而且还增大了检测的通量，提高了检测效率；
[0054] (2)本发明试剂盒将基因组DNA建库试剂、独特设计的特异性杂交文库的探针引物 序列和精准性的捕获杂交文库的磁珠悬浮液进行整合，制备的心脑血管疾病热点基因突变 检测试剂组合，相比于目前国内外市场上的其他基因突变检测试剂或试剂盒，能直接对基 因组DNA进行文库构建，杂交文库以及捕获文库，无需使用单独的市售DNA建库试剂盒以及 文库杂交芯片，避免了 DNA样本的损失和污染，且建库需要的基因组DNA样本量少，降低了检 验成本；
[0055] (3)本发明试剂盒优化了文库构建流程和方法，一步法即可完成DNA末端修复与加 接头，对基因组DNA进行文库构建，缩短了文库构建的时间和操作步骤，操作简便，独特设计 的双端封闭寡居核苷酸探针能以随机的方式配对成96种封闭形式杂交文库，增加了组合方 式，增大了样本检测通量，检测结果具有更好的特异性和准确性；
[0056] (4)本发明试剂盒对心脑血管疾病相关突变的检测具有特异性强、灵敏度高、受污 染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合 从血浆等体液中检测心脑血管驱动基因的热点突变，可以实时、无创的对心脑血管疾病患 者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的临床价值。
【附图说明】
[0057]图1本发明基因组文库杂交捕获后Agilent 2100检测图；
[0058]图2本发明荧光定量PCR扩增曲线图；
[0059]图3本发明荧光定量PCR恪解曲线图。
【具体实施方式】
[0060] 为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施 例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
[0061] 实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件， 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购 获得的常规广品。
[0062] 实施例1心脑血管疾病文库构建试剂盒的制备
[0063] 基因组DNA建库试剂：0.1M Tris-HCl缓冲液、200yg/mL Taq DNA聚合酶、0.05M碱 基A、0.35M接头，按3mL/支分装储存。
[0064]标记有链霉亲合素的杂交文库的检测探针:所述核苷酸序列为SEQ ID N0.1-24， 用于杂交文库，是一段与野生型DNA序列完全匹配的特异性引物，按0.5mL/支分装。
[0065] 检测封闭引物:所述核苷酸序列为SEQ ID N0.25-44，Block Oligos 501-508和HE 01 igos 701 -712，用于封闭捕获的杂交文库，分别按0.5mL/支分装。
[0066] 标记有生物素的捕获探针的磁珠悬浮液，特异性的捕获杂交文库的探针序列，按 10mL/支分装储存。
[0067] PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，是一段与接头特异性结合的序列，使用终 浓度为〇. 2mM，按2mL/支分装储存。
[0068]将上述试剂管分隔并合并包装于包装盒中。
[0069] 实施例2基因组DNA建库及杂交捕获
[0070]所述方法包括如下步骤：
[0071] 1)取20ng基因组DNA，通过超声波进行DNA片段化，片段大小控制在150-250bp范围 内；
[0072] 2)取片段化后的DNA加入120yL建库试剂体系，30°C条件下孵育20分钟，进行基因 组DNA文库构建；
[0073] 3)孵育结束后，取构建完成的文库，加入40yL PCR扩增引物，进行PCR反应；
[0074] 4)取扩增产物，加入20yL检测探针引物和20μΙ^?闭引物序列，30°C条件下孵育20 小时；
[0075] 5)将杂交完成的文库转移至150yL的捕获磁珠悬浮液中，进行磁珠捕获，分离出捕 获的磁珠悬浮液，加入0.2M NaOH进行洗脱得到杂交后的文库，并用超纯水进行洗脱去除 Na0H〇
[0076] 6)向杂交后的文库中加入40yL PCR扩增引物，进行PCR扩增反应，并用普通磁珠悬 浮液进行纯化，得到最终的纯化产物。
[0077] 通过Qubit荧光计以及高灵敏Agilent 2100芯片生物分析仪分别对捕获到的杂交 文库进行定量和片段大小分析。Qubit定量结果显示文库浓度为9.47ngAiL，捕获的杂交文 库总量为473.5ng。
[0078] 取1此文库稀释10倍后，通过高灵敏Agilent 2100芯片生物分析仪对其片段大小 进行检测，结果见图1，从图1可以看出，捕获的杂交文库的片段大小检测峰值为325bp，是由 片段化后200bp左右的DNA与接头连接后形成的；当连接了接头后，DNA片段大小发生了变 化，并且进行了PCR扩增，浓度增高，Agilent 2100检测中出现峰值，与相关报道一致。
[0079]实施例3文库质检
[0080]通过实时荧光定量PCR进一步检测文库是否存在接头自连污染，从文库中取出lyL 溶液，使用ΚΑΡΑ BIOSYSTEMS公司的高通量测序文库定量试剂盒，按照说明书操作步骤对文 库进行检测。检测结果见图2和附图3。
