一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括RNA提取试剂、恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；从病毒RNA逆转录到链置换扩增全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35分钟，核酸试纸条检测结果需1-2分钟，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1小时左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合现场快速检测使用。
【专利说明】一种扎伊尔型埃博拉病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方 法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种针对扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对 扎伊尔型埃博拉病毒的定性检测。 (二）
【背景技术】
[0002] 埃博拉出血热是由埃博拉病毒感染引起的一种高度接触性烈性传染病，感染人类 后可引起严重的急性出血热，易人传人，致死率高达70-90%。埃博拉病毒具有囊膜，基因组 不分节段，为单链负股RNA，属于单负股病毒目丝状病毒科丝状病毒属。埃博拉病毒含有一 个线性RNA基因组，长约19Kb，含有7个基因，依次编码核蛋白（NP)、病毒结构蛋白（VP35， VP40)、糖蛋白（GP)、额外病毒结构蛋白（VP30，VP24)、RNA依赖RNA聚合酶（L)。埃博拉出 血热需要通过实验室手段确诊，常用的方法有病毒分离、电镜观察、常规PCR、免疫荧光、荧 光定量PCR和ELISA等。这些方法或是操作复杂，费时、费力，或是敏感度不够，需要特殊仪 器设备等，不能快速获得结果，亟待需要一种快速、简单、准确的检测方法。 (三）
【发明内容】
[0003] 本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸的恒温 扩增检测试剂盒及其检测方法。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] 本发明提供一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下 组成：
[0006] (I) RNA提取试剂（优选德国QIAGEN RNA提取试剂盒（Qia-74104));
[0007] (2)恒温扩增反应液：包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩 增引物、IXThermol BufTer、MgS04、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶和无菌双蒸 水；其中：
[0008] 所述的外围引物分别为：
[0009] 外围正向引物：5，-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3，；
[0010] 外围反向引物：5' -TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3' ；
[0011] 所述两条探针的序列分别为：
[0012] 正向5'端Biotin标记探针：
[0013] 5' -Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3/ ；
[0014] 反向5'端Fitc标记探针：
[0015] 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3/ ；
[0016] 所述两条扩增交叉引物分别为：
[0017] 扩增正向引物：
[0018] 5，-AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3，；
[0019] 扩增反向引物：
[0020] 5; -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3;；
[0021] (3)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒；
[0022] ⑷阴性对照：无菌双蒸水。
[0023] 进一步，本发明所述的I XThermol buffer含有摩尔浓度为20mM的Tris-HCl、 IOmM 的KClUOmM 的（NH4) 2S04、2mM 的MgSO4 以及质量浓度为 0· 1% 的 Triton X-100，pH 8.8。
[0024] 进一步，本发明所述阳性对照为含有长189bp的扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因 序列，序列如下：
[0025] TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCA CGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATC TCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
[0026] 进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：
[0027] 以包含扩增区域的埃博拉糖蛋白基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩 增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒（Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩 增产物通过T-easy质粒转染试剂盒（Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分 光光度计对所抽提的质粒测A 28tl定量并稀释至10个拷贝/ μ 1，-20°C保存。
[0028] 进一步，本发明所述恒温扩增反应液组成为：两条外围引物各自lOpmol，两条探 针各自 20pmol，两条交叉引物各自 40pmol，IXThermol buffer，MgSO4 为 6mmol，dNTPs 溶 液各0. 4mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25 μ 1。
[0029] 本发明还提供一种所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒的应用，所述应 用为：
[0030] a)用试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中提取RNA ;
[0031] b)将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在 58°C下扩增反应35分钟；阳性对照PCR管中加入阳性模板，阴性对照PCR管中加入阴性模 板，所述阳性模板为含有扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的质粒，所述阴性模板为无 菌双蒸水；
[0032] c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术 公司3号装置）中进行检测，2分钟以后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时（即试纸条 T线为红色，C线为红色），说明样品中含有扎伊尔型埃博拉病毒核酸。所述核酸试纸条防 污染检测装置中试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序有样品垫、有色颗粒结合物垫和 吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有色颗粒 结合物垫上的有色颗粒有抗FitC抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗FitC抗 体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。
[0033] 在本发明提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。RNA 由逆转录酶逆转录成cDNA后，本试剂盒中的6条寡聚核苷酸序列依靠 Bst DNA聚合酶的高 活性的链置换特性，使得链置换DNA合成不断的自我扩增循环。在本发明提供的扎伊尔型 埃博拉病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒中，对不同的反应条件进行了优化，如引物和探针 的浓度，Mg 2+浓度，反应温度等的优化，并将本发明与核酸检测试纸条检测系统相结合，建立 了扎伊尔型埃博拉病毒核酸恒温扩增定性检测的方法。该试剂盒的灵敏度可在每个反应体 系中检出100个拷贝，可以满足快速检测扎伊尔型埃博拉病毒的要求。
[0034] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0035] (1)本发明所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒的特异性好，灵敏度高， 步骤简单，可重复性高；
[0036] (2)反应速度快，单个样本从样本处理到完成检测，仅需1小时左右；
[0037] (3)整个扩增和检测过程中不需要打开PCR管盖，减少了扩增产物污染的机会；整 个反应过程不需要复杂的仪器。 (四）
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1为核酸检测试纸条原理示意图。
[0039] 图2为本发明试剂盒用于检测扎伊尔型埃博拉病毒的特异性，1-5依次为西尼罗 热病毒；基孔肯雅热病毒；登革热病毒；阳性对照（1〇 2拷贝/反应）；空白对照。
[0040] 图3为本发明试剂盒用于检测扎伊尔型埃博拉病毒的灵敏度，1-5依次为IO4拷贝 /反应、IO 3拷贝/反应、IO2拷贝/反应、IO1拷贝/反应、空白对照。 (五）
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0042] 实施例1本发明试剂盒的组成与配制
[0043] a)RNA提取试剂：德国QIAGENRNA提取试剂盒（Qia-74104);
[0044] b)扎伊尔型埃博拉病毒核酸恒温PCR扩增反应液：两条外围引物（lOpmol)，两条 探针（20pmol)和两条交叉引物（40pmol)，IXThermol buffer，MgSO4 (6mmol), dNTPs 溶液 (各0.4mm〇l)，Bst DNA聚合酶（8U)，AMV逆转录酶（5U)和无菌双蒸水组成，总反应液体积 为 25 μ 1 ;
[0045] 外围正向引物：5，-TGGTTCAAGTGCACAGTCAA-3，
[0046] 外围反向引物：5' -TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3'
[0047] 正向5'端Biotin标记探针：
[0048] 5' -Biotin-GCAAGGGTTGTCAGATGCG-3，
[0049] 反向5'端Fitc标记探针：
[0050] 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAACTTGAC-3，
[0051] 扩增正向引物：
[0052] 5; -AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3 ;
[0053] 扩增反向引物：
[0054] 5; -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3 ;
[0055] 所述的 IXThermol buffer 含有摩尔浓度为 20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的 MgSO4 以及质量浓度为 0· 1% 的 Triton X-100, pH 8. 8。
[0056] 所有的引物和探针均由上海生工生物有限公司合成。
[0057] c)阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的DNA片段，所述DNA片段长 189bp，基因序列如下：
[0058] TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCA CGAGTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATC TCTGAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
[0059] 阳性对照按如下步骤制备：
[0060] 以包含扩增区域的埃博拉糖蛋白基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩 增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通 过T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提 的质粒测A 28tl定量并稀释至10个拷贝/ μ 1，-20°C保存。
[0061] d)阴性对照：无菌双蒸水。
[0062] 实施例2用本发明试剂盒检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸的具体方法
[0063] a)用扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中 提取RNA (疑似病例提取核酸需在生物安全3级实验室进行）作为标本RNA。
