专利名称：：一种从鼠脑组织中获得小分子rna的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
中提取RNA的方法，主要是一种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法。
背景技术：
：小分子RNA近年来己成为RNA研究的热点，已有大量的文献报道小分子RNA参与了生物体中重要生命活动的调控。小分子RNA的有效富集是研究小分子RNA的前提条件，由于小分子RNA在总RNA中所占比例较低(约5%-10%左右)加上传统的RNA提取方法的局限性，故小分子RNA的得率很低。microRNA是具有代表性的小分子RNA，它是一类长约22nt具有调节功能的非编码小分子RNA，它参与了发育时序、细胞增殖与死亡以及肿瘤发生的调控，在生物体的分化、增殖、发育以及凋亡过程中具有重要作用。目前，常用的RNA提取方法有TriZol试剂快速提取法、十二烷基磺酸钠-醋酸钾法、苯酚法、异硫氰酸肌法、十六烷基三甲基溴化铵法、氯化锂法等。所有这些方法都是针对一般的总RNA提取建立的，没有考虑到小分子RNA富集的特殊需要，所以以这些提取方法获得的总RNA中的小分子RNA的含量极低，不足以满足小分子RNA研究的要求。
发明内容本发明的目的在于克服上述技术的缺陷，而提供一种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。这种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，包括以下步骤1)研磨取50mg小鼠脑组织，加入lmlEzol，用匀浆器研磨至匀桨，于室温放置10min;2)去不溶物4°C，12000xg,离心10min;将上清转入无核糖核酸酶的1.5ml离心管；3)氯仿抽提每管加入200-250pi氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min;4)4°C，12000xg，离心15min;取上清至新的无RNase的1.5ml离心管中；5)异丙醇沉淀加入1ml-2ml异丙醇，混匀，-15°〇至-20°"沉淀12h;6)4°C,12000xg，离心10min;弃上清；7)加入lml预冷的75。/。乙醇，洗涤沉淀；4°C，7500xg，离心5min;8)弃上清，真空干燥，沉淀溶于30nl焦碳酸二乙酯处理水DEPC-H20中；9)NanoDrop分光光度计检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性；10)YM-lOO柱子中加入O.lMEDTA150nl润洗，4°C，5000xg，离心6min;按5pg上样量取出相应样品的体积，与150nl0.1MEDTA混合均匀后转移到Y]VMt)O睡子中"4li，5000xg，离心6min。过柱所得即小分子RNA。2、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于在步骤3)中，加入的氯仿用暈为250nl氯仿/1mlEzol。3、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于在步聚5)中异丙醇沉淀条件是异丙醇的量为ltnl，沉淀的温度为-2(TC，沉淀的时间为12h。本发明的有益效果结果可用RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳检测小分子RNA来改方法有效获得了小分子RNA。过于短小的RNA分子可用特异性的茎环引物来作为逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的引物，该技术在miRNA扩增效率方面比传统方法高100多倍。该方法可用分离得到的小分子RNA也可直接用总RNA作为反转录模板。图1为用本发明的方法提取的小鼠脑组织总RNA的电泳图谱图2为从用本发明的方法提取的总RNA中分离获得的小分子RNA的检测结果其中，图l中l。/。琼脂糖MOPS电泳，60V,40min;图2中2%琼脂糖，lxTAE缓冲液，70v，45min。具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步地详细描述这种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，包括以下步骤1)取两份50mg左右小鼠脑组织，各加入1mlEzol，用匀浆器研磨至匀浆，分别标记为MB1、MB2;于室温放置10min;2)4°C，12000xg，离心10min;将上清转入无核糖核酸酶(RNase)的1.5ml离心管；3)每管加入250^氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min;4)4°C，12000xg，离心15min;取上清至新的无RNase的1.5ml离心管中；5)加入lml异丙醇，混匀，.2(TC沉淀12h;6)4'C，12000xg,离心10min;弃上清；7)加入1ml预冷的75%乙醇，洗涤沉淀；4'C，7500xg,离心5niin;8)弃上清，真空干燥，沉淀溶于30nlDEPC-H2O中；9)NanoDrop分光光度计(ND-1000)检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性。