专利名称:一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种烟草生物碱含量的检测方法，尤其涉及一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法 。
背景技术：
生物碱是广泛存在于植物体内的一类由小分子含氮化合物组成的次生代谢产物，目前世界上已有超过12000种的生物碱类物质被分离鉴定。生物碱在烟草及其制品中有特殊的地位，它不仅是烟草重要的品质要素，而且规定了烟草作为一种商品的特质。研究发现，烟草中含有多种生物碱，在栽培烟草中主要有四种，分别是烟碱、降烟碱、假木贼碱和新烟碱，其中尤以烟碱含量最高，一般占到总生物碱的90 95%。
研究表明，不同类型烟草，其生物碱组分与含量差异显著，同样，不同品种之间生物碱的组分与含量也不尽相同。此外，栽培条件(如种植地点、天气、光照和水分等)的不同也对生物碱有较大影响。由于消费者的偏好，我国种植的烟草类型多为烤烟，占到总栽培面积的95%以上。另一方面，在栽培品种的烟株群体中，由于基因突变，会出现烟碱转化现象，即烟碱在去甲基化酶的作用下大量转化为降烟碱。而降烟碱含量的升高会直接影响烟叶的香吃味品质，导致烤烟调制后出现“樱红”现象且香味不佳。
近年来，我国烟叶生产中一直存在烟碱等生物碱含量过高的问题，烟碱含量过高会导致烟叶品质变差，可用性明显下降，而目前检测烟叶生物碱的方法主要是气相色谱法(GC)，虽然该方法稳定性、可操作性都比较好，但该方法仅能分析采收后的成熟烟叶或烘烤后的烟叶，无法在早期了解不同品种烟叶及同一品种的不同群体内生物碱含量的差异，进而无法在早期将不良烟株及时淘汰。
公开号为“CN102401816A”的中国发明专利申请公开了一种烟草中生物碱的检测方法，包括如下步骤步骤一，取烟草样品，加入碱溶液，超声处理，之后加入含有喹啉的有机溶剂，震荡萃取，将有机层浓缩，得进样溶液；步骤二，利用气相色谱-质谱联用仪器检测进样溶液，对烟草生物碱进行定性和定量测定。
公开号为“CN102004132A”的中国发明专利申请公开了一种烟草制品中生物碱的测定方法，它利用氢氧化钠溶液将烟草或烟草制品中的生物碱游离出来，采用三乙胺/三氯甲烷溶液萃取试样中的生物碱，通过气相色谱-质谱(GC-MS)定量分析检测其中5种生物碱的含量。
上述专利公开的检测方法均是通过萃取获得烟叶样品中的生物碱，然后利用气相色谱进行检测，但所使用的样品均是成熟烟叶或烟叶制品，无法在烟叶早期对生物碱含量进行预测判断。
发明内容
本发明公开了一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，解决了传统方法只能对成熟期叶生物碱含量片进行定量检测，缺乏早期预判能力，不能及时剔除不良烟株的问题。
一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，包括
(I)收集至少两个烟草品种的处于旺长期植株的叶片，分别提取各叶片的总RNA，并逆转录合成cDNA ；
(2)针对烟草中任一与生物碱合成相关的基因设计特异性引物，利用该特异性引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，计算得到各烟草品种所述与生物碱合成相关的基因的相对表达量；(3)预判各烟草品种成熟期叶片的生物碱相对含量；
所述烟草中与生物碱合成相关的基因为鸟氨酸脱羧酶基因(GenBank:AF321138. I)、腐胺N-甲基转移酶基因(GenBank :D28506. I)、甲基腐胺氧化酶基因(GenBank AB289456. I)或喹啉酸磷酸核糖转移酶基因(GenBank AB038494. I)。
经多次试验发现，鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)、腐胺N-甲基转移酶基因(PMT)、甲基腐胺氧化酶基因(MPO)和喹啉酸磷酸核糖转移酶基因(QPT)早期的表达水平与烟草成熟期叶片生物含量存在正相关关系。根据如下公式可以计算出多种烟草品种某基因的相对表达量t
t = 2-“ct
其中，Λ ACt= ACtl_ACt2，ACt =目标基因的Ct值-内参基因的Ct值，其中Λ Ctl，Λ Ct2表示两种进行比较的烟草品种叶片中基因表达水平Ct差值，ACt2作为对照值。
步骤⑴中叶片取自植株的中部，中部叶片能较好地反映烟株的各项指标。
所述旺长期为烟株经过漂浮育苗后，移栽至大田中55-65天时。
取到的鲜叶样品，应立即放入装有液氮的冰盒中短暂保存并提取总RNA，若不立即提取总RNA应将样品保存在_80°C超低温冰箱中待用。提取总RNA后应立即反转录为cDNA，保存在_20°C条件下，若不立即反转录为cDNA应将总RNA样品保存在_80°C超低温冰箱中待用。
鲜叶样品在-80 V条件下保存期为I年，总RNA样品在-80 V条件下和cDNA样品在-20°C条件下保存期为6个月。
步骤(I)中，总RNA提取采用植物RNA试剂盒(如Qiagen公司的RNeasy PlantMini kit等)法或Trizol法进行；mRNA反转录为cDNA采用AMV反转录酶或MMLV反转录酶；在步骤(2)中，实时荧光定量PCR方法为SYBR Green I荧光嵌合法。
