述单链脚手架链M13mpl8与所述A17与C33两条链分别 替换为序列表SEQ ID NO. 1与SEQ ID N0.2所示序列的订书钉链DNA集合ABCL的摩尔浓度比 可以为本领域常规的比例，较佳地为1:10。组装好的DNA折纸用40mM Tris-乙酸、ImM EDTA、 12.5mM MgCl2，pH8.0缓冲液超滤。
[0008] 本发明中，所述单链DNA模板（ssDNA)可以为本领域常规的单链DNA模板，其作为 DNA复制的模板被所述DNA聚合酶Klenow片段结合。所述单链DNA模板可以通过本领域常规 的方式固定于所述DNA折纸上，较佳地通过两末端固定的方式被固定于所述DNA折纸上，更 佳地，通过如下方式被固定于所述折纸上:在所述空心DNA折纸的内侧边缘的订书钉链序列 中选择两个不同位置各多出一段核苷酸序列分别与所述单链DNA模板的5 '端与3 '端序列配 对，使所述单链DNA模板通过5 '端与3 '端杂交固定到所述DNA折纸上并位于所述DNA折纸中 央。所述两个不同的位置不在所述空心DNA折纸内侧同一直线的边缘上，但可以分别位于不 同直线的边缘上，例如分别位于三角形三条边中的两条边上，或位于矩形四条边中的两条 边上。可以根据所述单链DNA模板的长度通过调整在所述DNA折纸不同的两边上与所述单链 DNA模板互补的两个位点的位置来调整固定于所述DNA折纸上的单链DNA模板的张力，最佳 地，所述单链DNA模板SEQ ID N0.3通过其5'端与其3'端分别与订书钉链SEQ ID NO. 1所示 的序列的5 '端的20个碱基与订书钉链SEQ ID NO. 2所示的序列的3 '端的20个碱基杂交固定 到前述DNA折纸上并位于其中央。所述杂交可以为本领域常规的方法，较佳地为将所述单链 DNA模板与所述DNA折纸混合后升温至50°C后以0.5°C/min的速率退火至15°C，再用TAE-Mg2+ 缓冲液超滤。所述DNA聚合酶为Klenow片段(KF)。所述dNTP的终浓度可以为本领域常规的使 DNA合成能够正常进行的浓度，较佳地为15.6μΜ。所述缓冲体系可以为本领域DNA聚合酶 Klenow片段工作的常规缓冲体系，所述缓冲体系中的缓冲成分较佳地为TAE-Mg2+缓冲液，所 述TAE-Mg 2+缓冲液为40mM Tris-乙酸、ImM EDTA、12.5mM MgCl2，pH8.0。
[0009] 本发明中，所述缓冲体系可以根据本领域常规的方法制备，较佳地按以下步骤制 备：1)将所述单链DNA模板两端分别固定于所述空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点，制 得单链DNA模板-空心DNA折纸；2)将步骤1)所述单链DNA模板-空心DNA折纸与所述DNA聚合 酶Klenow片段混合20-37°C温育3-30min，较佳地25°C温育lOmin，加入dNTPs后即得。按上述 方法制得的所述含有dNTP、两端分别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点的单链 DNA模板及结合所述单链DNA模板的DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系须立刻置于原子力显 微镜显微镜下扫描成像。步骤1)中，将所述单链DNA模板两端分别固定于所述空心DNA折纸 内侧边缘上两个不同位点较佳地可以按以下方式进行：将所述单链DNA模板通过5 '端与3 ' 端杂交固定到所述空心DNA折纸上并位于所述DNA折纸中央的空心中，更佳地可以通过以下 方式进行:将所述单链DNA模板与所述空心DNA折纸混合后升温至50°C，以0.5°C/min的退火 速率退火至15°C，以前述TAE-Mg 2+缓冲液超滤。步骤2)中所述dNTP的终浓度可以为本领域常 规的使DNA合成能够正常进行的浓度，较佳地为15.6μΜ。
[0010] 本发明中，所述原子力显微镜可以为本领域常规的原子力显微镜，所述原子力显 微镜探针可以为本领域常规的原子力显微镜探针，较佳地为Bruke公司氮化硅探针（SNL-10,弹性系数〇.35N/m)。所述原子力显微镜的扫描模式可以为本领域常规的模式，例如采用 "J"扫描头，"轻敲"模式，调节扫描参数在小力区(F<200pN)成像，分别收集不同阶段样品 的AFM图像。所述原子力显微镜成像的衬底为新解离的云母。使用时，所述含有dNTP、两端分 别固定于空心DNA折纸内侧边缘上两个不同位点的单链DNA模板及结合所述单链DNA模板的 DNA聚合酶Klenow片段的缓冲体系置于所述新解离的云母表面上，所述新解离的云母粘于 铁片上，之后即可置于原子力显微镜载样台上进行原子力显微镜成像。所述扫描的时间可 以为本领域常规的时长，较佳地为9_72min，如7min、9min、13min、39minS72min。
[0011] 本发明中，所述通过所述原子力显微镜成像观察双链DNA的合成可以通过本领域 常规的方法进行，较佳地为通过分析AFM形貌图像和高度图进行，例如以所述DNA折纸的高 度作为合成的双链DNA高度的参考值，测量到位于所述DNA折纸中央的DNA的高度为所述DNA 折纸高度1 /