结果如表l、图l所示。10)YM-100柱子中加入0.1MEDTA150pl润洗，4'C，5000xg，离心6min;按5吗上样量取出相应样品的体积，与150^0.1MEDTA混合均匀后转移到YM-100柱子中，4'C，5000xg，离心6min。过柱所得即小分子RNA。RT-CR检测MicroRNA(以miR-let-7a为例)1)用YM-100分离得到的小分子RNA进行反转录，RT体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>ddH206.82'nl总体积为10pl，混匀后稍离心在PCR仪中进行反应；反应参数设置为:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>3)反应结束后取3nl反应液，进行2.0%琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图2所示。从表1可以看出用本发明的方法提取的总RNA含量高、纯度好，电泳结果(图1)显示提取的总RNA完整性好。图2中mbl、mb2所示分别为从样品MB1、MB2的总RNA分离得到的小分子RNA中以miR-let7a为检测对象的RT-PCR结果电泳图。miR-let7a是在小鼠脑组织中普遍表达的一种microRNA，图2说明本发明的方法有效地分离得到了小分子RNA。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。权利要求1、一种从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于包括以下步骤1)研磨取50mg小鼠脑组织，加入1mlEzol，用匀浆器研磨至匀浆，于室温放置10min；2)去不溶物4℃，12000×g，离心10min；将上清转入无核糖核酸酶的1.5ml离心管；3)氯仿抽提每管加入200-250μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；4)4℃，12000×g，离心15min；取上清至新的无RNase的1.5ml离心管中；5)异丙醇沉淀加入1ml-2ml异丙醇，混匀，-15℃至-20℃，沉淀12h；6)4℃，12000×g，离心10min；弃上清；7)加入1ml预冷的75％乙醇，洗涤沉淀；4℃，7500×g，离心5min；8)弃上清，真空干燥，沉淀溶于30μl焦碳酸二乙酯处理水DEPC-H2O中；9)NanoDrop分光光度计检测总RNA的含量及纯度，甲醛变性胶检测总RNA的完整性；10)YM-100柱子中加入0.1MEDTA150μl润洗，4℃，5000×g，离心6min；按5μg上样量取出相应样品的体积，与150μl0.1MEDTA混合均匀后转移到YM-100柱子中，4℃，5000×g，离心6min，过柱所得即小分子RNA。2、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于在步骤3)中，加入的氯仿用量为250pi氯仿/1mlEzol。3、根据权利要求1所述的从鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，其特征在于在步聚5)中异丙醇沉淀条件是异丙醇的量为lml，沉淀的温度为-20'C，沉淀的时间为12h。全文摘要本发明涉及一种从小鼠脑组织中获得小分子RNA的方法，该方法包括以下步聚包括以下步骤1)研磨加入Ezol充分研磨裂解细胞；2)去不溶物4℃、12000×g离心10min，取上清；3)氯仿抽提200-250μl氯仿/1mlEzol，剧烈振荡后室温静置；4)4℃，12000×g，离心15min，取上清；5)异丙醇沉淀加入异丙醇1-2ml，反复倒置，混匀，-20℃沉淀12h；6)4℃，12000×g，离心10min，弃上清；7)洗涤沉淀加入75％乙醇1ml，使沉淀悬浮；8)4℃，7500×g，离心5min，弃上清；9)干燥沉淀，溶于焦碳酸二乙酯处理水中；10)YM-100过柱分离小分子RNA。本发明有益的效果证明该发明可以有效地获得小分子RNA，解决了传统RNA提取方法小分子RNA获取效率低难题。文档编号C07H21/00GK101353364SQ20081012086公开日2009年1月28日申请日期2008年9月9日优先权日2008年9月9日发明者丁先锋,徐根明,李顺杰,郭江峰申请人:浙江理工大学;郭江峰