qRT-PCR反应体系采用SYBR Green I荧光嵌合法进行qRT-PCR，PCR反应液总体积为 20μ 1，包含 Takara 2 X SYBR Premix EX Taq 10 μ 1，正向引物(10 μ Μ) O. 5 μ 1，反向引物(10 μ Μ) O. 5 μ I, cDNA模板2 μ I,灭菌蒸懼水7 μ I。
反应条件为95°C预变性5min ;95°C变性10s，55°C退火10s，72°C延伸10s，共60个循环；72°C延伸5min ;55_95°C缓慢升温，产生溶解曲线。
内参基因一般选用生物体或细胞内稳定表达的基因，本发明选用内参基因为26S-RNA(GenBank X68710. I)。针对内参基因的特异性引物如下
正向引物GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC[0026]反向引物TCTCCCTTTAACACCAACGG。
实时定量PCR的目的是为了检测某基因的相对表达量，因为在扩增时不需全序列扩增，但选用引物应具有较好的特异性，本发明针对鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)、腐胺N-甲基转移酶基因(PMT)、甲基腐胺氧化酶基因(MPO)和喹啉酸磷酸核糖转移酶基因(QPT)的特异性引物以及扩增的序列长度如下表I所示
表I特异性引物及扩增序列长度表
权利要求
1.一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，包括 (1)收集至少两个烟草品种的处于旺长期植株的叶片，分别提取各叶片的总RNA，并逆转录合成cDNA ； (2)针对烟草中任一与生物碱合成相关的基因设计特异性引物，利用该特异性引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，计算得到各烟草品种所述与生物碱合成相关的基因的相对表达量； (3)预判各烟草品种成熟期叶片的生物碱相对含量； 所述烟草中与生物碱合成相关的基因为鸟氨酸脱羧酶基因、腐胺N-甲基转移酶基因、甲基腐胺氧化酶基因或喹啉酸磷酸核糖转移酶基因。
2.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR选用的内参基因为26S-RNA。
3.如权利要求
2所述的方法，其特征在于，针对内参基因的特异性引物为 正向引物5 ’ -GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3， 反向引物5 ’ -TCTCCCTTTAACACCAACGG-3，。
4.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，针对鸟氨酸脱羧酶基因、腐胺N-甲基转移酶基因、甲基腐胺氧化酶基因和喹啉酸磷酸核糖转移酶基因的特异性引物如下表所示1 名称 I正向/反向(5’-3’) —鸟氨酸脱羧酶正向引物iCTGTGTTTGGGCCCACTTG: 基因反向引物CCATATTAGGAAAAACCAGC 腐胺N-甲基转正向引物^ ATTGGACCAAGATCGAGTC^移酶基因反向引物ATTACTGCAGAATTCTCCTAC甲基腐胺氧化正向引物CAGTGATGTTACTGAAACTA酶基因反向引物ATAGGCGAGGAGGACTCATG喹啉酸磷酸核正向引物GACGCATTCCGTGAAAGCAC糖转移酶基因反向引物_ AAGTAATGGCGCTCATGCTC
5.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，步骤(I)中叶片取自植株的中部。
6.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，步骤⑴中，叶片重量为O.I lg。
专利摘要
本发明公开了一种早期预判不同品种烟草成熟期叶片生物碱相对含量的方法，包括(1)收集至少两个烟草品种的处于旺长期植株的叶片，分别提取各叶片的总RNA，并逆转录合成cDNA；(2)针对烟草中任一与生物碱合成相关的基因设计特异性引物，利用该特异性引物，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，计算得到各烟草品种所述与生物碱合成相关的基因的相对表达量；(3)预判各烟草品种成熟期叶片的生物碱相对含量；本发明方法克服了现有检测方法只能在烟叶采收后才能对其定量分析的缺陷，避免了现有方法检测的条件限制，为及早判定烟叶生物碱含量开辟新的途径。
文档编号C12Q1/68GKCN102816852SQ201210314949
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月30日
发明者储国海, 周国俊, 孙勃, 黄芳芳, 林福呈, 杨军, 张芬, 金立锋 申请人:浙江中烟工业有限责任公司, 中国烟草总公司郑州烟草研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan