动物肺组织的取材和固定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物组织的处理方法，具体涉及实验动物肺组织的取材和固定方法，以及所述方法的用途。
【背景技术】
[0002]在肺损伤、肺脏疾病和药物非临床安全性评价肺组织学结构及正常肺组织结构等研究中，常需要进行组织学制片，并借助H.E染色或组织化学、免疫组织化学、原位杂交等各种特殊染色，进行光学显微镜观察与研究。由于肺组织主要由肺内支气管的各级分支及其终端的大量肺泡组成，呈现含有大量气体的海绵状结构等特殊性。如果和大多数脏器一样采用取出后浸泡固定法固定，将会因为肺泡内外压差的丧失以及制片过程中对肺组织的人为挤压，导致光镜下观察到的肺组织呈现大片肺萎陷图像，给观察肺泡隔的细微结构以及深入研究肺组织内各种细胞的功能等研究带来极大障碍。
[0003]为解决以上问题，目前OECD推荐采用心脏灌流固定法和气管灌注固定法(0ECDGuidance Document on Histopathology for Inhalat1n Studies, 28September2009Draftl-36)。这两种方法虽然部分解决了肺泡萎陷难题，但心脏灌流固定法使肺内血管尤其是肺泡壁毛细血管过度扩张，灌流后血管呈非生理状态，原有的病变(如血细胞边集、扣押等)遭到破坏，如灌流压力过大还会造成肺毛细血管破裂；气管灌注固定法从气管内灌注固定液，不可避免地将对肺泡壁产生过度挤压，使肺泡丧失生理状态下的组织结构特征。此外因肺组织病变存留在肺泡内的物质，如炎性渗出物、蛋白水肿液等都将被固定液冲走或改变其分布。以上方法的缺陷均给肺组织的病理诊断与研究带来了偏差甚至困难。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明的发明人通过大量实验和反复摸索，最终发现了一种操作简便、同时能使肺脏处于自然扩张状态的肺组织取材与固定方法，由此完成了本发明。
[0005]本发明第一方面涉及动物肺组织的取材和固定方法，其包括以下步骤:
[0006](I)结扎已死亡动物的气管，在结扎处远心端离断气管，将整个肺脏和结扎的气管一起取出；
[0007](2)将步骤(I)获得的整个肺脏进行固定，得到固定的肺组织；优选地，所述固定方法为将整个肺脏完全浸泡于固定液中。
[0008]根据本发明第一方面任一项的取材和固定方法，其中所述动物为哺乳动物，例如为小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、兔、羊、马、猪等。
[0009]在本发明中，所述动物的处死方法优选为能够使肺脏保持自然扩张状态的方法，例如不会暴露胸腔，或者不会因为过度挣扎导致血液进入肺组织(例如肺泡)。在本发明的实施方案中，所述处死方法为麻醉后腹主动脉放血处死。
[0010]根据本发明第一方面任一项的取材和固定方法，其中步骤(I)在结扎气管前，动物胸腔的负压状态未被破坏。
[0011]在本发明中，所述胸腔的负压状态未被破坏是指未暴露或伤及胸腔，或者虽然暴露或伤及胸腔，但由呼吸机维持胸腔的负压状态。
[0012]根据本发明第一方面任一项的取材和固定方法，其中所述将步骤(I)获得的整个肺脏完全浸泡于固定液中的方法可以为本领域公知的任何可实现的方法，例如包括，在固定液液平面或肺组织表面覆盖可以阻止肺组织浮出的物体、将重物与气管连接或者为了避免对肺组织的破坏，可以选择将肺组织与其它邻近组织(例如心脏等)一并取出，小动物可以其邻近组织的重量使肺组织完全浸泡于固定液中，大动物也可将重物与心脏连接。
[0013]在本发明中，所述重物是指该物体的重量足以使肺组织完全浸泡于固定液中，而且该重物不会被固定液腐蚀，不会影响肺组织的固定，不会破坏肺组织原有的生理或病理状态。
[0014]在本发明的实施方案中，所述重物与气管连接。
[0015]根据本发明第一方面任一项的取材或固定方法，其中所述固定液为本领域公知的组织固定液，例如为醛类溶液或醇类溶液，例如选自甲醛溶液、多聚甲醛溶液、乙醇溶液或者上述溶液的混合溶液，优选地，所述甲醛溶液或多聚甲醛溶液的浓度约为4%。
[0016]在本发明的实施方案中，所述固定液为4%中性甲醛溶液。
[0017]在本发明中，所述固定肺组织的方法为本领域所公知，例如可采用化学方法，如采用各种化学溶液做固定液。在本发明的实施方案中，所述固定肺组织的方法为采用固定液的方法。