[0081] 从图2可以看出文库扩增曲线重复性非常好，3次重复检测的Ct值分别为14.69、 14.71和14.70，表明文库构建成功，qPCR操作未造成污染。从图3是文库的熔解曲线图，从图 3可以看出文库熔解曲线中只有单一的峰，没有杂峰，表明采用本发明涉及的组合试剂和方 法构建的文库没有出现接头自连的现象，文库纯度非常高，适合用于高通量测序平台测序。
[0082] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局 限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种心脑血管疾病文库构建的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对ACTA2， CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP基因突变的检测探针。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针的核苷酸序列包含如SEQ ID NO. 1-24所示的片段； 优选地，所述SEQ ID NO: 1-5所示的序列是用于检测ACTA2基因突变的检测探针； 优选地，所述SEQ ID N0:6-9所示的序列是用于检测CACBA2D1基因突变的检测探针； 优选地，所述SEQ ID NO: 10-14所示的序列是用于检测DSC2基因突变的检测探针； 优选地，所述SEQ ID NO: 15-18所示的序列是用于检测DSG2基因突变的检测探针； 优选地，所述SEQ ID NO: 19-24所示的序列是用于检测DSP基因突变的检测探针。3. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针标记有链霉亲合素。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对 ACTA2，CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP基因突变检测的封闭引物； 优选地，所述检测封闭引物的核苷酸序列包含如SEQ ID NO.25-44所示的片段。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭探针以排列组合的方式随机配 对成96种组合形式的杂交文库。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括:捕获磁 珠悬浮液、PCR扩增引物和基因组DNA建库试剂;优选地，所述捕获磁珠悬浮液标记有生物 素； 优选地，所述PCR扩增引物是常规引物，所述PCR扩增引物包括正向引物和反向引物； 优选地，所述常规引物的核苷酸序列包含如SEQ ID NO. 1-2所示的片段。 优选地，所述PCR扩增引物的浓度为0.01-0.1 mM，优选为0.02-0.5mM。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述基因组DNA建库试剂包括：0.02- 0.2M Tris-HCl缓冲液、100-500yg/mL Taq DNA聚合酶、0.01-0.謂碱基厶和0.1-0.51接头； 优选地，所述PCR扩增引物与所述接头特异性结合。8. -种利用如权利要求1-7中任一项所述的试剂盒用于构建心脑血管疾病高通量测序 文库的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取待测样品DNA片段化后加入建库试剂孵育反应，构建测序文库； 2) 取构建好的文库加入所述扩增引物进行PCR扩增反应； 3) 取PCR扩增产物与所述检测探针、检测封闭引物混合，杂交孵育； 4) 将杂交后的文库与所述捕获磁珠悬浮液混合孵育，捕获杂交的文库并洗涤； 5) 将捕获的杂交文库中再加入所述扩增引物，进行PCR扩增并纯化产物。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述的待测样品为外周血、指尖血 或唾液中的任意一种或至少两种的混合物。10. -种如权利要求1-7中任一项所述的试剂盒、或权利要求8或9所述的方法用于检测 心脑血管疾病的应用。
【专利摘要】本发明涉及心脑血管疾病基因突变检测技术，具体涉及一种心脑血管疾病文库构建的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒包括针对ACTA2，CACNA2D1，DSC2，DSG2，DSP基因突变的检测探针。本发明对心脑血管疾病相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性能高等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测心脑血管驱动基因的热点突变，可以实时、无创的对心脑血管疾病患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要价值。
【IPC分类】C12N15/10, C40B50/06, C12Q1/68
【公开号】CN105648067
【申请号】
【发明人】陈勇, 刘冬梅, 王玲
【申请人】北京乐普基因科技股份有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月19日