一种鱼类脑组织总rna的提取方法
【专利摘要】本发明提供了一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，具体为：将鱼类脑组织经液氮速冻，Trizol裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，加入异丙醇-醋酸钠混合，混合液经RNA纯化吸附柱吸附纯化后，进行DNA酶处理，经洗涤而获得鱼类脑组织总RNA。本发明所述提取方法，可避免鱼脑组织中的脂类（磷脂、糖脂和胆固醇）和蛋白质等对RNA提取的影响，获得纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染的RNA分离纯化方法。
【专利说明】一种鱼类脑组织总RNA的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鱼类总RNA的提取，具体地说，涉及一种鱼类脑组织总RNA的提取方 法。
【背景技术】
[0002] 总RNA分离纯化技术是分子生物学研究技术的基础，从组织中提取纯度稳定、完 整性好、重复性高、无污染的总RNA的分离纯化方法，是决定后续实验结果质量的关键，一 些特定的部位使用通用的RNA分离纯化方法，往往不能满足要求，需要相应的处理与提取 制备方法。
[0003] 鱼类脑组织结构类型基本相同，不同种类成分含量上略有差异，但大体上相近，主 要成分是脂类（磷脂、糖脂、胆固醇）和蛋白质，采用常规RNA分离纯化方法，在抽提的过程 中脂类不易去除，且易形成蛋白污染，鱼脑组织单位细胞RNA含量相对较少，采样和操作过 程中极易造成RNA降解而使提取失败。诸多问题，使鱼类脑组织总RNA难以稳定的分离和 纯化。
[0004] 目前，有针对性的分离纯化鱼脑组织总RNA的方法较少，用传统方法提取的鱼脑 组织总RNA含量少、稳定性差、容易污染，无法满足后续实验的要求。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种适用于鱼类脑组织总 RNA的提取方法。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种鱼类脑组织总RNA的提取方法，具体为：将鱼类脑组织经液氮速冻，Trizol裂 解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，加入异丙醇-醋酸钠混合，混合 液经RNA纯化吸附柱吸附纯化后，进行DNA酶处理，经洗涤而获得鱼类脑组织总RNA。
[0008] 进一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β -巯基乙醇和/或8-羟基喹啉，使其 在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1. 0-2. 5%和0. 10-0. 15%。由于Trizol裂解 液本身含有〇. 10%的8-羟基喹啉，因此也可不再加入8-羟基喹啉。但为了更好的抑制内 源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等物质的干扰，在Trizol裂 解液使用前加入〇. 05% 8-羟基喹啉，使其在Trizol裂解液中的体积浓度达到0. 15%。
[0009] 进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为1/4 Trizol体积。
[0010] 进一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比为24:1。
[0011] 作为优选，所述硫酸铵的使用浓度为4mol/L。，
[0012] 进一步地，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1。
[0013] 进一步地，所述吸附纯化具体为：将混合有异丙醇-醋酸钠的混合液加入RNA纯化 吸附柱，离心后经乙醇离心洗脱除杂，再经RNase-free水离心洗脱得到纯化后的RNA溶液。
[0014] 进一步地，DNA酶处理后，对DNA酶进行灭活。
[0015] 进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：
[0016] 1)取鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存；
[0017] 2)将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中， 超声破碎，离心，取上清；
[0018] 3)加入硫酸铵溶液，振荡摇匀，离心，取上清；
[0019] 4)加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取 上清；
[0020] 5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀；
[0021] 6)吸取步骤5)得到的混合液至RNA纯化吸附柱中吸附，离心，弃废液；
[0022] 7)向纯化吸附柱中加入预冷的乙醇，离心，弃废液；重复一次；
[0023] 8)再次离心除杂弃废物后，将吸附柱晾干；
[0024] 9)向吸附柱中加入RNase-free水,离心，弃吸附柱；
[0025] 10)力卩入 RNase-free DNase 缓冲液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制剂和 RNase-free水，处理40_50min，得到DNA酶处理液；
[0026] 11)加入乙二胺四乙酸加热处理，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的 无水乙醇,混匀后放置15-25min,离心,弃上清；
[0027] 12)用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入 RNase-free水或0· 5%的SDS溶液充分溶解，-80°C保存。
[0028] 更进一步地，所述提取方法具体包括以下步骤：
[0029] 1)用手术工具取60_80mg鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速 冻，_80°C超低温冻存；
[0030] 2)将冻存样本迅速转入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎 8-10s，17000-19000g 4°C离心 lOmin，取上清；
[0031] 3)加入500μ I 4mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000-7000g 4°C离心3-5min，吸上 清液至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH = 5. 5 ;
[0032] 4)加入氯仿和正丁醇混合液350_400μ 1，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静 置5min，12000g 4°C离心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积 比为24:1 ;
[0033] 5)加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20°C放置 60min;所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L， 所述醋酸钠溶液的pH = 5. 2 ;
[0034] 6)吸取步骤5)得到的混合液700 μ 1至RNA纯化吸附柱中，12000g4°C离心lmin， 倒掉收集管中废液；
[0035] 7)向纯化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75 %的已预冷乙醇，静置Imin, 12000g 4°C离心lmin，倒掉收集管中废液；重复一次；
[0036] 8) 12000g 4°C离心2min，将吸附柱置于洁净RNase-free离心管中，室温封闭静置 5-lOmin,瞭干；
[0037] 9)向吸附柱中加入20-22 μ L RNase-free水，室温封闭静置2min，12000g 4°C离 心lmin，弃吸附柱；
[0038] 10)加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液、2 μ 1 的 RNase-free DNA 酶、1 μ 1 的 RNA酶抑制剂和22 μ I RNase-free水，37°C处理40-50min，得到DNA酶处理液；
[0039] 11)加入2. 5 μ 1浓度为0· 5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78-82°C加热处理3min，随 后依次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1浓度为3. 5mol/L醋酸钠和250 μ 1已预冷的无 水乙醇，混匀后-80°C放置15-25min，12000g 4°C离心lOmin，弃上清；
[0040] 12)用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4°C离心5min，弃上清，室温封闭静置 5-10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0041] 本发明的有益效果在于：
[0042] 本发明提供一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，可避免鱼脑组织中的脂类（磷脂、 糖脂和胆固醇）和蛋白质等对RNA提取的影响，获得纯度稳定、完整性好、重复性高、无污染 的RNA分离纯化方法。
[0043] 本发明通过在Trizol中加入2.5%的β-巯基乙醇和0.05%的8-羟基喹啉，可 在裂解过程中有效抑制内源RNA酶活性，减少RNA的降解，还可有效的排除核蛋白、色素等 物质的干扰。Trizol中加入β -巯基乙醇和8-羟基喹啉，用来抑制RNA酶活性，本申请根 据实验发现，在处理富含RNA酶的组织时，Trizol加入2. 5%的β -巯基乙醇和0. 05%的 8-羟基喹啉协同作用效果最好，可有效的抑制内源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素等 的干扰。
[0044] 本发明将冷冻样本在Trizol中匀浆后，使用超声破碎进行处理，能够更好的裂解 细胞，使RNA充分游离到液相中。液氮研磨法破碎样本，由于液氮极易挥发，研磨过程中要 不断的向研钵中加入液氮，耗费时间长，操作不方便，有安全隐患，而对冻存样本进行电动 匀浆，匀浆后再使用超声破碎，细胞破碎速度快，匀浆彻底，操作简单安全，缩短了处理时 间，有效减少RNA的降解。
[0045] 本发明在Trizol裂解液处理后，将离心力增加至17000-19000g，可有效沉降破碎 细胞壁、杂质等。
[0046] 本发明在Trizol处理液中加入4mol/L硫酸铵，可使蛋白脱水沉淀，有效去除提取 过程中的蛋白污染。针对组织中蛋白含量较高，加入硫酸铵沉淀蛋白一次，硫酸铵沉淀蛋白 的效率一般大于85%，降低蛋白对后续实验的影响，再进行氯仿正丁醇抽提，可以充分去除 蛋白。
[0047] 本发明使用氯仿与正丁醇混合液（24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分离效果，保 证RNA的纯度和完整性。常规提取过程中，抽提时使用氯仿或氯仿异戊醇混合物，使用量约 为1/5 Trizol体积，改用氯仿与正丁醇混合物，比例为24:1，使用量增加至1/4体积可以有 效提高处理效率，利于水相、蛋白相和有机相的分离，且异戊醇的毒性较大，改用正丁醇可 降低毒性，保护操作人员。
