一种心脑血管疾病文库构建的试剂盒、方法及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及心脑血管疾病基因突变检测技术，具体涉及一种心脑血管疾病文库构 建的试剂盒、方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 心脑血管疾病通常是指心脏血管和脑血管方面的疾病，一般是由于高脂血症、血 液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等症状导致的心脏、大脑及全身组织发生缺血性或出血性疾 病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的疾病，特别在中老年人群中发病率非常高。基 因突变是该类疾病发病的主要因素之一，而且具有高遗传概率。携带突变基因的家族会通 过遗传使得该基因得到广泛传递，从而造成整个家族患病概率大幅增高。目前，由基因突变 造成的遗传性心脑血管疾病患者已经超过1〇〇〇万人。心脑血管疾病具有隐匿性强，出现明 显症状周期长的特点，一旦疾病发作，临床通常表现出异常凶险的特点，如猝死、恶性心律 失常、心力衰竭、主动脉破裂等。以往由于检测技术不够发达，缺乏早期诊断手段，发病时通 常已到疾病后期，很难挽救，所以被认为是不治之症。如果可以在发病早期对心脑血管疾病 进行确诊，临床医生则可以利用丰富的经验预防和治疗该类疾病。
[0003] 研究发现，心脑血管疾病的发生与ACTA2，CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP等热点基因的 突变有很大的关系。ACTA2基因位于10号染色体长臂上，由它编码的肌动蛋白α是成熟血管 平滑肌细胞中含量最多的蛋白，占血管平滑肌细胞内总蛋白的40%以及总肌动蛋白的 70%，由肌动蛋白α构成的细肌丝与粗肌丝周期性地相互作用而参与血管的舒缩过程，肌动 蛋白α主要参与收缩过程。由此可见，它是收缩型血管平滑肌细胞的标志性蛋白，而血管平 滑肌细胞由收缩表型向合成表型的转化过程在冠状动脉病变中起非常重要的角色。 CACNA2D1基因，位于染色体7q21_22,负责编码心脏L型钙通道的α2δ-1亚单位。研究显示 CACNA2D1基因是SQT6的致病基因，CACNA2D1基因突变会导致L型钙通道的功能丧失，通过相 应的机制引起ΑΡ复极化时间、ERP及QT间期缩短。在心肌中，组织的结构和功能完整性需要 依靠桥粒的支持作用，而主要的桥粒蛋白有:桥粒斑蛋白（desmoplakin，DSP)，桥粒芯糖蛋 白（desmoglein，DSG)和桥粒芯胶蛋白（(^8!11〇(3〇11111，03〇。0362和03〇2基因编码的是跨膜 蛋白，在细胞间与相邻的心肌细胞桥粒钙粘素的通讯部分形成一种拉链样二聚体。DSP基因 编码的是最大的桥粒蛋白，其N末端与其它桥粒蛋白相连，C末端则与中间丝相连，它在维持 心肌细胞之间的结构和功能完整性方面发挥重要的作用。
[0004] 因此，高效、准确的检测判断心脑血管疾病热点基因突变就显得极为重要，同时也 成为判断患者能否适应靶向药物治疗的关键。然而，目前还没有关于采用高通量测序技术 检测心脑血管疾病热点基因突变的报道。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种心脑血管疾病文库构建的试剂 盒、方法及其应用，所述试剂盒能够快速有效的构建心脑血管疾病的文库，为心脑血管疾病 的快速检测奠定了基础
[0006] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0007] 第一方面，本发明提供了一种心脑血管疾病文库构建的试剂盒，所述试剂盒包括 针对ACTA2，CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP基因突变的检测探针。
[0008] 本发明中，所述ACTA2，CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP基因包括野生型、杂合型和突变 型。
[0009] 本发明中，首次公开通过高通量测序技术检测心脑血管疾病热点基因突变的试剂 盒，可以实现样本DNA文库构建，通过独特设计的特异性杂交文库的探针引物序列和精准性 的捕获杂交文库的磁珠悬浮液进行整合，避免了 DNA样本的损失和污染，且降低了建库需要 的基因组DNA样本量。
[0010]优选地，所述检测探针的核苷酸序列包含如SEQ ID N0.1-24所示的片段。
[0011] 优选地，所述SEQ ID N0:1-5所示的序列是用于检测ACTA2基因突变的检测探针。 [0012] 优选地，所述SEQ ID N0:6-9所示的序列是用于检测CACBA2D1基因突变的检测探 针。
[0013] 优选地，所述SEQ ID N0:10-14所示的序列是用于检测DSC2基因突变的检测探针。 [0014] 优选地，所述SEQ ID N0:15-18所示的序列是用于检测DSG2基因突变的检测探针。 [0015] 优选地，所述SEQ ID N0:19-24所示的序列是用于检测DSP基因突变的检测探针。
[0016] 所述检测探针的核苷酸序列如下：
[0017]
[0018]