[0018]在本发明中，所述固定肺组织的时间为本领域所公知，例如可根据选择的固定液不同确定相应的固定时间；在本发明的实施方案中，固定肺组织的时间为24小时。
[0019]在本发明中，所述肺组织为健康肺组织或处于病理状态的肺组织。
[0020]本发明第二方面涉及按照本发明第一方面任一项的方法制备得到的动物肺组织。
[0021]本发明第三方面涉及肺组织切片的制备方法，其包括本发明第一方面任一项的取材或固定方法，以及任选的将固定后的肺组织进行制片的步骤。
[0022]在本发明中，将固定后的肺组织进行制片的方法为本领域所公知，例如可采用将固定后的肺组织进行包埋再制片，或者将固定后的肺组织进行冰冻切片的方法。
[0023]在本发明中，将固定后的肺组织进行包埋的方法为本领域所公知，例如为石蜡包埋或塑料包埋。
[0024]在本发明的实施方案中，采用石蜡包埋的方法。
[0025]在本发明的实施方案中，所述石蜡包埋包括脱水、透明、浸蜡等步骤。
[0026]在本发明中，将包埋后的组织块进行制片(或切片)的方法为本领域所公知，所述切片的厚度根据实验目的决定。在本发明的实施方案中，采用石蜡切片机进行切片，切片厚度为3 μ m。
[0027]在本发明中，对组织切片进行染色的方法为本领域所公知。例如HE染色、Trichrome染色，天狼星红染色、Van GiesonJ s染色、免疫组化等等。在本发明的实施方案中，对组织切片采用HE染色(苏木精-伊红染色)。
[0028]本发明第四方面涉及根据本发明第三方面任一项的制备方法制备得到的肺组织切片。
[0029]本发明还涉及本发明第一方面任一项的取材或固定方法用于确定离体肺组织的病理类型或病理状态的用途，或者用于药物的非临床研究试验的用途。
[0030]发明的有益效果
[0031]本发明提供了动物肺组织的取材和固定方法，其操作简便，解决了肺泡萎陷和扩张等人工假像；与常规浸入固定法、气管灌注固定法、心脏灌流固定法相比，具有肺泡结构完整清楚，肺泡壁毛细血管内的红细胞无溢出现象等优点；利用该方法制备的组织切片能够保持肺组织的原有生理、病理状态，并且保持肺泡和血管的自然扩张状态，为肺组织病变的诊断(如肺水肿、肺大疱、肺不张与炎细胞渗出等)与研究奠定了良好的形态学基础。本发明的方法可广泛应用于肺脏的组织学以及肺脏疾病的组织病理学与病理机制研究中，在药物非临床研究中也具有重要的实用价值。
【附图说明】
[0032]图1大鼠麻醉后仰卧位置于解剖台上，暴露腹腔，腹主动脉放血处死。剪开胸颈部皮肤，钝性分离出气管。注意务必不要伤及胸壁结构，以免破坏胸腔负压。
[0033]图2在大鼠甲状软骨下结扎气管，注意扎死，不能有漏气发生。
[0034]图3完整分离大鼠肺脏的腹侧观，因暴露胸腔前结扎气管，肺内充盈气体，故肺呈膨隆状。肺脏分离过程如下:在结扎处远心端剪断气管，小心暴露胸腔并取下胸腺与心脏，用镊子提起气管由上至下钝性分离出全肺(注意避免伤及各个肺叶)，自横膈上剪断食道，取出肺脏。在气管断端连一重物。
[0035]图4完整分离大鼠肺脏的背侧观，注意肺脏呈膨隆状。
[0036]图5在气管处系一重物，使大鼠肺脏潜浮固定于4%中性甲醛液体中。
[0037]图6大鼠肺脏组织石蜡切片，HE染色。示包含全部5叶肺脏切片的全景照片，可见各肺叶肺泡均呈自然扩张状态，图中一小格为2.5mm。
[0038]图7图6局部放大观，示肺组织各级肺泡(肺泡囊、肺泡管与肺泡)结构呈自然扩张状态，未见肺泡陷落或过度扩张，图中一小格为0.25mm。
[0039]图8图7进一步放大观，示肺泡自然扩张，肺泡隔菲薄，图中一小格为100 μ m。
[0040]图9小鼠麻醉后仰卧位置于解剖台上，暴露腹腔，腹主动脉放血处死。剪开胸颈部皮肤，钝性分离出气管。注意务必不要伤及胸壁结构，以免破坏胸腔负压。
[0041]图10在甲状软骨下结扎气管，注意扎死，不能有漏气发生。
[0042]图11完整分离小鼠肺脏的腹侧观，因暴露胸腔前结扎气管，肺内充盈气体，故肺呈膨隆状。肺脏分离过程如下:在结扎处远心端剪断气管，小心暴露胸腔并取下胸腺与心脏，用镊子提起气管由上至下钝性分离出全肺(注意避免伤及各个肺叶)，自横膈上剪短食道，取出肺脏。在气管断端连一重物。
[0043]图12完整分离小鼠肺脏的背侧观，注意肺脏呈膨隆状。
[0044]图13