[0048] 本发明将常规方法中的异丙醇沉淀步骤改为使用异丙醇-醋酸钠混合液（异丙 醇：醋酸钠=4:1)沉淀，处理条件为-20°C放置60min，，沉淀RNA。在加入异丙醇同时加 入醋酸钠，沉淀RNA的同时溶解多糖类物质，使它们有效分离。醋酸钠等高盐溶液可在提 取过程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的体积为10%，浓度一般为3mol/L(终 浓度0. 3mol/L)，处理条件一般为-20°C放置3小时，本申请根据实验发现在加入异丙醇阶 段，醋酸钠加入量增加至20%且浓度降低至2111〇1/1(终浓度0.4111〇1/1)，处理条件为-201： 放置60min，可提高沉淀并溶解多糖类物质的效率，而DNA酶处理阶段醋酸钠浓度也增加至 3. 5mol/L，可有效析出RNA。
[0049] 本发明使用RNA纯化吸附柱进行吸附和洗脱，可有效缩短提取时间，有效减少RNA 的降解。
[0050] 本发明利用纯化吸附柱处理混合液，RNA容易富集于吸附膜上，可有效的提高总 RNA产量。传统方法中，异丙醇处理，离心后的沉淀为总RNA，本发明将异丙醇-醋酸钠处理 液加入纯化吸附柱，离心后，RNA富集于吸附膜上，而残留的蛋白和脂肪等被有效的分离，从 而达到纯化RNA的目的，同时提高了产量，且使用吸附柱时间短，可减少RNA的降解。
[0051] 本发明采用75%乙醇清洗吸附膜，并在洗脱过程中将离心力增加至12000g，可提 高清洗效果，有效去除残留的蛋白和脂肪。
[0052] 本发明引入DNA酶处理步骤，在DNA处理前，已经通过氯仿正丁醇分离，可去掉部 分DNA片段，但并不彻底，加入DNA酶处理步骤，将消化时间延长至40-50min，可提高DNA酶 处理效率，更彻底的去除基因组DNA污染。DNA酶的失活使用78-82°C热处理3min，使DNA 酶失活更加彻底，利于后续的分离与纯化，相对于氯仿抽提法，缩短了处理时间，有效减少 RNA在纯化中的降解。
【专利附图】
【附图说明】
[0053] 图1为本发明所述方法提取的鱼类脑组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳图；
[0054] 图2为本发明所述方法提取的鱼类脑组织总RNA经反转录后，对β -actin基因进 行PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0055] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0056] 实施例1
[0057] 1.用手术工具取60mg鱼脑组织，无菌RNase-free (无 RNA酶）水清洗后迅速放入 液氮中速冻，超低温（_80°C )冻存。
[0058] 2.将冻存样本迅速转入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8s，间隔15s，超声破碎8s， 17000g 4°C离心lOmin，吸上清至离心管A中。
[0059] 注：Trizol裂解液（TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨 酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司），Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巯基乙醇 和0. 5 μ 1的8-羟基喹啉。
[0060] 3.向离心管A中加入500μ I 4mol/L硫酸铵（ΡΗ5. 5)，振荡摇匀，5000g 4°C离心 3min，吸上清液至离心管B中。
[0061] 4.向离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=24:1) 350μ 1 (混合 液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4°C离心lOmin，吸 取上清液至离心管C中。
[0062] 5.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液（异丙醇：醋酸钠=4:1， 醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20°C放置60min。
[0063] 6.吸取混合液700 μ 1至RNA纯化吸附柱中（EZ-10 Spin Column总RNA纯化吸附 柱，吸附柱置于废液收集管中，B. B. I公司），12000g4°C离心lmin，倒掉收集管中废液。
[0064] 7.向纯化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75 %的已预冷乙醇，静置Imin, 12000g 4°C离心lmin，倒掉收集管中废液。
[0065] 8.重复上述步骤，向纯化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75%的已预冷乙醇， 静置lmin，12000g 4°C离心lmin，倒掉收集管中废液。
[0066] 9. 12000g 4°C离心2min，将吸附柱置于RNase-free离心管D中，室温封闭静置 5-lOmin,瞭干。
[0067] 10.向吸附柱中加入2(^1^8似86-仕66水，室温封闭静置211^11，1200(^41：离心 lmin，弃吸附柱。
[0068] 11.向离心管 D 中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液（IOXDNase I Buffer， 宝生物公司）、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶（5υ/μ I RNase-free Recombinant DNase I，宝 生物公司）、1 μ I的RNA酶抑制剂（40U/μ I Recombinant RNase Inhibitor，宝生物公司） 和 22 μ I RNase-free 水，37°C处理 40-50min，得到 DNA 酶处理液。
[0069] 12.向DNA酶处理液中加入2. 5 μ 1浓度为0. 5 mol/L EDTA，混匀78°C加热处理 3min，随后依次加入 RNase-free 水 47. 5 μ 1、10 μ 1 浓度为 3. 5mol/L RNase-free 醋酸纳和 250μ 1已预冷的无水乙醇，混匀后-80°C放置15-25min，12000g 4°C离心10min，弃上清。