[0019] 优选地，所述检测探针标记有链霉亲合素。
[0020] 本发明中，所述带有链霉亲合素的检测探针用于杂交文库，是一段与野生型DNA序 列完全匹配的特异性引物。
[0021] 优选地，所述试剂盒还包括针对ACTA2，CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP基因突变检测的 封闭引物。
[0022] 所述封闭引物是针对每个基因的，无论是否突变都能起封闭作用。
[0023]优选地，所述检测封闭引物的核苷酸序列包含如SEQ ID N0.25-44所示的片段。
[0024] 本发明中，所述检测封闭引物用于封闭捕获的杂交文库两端。
[0025] 所述封闭引物的核苷酸序列如下：
[0026]
[0027]
[0028] 优选地，所述封闭探针以排列组合的方式随机配对成96种组合形式的杂交文库。
[0029] 本发明中，封闭探针上带有不同的index标签，96种组合方式即意味着有96种不同 的index标签，上机通量能达到96人份。Index标签的组合方式越多，上机通量就可以越多， 测序成本也就越低，目前市售的用于心脑血管疾病方面文库构建的探针标签只有24种
[0030] 本发明中，独特设计的双端封闭寡居核苷酸探针能以随机的方式配对成96中封闭 形式的杂交文库，增加了组合方式，扩大了样本的检测通量，检测的结果具有更好的特异性 和准确性。
[0031] 优选地，所述试剂盒还包括：捕获磁珠悬浮液、PCR扩增引物和基因组DNA建库试 剂。
[0032] 优选地，所述捕获磁珠悬浮液标记有生物素。
[0033] 本发明中，所述标记有生物素的磁珠悬浮液可特异性的捕获杂交文库的探针序 列。
[0034]优选地，所述PCR扩增引物为常规引物，包括正向引物和反向引物，所述常规引物 的核苷酸序列包含如SEQ ID N0.1-2所示：
[0035] 正向引物序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(SEQ ID N0.1);
[0036] 反向引物序列：GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID N0.2)。
[0037] 优选地，所述PCR扩增引物的浓度为0.01 -0.1 mM，例如可以是0.01 mM、0.02mM、 0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM或 O.lmM，优选为 0.02-0.5mM。
[0038] 优选地，所述基因组DNA建库试剂包括：0 · 02-0 · 2M Tris-HCl缓冲液、100-500yg/ mL Taq DNA聚合酶、0.01-0.謂碱基4和0.1-0.51接头。
[0039] 所述 Tris-HCl缓冲液的浓度例如可以是 0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·08Μ、0·1Μ、 0.12M、0.15M、0.18M、0.19MS0.2M;
[0040] 所述1&9〇嫩聚合酶的浓度例如可以是10(^8/1111^、1〇]^/1]11^、102以8/1111^、105以8/1]11^、 108yg/mL、110yg/mL、120yg/mL、150yg/mL、180yg/mL、200yg/mL、250yg/mL、300yg/mL、350y g/mL、400yg/mL、450yg/mL、480yg/mL或 500yg/mL;
[0041 ]所述碱基 A 的浓度例如可以是 0·01Μ、0·02Μ、0·03Μ、0·04Μ、0·05Μ、0·06Μ、0·07Μ、 0.08M^0.09MgSc0.1M；
[0042] 所述接头的浓度例如可以是 0.1M、0.11M、0.12M、0.13M、0.14M、0.15M、0.18M、 0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45MS0.5M。
[0043] 优选地，所述PCR扩增引物与所述接头特异性结合。
[0044] 第二方面，本发明提供一种利用如第一方面所述的试剂盒用于构建心脑血管疾病 高通量测序文库的方法，包括以下步骤：
[0045] 1)取待测样品DNA片段化后加入建库试剂孵育反应，构建测序文库；
[0046] 2)取构建好的文库加入所述扩增引物进行PCR扩增反应；
[0047] 3)取PCR扩增产物与所述检测探针、检测封闭引物混合，杂交孵育；
[0048] 4)将杂交后的文库与所述捕获磁珠悬浮液混合孵育，捕获杂交的文库并洗涤；
[0049] 5)将捕获的杂交文库中再加入所述扩增引物，进行PCR扩增并纯化产物。
[0050] 优选地，步骤（1)所述的待测样品为外周血、指尖血或唾液中的任意一种或至少两 种的混合物。
[0051] 第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的试剂盒、或第二方面所述的方法用 于检测心脑血管疾病的应用。
[0052] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
[0053] (1)本发明试剂盒采用高通量基因测序技术检测心脑血管疾病热点基因是否发生 突变，不仅具有很好的准确性和特异性，