[0064] b)取标本RNA作为模板加入到装有扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增反应液的PCR管 中，其中标本RNA 5 μ 1，反应液20 μ 1，58 °C扩增反应35分钟；阳性和阴性对照PCR管中分 别加入阳性模板和阴性模板。
[0065] c)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术公 司3号装置）中进行检测，2分钟以后判读结果。当样本中含有扎伊尔型埃博拉病毒核酸 时，试纸条的检测线上呈阳性。
[0066] 反复重复实验3次，检测结果无显著性差异，说明本试剂盒的不同批次间的检测 结果具有可比性，具有良好的重复性。上述实施例说明，用本发明的试剂盒来检测重复性 好，且对样本的检测仅仅需要1个小时左右就能完成，大大缩短检测时间。
[0067] 实施例3用本发明试剂盒检测扎伊尔型埃博拉病毒的特异性
[0068] 按照实施例2的方法检测西尼罗病毒核酸RNA ;基孔肯雅热病毒RNA ;登革热病毒 核酸RNA ;埃博拉病毒检测试剂盒阳性对照品，其结果如图2。从图2测试结果可见，用本发 明试剂盒检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸具有很强的特异性。
[0069] 实施例4用本发明试剂盒检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸的灵敏度
[0070] 对扎伊尔型埃博拉病毒的质粒DNA进行定量，分别稀释至浓度为IO4拷贝/微升、 IO3拷贝/微升、IO2拷贝/微升、IO1拷贝/微升，采用实施例2中所述方法来确定本发明试 剂盒用于检测扎伊尔型埃博拉病毒核酸的灵敏度。结果如图3所示，图中1-4分别表示IO 4 拷贝/微升、IO3拷贝/微升、IO2拷贝/微升、10拷贝/微升，5是阴性对照，可以发现该试 剂盒可在每个反应体系中检出100个拷贝，具有很高的灵敏度，可以满足快速检测扎伊尔 型埃博拉病毒的要求。
【权利要求】
1. 一种扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组 成： (I)RNA提取试剂； ⑵恒温扩增反应液：包括正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引 物、IX Thermol Buffer, MgSO4, dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆转录酶和无菌双蒸水； 所述正向外围引物为# -TGGITCAAGTGCACAGTCAA-3'; 反向外围引物为-TGTCTGCTCTACGGTGATGT-3'; 所述两条探针的序列分别为： 正向 5' 端 Biotin 标记探针 5' -Biotin-GCAAGGGITGTCAGATGCG-3'; 反向 3 ' 端 FitC 标记探针 5' -Fitc-ATAATACACCCGTGTATAAAC TTGAC-3'； 所述两条扩增交叉引物分别为： 扩增正向引物： 5' -AGGGATTGGGGACTCGTGGAGGGAAGGAAAGCTGCAGTGT-3'； 扩增反向引物： 5' -CCAAACCAGGTCCGGACAACAGTCCAACTTGAGTTGCCTCAG-3'； (3) 阳性对照：含有扎伊尔型埃博拉病毒的糖蛋白DNA质粒； (4) 阴性对照：无菌双蒸水。
2. 如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述 IXThermol Buffer 含有摩尔浓度为 20mM 的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的（NH4)2S04、2mM 的MgSO4以及质量浓度为0? 1 %的Triton X-100, pH 8. 8。
3. 如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性 对照为含有长189bp的扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因序列，序列如下： TGGTTCAAGTGCACAGTCAAGGAAGGAAAGCTGCAGTGTCGCATCTGACAACCCTTGCCACAATCTCCACGA GTCCCCAATCCCTCACAACCAAACCAGGTCCGGACAACAGCACCCATAATACACCCGTGTATAAACTTGACATCTCT GAGGCAACTCAAGTTGGACAACATCACCGTAGAGCAGACA。
4. 如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述阳性 对照按如下步骤制备： 以包含扩增区域的埃博拉糖蛋白基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩增 获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩增产物通过 T-easy质粒转染试剂盒构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分光光度计对所抽提的质 粒测A 28tl定量并稀释至10个拷贝/yl，-20°C保存。
5. 如权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述恒温 扩增反应液组成为：两条外围引物各自lOpmol，两条探针各自20pmol，两条交叉引物各自 40pmol，I XThermol buffer，MgSO4 为 6mmol，dNTPs 溶液各 0? 4mmo1, Bst DNA 聚合酶 8U, AMV逆转录酶5U，无菌双蒸水组成补足至25 ill。
6. -种权利要求1所述扎伊尔型埃博拉病毒恒温扩增检测试剂盒的应用，其特征在于 所述应用为： a)用试剂盒中RNA提取液从待检测的标本中提取RNA ; b) 将步骤a)提取得到的RNA作为模板加入到装有恒温扩增反应液的PCR管中，在58°C 下扩增反应35分钟；阳性对照PCR管中加入标准阳性模板，阴性对照PCR管中加入标准阴 性模板，所述阳性对照模板为含有扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白基因片段的质粒，所述阴性 对照模板为无菌双蒸水； c) 将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置中进行检测，2分钟以后判读 结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含有扎伊尔型埃博拉病毒核酸。
【文档编号】C12Q1/70GK104313179SQ201410503330
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】徐昌平, 卢亦愚, 冯燕, 陈寅, 高见 申请人:浙江省疾病预防控制中心