[0070] 13.用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4°C离心10min，弃上清，室温封闭静 置5min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0071] 实施例2
[0072] 1.用手术工具取80mg鱼脑组织，无菌RNase-free (无 RNA酶）水清洗后迅速放入 液氮中速冻，超低温（_80°C )冻存。
[0073] 2.将冻存样本迅速转入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎10s，间隔20s，超声破碎10s， 19000g 4°C离心10min，吸上清至离心管A中。
[0074] 注：Trizol裂解液（TRIzol的主要成分是苯酚，还包含异硫氰酸胍、十二烷基肌氨 酸钠、醋酸钠等，Life technologies公司），Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巯基乙醇 和0. 5 μ 1的8-羟基喹啉。
[0075] 3.向离心管A中加入500μ I 4mol/L硫酸铵（ΡΗ5. 5)，振荡摇匀，7000g 4°C离心 5min，吸上清液至离心管B中。
[0076] 4.向离心管B中加入氯仿和正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=24:1)400 μ 1 (混合 液体积的1/4)，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置5min，12000g 4°C离心10min，吸 取上清液至离心管C中。
[0077] 5.向离心管C中加入上清等体积的异丙醇醋酸钠混合液（异丙醇：醋酸钠=4:1， 醋酸钠浓度2mol/L)，振荡摇匀-20°C放置60min。
[0078] 6.吸取混合液700 μ 1至RNA纯化吸附柱中（EZ-10 Spin Column总RNA纯化吸附 柱，吸附柱置于废液收集管中，B. B. I公司），12000g4°C离心lmin，倒掉收集管中废液。
[0079] 7.向纯化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75 %的已预冷乙醇，静置Imin, 12000g 4°C离心lmin，倒掉收集管中废液。
[0080] 8.重复上述步骤，向纯化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75%的已预冷乙醇， 静置lmin，12000g 4°C离心lmin，倒掉收集管中废液。
[0081] 9. 12000g 4°C离心2min，将吸附柱置于RNase-free离心管D中，室温封闭静置 IOmin,瞭干。
[0082] 10.向吸附柱中加入22 4 1^尺似86-仕66水，室温封闭静置21^11，1200(^41：离心 lmin，弃吸附柱。
[0083] 11.向离心管 D 中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液（IOXDNase I Buffer， 宝生物公司）、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶（5υ/μ I RNase-free Recombinant DNase I，宝 生物公司）、I μ I的RNA酶抑制剂（40U/ μ I Recombinant RNase Inhibitor，宝生物公司） 和 22 μ I RNase-free 水，37°C处理 40-50min，得到 DNA 酶处理液。
[0084] 12.向DNA酶处理液中加入2. 5 μ 1浓度为0. 5 mol/L EDTA，混匀82°C加热处理 3min，随后依次加入 RNase-free 水 47. 5 μ 1、10 μ 1 浓度为 3. 5mol/L RNase-free 醋酸纳和 250μ 1已预冷的无水乙醇，混匀后-80°C放置15-25min，12000g 4°C离心10min，弃上清。
[0085] 13.用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4°C离心10min，弃上清，室温封闭静 置10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0086] 本发明提取并纯化获得的鱼脑组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳如图1所示，28s条带 亮度是18s亮度的二倍，同时测得的鱼脑总RNA浓度为200-300ng/μ 1，同时吸光度0D260/ 0D280的比值稳定在1. 8-2. 0之间，说明获得的总RNA纯度高、完整性佳、无 DNA和蛋白污 染。
[0087] 本发明提取后的鱼脑组织总RNA经反转录后，对β-actin基因进行了 PCR扩增， 琼脂糖电泳凝胶检测结果如图2 :电泳条带完整、清晰、特异性好，说明此总RNA能满足后续 的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、体外翻译和分子克隆等多种下游实验。 [0088] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种鱼类脑组织总RNA的提取方法，其特征在于，将鱼类脑组织经液氮速冻，Trizol 裂解液处理后低温高速离心，经硫酸铵、氯仿-正丁醇萃取后，加入异丙醇-醋酸钠混合，混 合液经RNA纯化吸附柱吸附纯化后，进行DNA酶处理，经洗涤而获得鱼类脑组织总RNA。
2. 根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入 β -巯基乙醇和8-羟基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的体积浓度分别为1. 0-2. 5%和 0· 10-0. 15%。
3. 根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量为 1/4 Trizol 体积。
4. 根据权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿与正 丁醇的体积比为24:1。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸铵的使用浓度为 4mol/L〇
6. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，经异丙醇-醋酸钠沉淀时，异丙醇与 醋酸钠的体积比为4:1。
7. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述吸附纯化为：将混合有异丙 醇-醋酸钠的混合液加入RNA纯化吸附柱，离心后经乙醇离心洗脱除杂，再经RNase-free 水离心洗脱得到纯化后的RNA溶液。
8. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，DNA酶处理后，对DNA酶进行灭活。
9. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 取鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后放入液氮中速冻，超低温冻存； 2) 将冻存样本转入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，匀浆后置于冰中，超声 破碎，离心，取上清； 3) 加入硫酸铵溶液，振荡摇匀，离心，取上清； 4) 加入氯仿和正丁醇混合液，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置，离心，取上 清； 5) 加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀； 6) 吸取步骤5)得到的混合液至RNA纯化吸附柱中吸附，离心，弃废液； 7) 向纯化吸附柱中加入预冷的乙醇，离心，弃废液；重复一次； 8) 再次离心除杂弃废物后，将吸附柱晾干； 9) 向吸附柱中加入RNase-free 7jC，离心，弃吸附柱； 10) 加入 RNase-free DNase 缓冲液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制剂和 RNase-free 水，处理40-50min，得到DNA酶处理液； 11) 加入乙二胺四乙酸加热处理，随后依次加入RNase-free水、醋酸钠和预冷的无水 乙醇，混匀后放置15-25min，离心，弃上清； 12) 用预冷的乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，室温封闭静置5-10min，晾干，加入 RNase-free水或0· 5%的SDS溶液充分溶解，-80°C保存。
10. 根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)用手术工具取60_80mg鱼脑组织，无菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速 冻，-80°C超低温冻存； 2) 将冻存样本迅速转入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free电动匀浆器匀浆，将EP管放置于冰中，超声破碎8-10s，间隔15-20s，超声破碎 8-10s，17000-19000g 4°C离心 lOmin，取上清； 3) 加入500μ1 4mol/L硫酸铵溶液，振荡摇匀，5000-7000g 4°C离心3-5min，吸上清液 至离心管B中；所述硫酸铵溶液的pH = 5. 5 ; 4) 加入氯仿和正丁醇混合液350-400μ 1，振荡摇匀至均匀的乳白状絮状，室温静置 5min，12000g 4°C离心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿与正丁醇的体积比 为 24:1 ; 5) 加入与步骤4)混合液等体积的异丙醇-醋酸钠混合液，振荡摇匀-20°C放置60min ; 所述异丙醇-醋酸钠混合液中异丙醇与醋酸钠的体积比为4:1，醋酸钠浓度2mol/L，所述醋 酸钠溶液的pH = 5. 2 ; 6) 吸取步骤5)得到的混合液700μ 1至RNA纯化吸附柱中，12000g4°C离心lmin，倒掉 收集管中废液； 7) 向纯化吸附柱中加入500μ1 RNase-free 75%的已预冷乙醇，静置lmin，12000g 4°C离心lmin，倒掉收集管中废液；重复一次； 8) 12000g 4°C离心2min，将吸附柱置于洁净RNase-free离心管中，室温封闭静置 5-lOmin,瞭干； 9) 向吸附柱中加入20-22以1^尺似86-仕66水，室温封闭静置21^11，1200(^41：离心 lmin，弃吸附柱； 10) 加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 缓冲液、2 μ 1 的 RNase-free DNA 酶、1 μ 1 的 RNA 酶抑制剂和22 μ I RNase-free水，37°C处理40-50min，得到DNA酶处理液； 11) 加入2. 5 μ 1浓度为0· 5mol/L乙二胺四乙酸，混匀78-82°C加热处理3min，随后依 次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1浓度为3. 5mol/L醋酸钠和250 μ 1已预冷的无水乙 醇，混匀后_80°C放置15-25min，12000g 4°C离心lOmin，弃上清； 12) 用75%已预冷的乙醇洗涤沉淀，12000g 4°C离心5min，弃上清，室温封闭静置 5-10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
【文档编号】C12N15/10GK104212795SQ201410503432
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】杨晓飞, 徐绍刚, 李文通, 袁丁, 杨贵强, 马峻峰 申请人:北京市水产科学研究所