专利名称：一种小鼠表皮总蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种小鼠表皮总蛋白的提取方法。
背景技术：
皮肤是机体面积最大的器官，与外界直接接触，能阻挡异物和病原体侵入，防止体 液丢失，具有重要的屏障保护作用。皮肤由表皮和真皮构成，借皮下组织与深层组织相连。 其中表皮暴露在机体表面，附着有灰尘、碎屑，并且表皮和真皮紧密相连、难于分离，给表皮 总蛋白的提取带来了困难。而小鼠的表皮更薄，只有2 3层细胞，所以小鼠表皮总蛋白的 提取更为困难。在以前的研究中，研究者通常采用小鼠全皮总蛋白进行实验分析。但真皮 与表皮的细胞构成和蛋白质表达谱明显不同，在研究表皮的基因差异表达时有可能产生干 扰。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种快速有效的小鼠表皮分离、总蛋白提取的 新方法，本方法简单、快速，分离的小鼠表皮量大、无真皮细胞组织搀杂，且提取的蛋白质 好、纯度高，可以满足许多分子生物学实验需要。本发明是通过以下技术方案实现的一种小鼠表皮总蛋白的提取方法，步骤如下(1)取已被处死的小鼠，对其皮肤剃毛(在不损伤表皮的情况下尽量剃干净)，并 用70 80%乙醇(体积分数)浸泡的棉球手术法擦拭干净；(2)将皮肤剪下，用两片载玻片夹住，放在加热台上，热击处理；(3)加热后，立即用眼科镊迅速地将表皮撕下，放入蛋白裂解液中；(4)超声处理，然后在室温下放置0. 5 2小时；(5)离心，≥18000g，4°C，0. 5 2小时，取上清；(6)再次离心，≥18000g, 4°C，0. 5 2小时，取上清，即得小鼠表皮总蛋白，将所得 上清液进行纯化或-80°C分装冻存。所述步骤(2)中热击处理的参数为60°C左右加热1 3分钟。所述步骤(4)中超生处理的参数为6秒 6秒，1 3分钟。在动物组织的总蛋白提取中，最重要的就是防止蛋白酶的降解作用，小鼠表皮的 角质层较薄，这使得小鼠表皮的蛋白质特别容易降解，另外表皮和真皮紧密相连，难于分 离，目前大多数的表皮分离方法一般需要几十分钟，甚至长达数小时，使得组织中的蛋白质 大量降解，使得许多分子生物学实验的不甚准确。本发明先用70 80%的乙醇擦拭小鼠皮 肤，由于乙醇对蛋白质有变性和固定作用，用乙醇擦拭皮肤，一方面可以将皮肤表皮的灰尘 和蛋白酶尽量擦净，另外可以将残余在皮肤表皮的蛋白酶变性。接下来将剪下的皮肤60°C 热击1 3分钟，再将表皮迅速分离，这样大大缩短了蛋白酶的降解时间，从而提高了蛋白 质的完整性。
本发明将热击法分离小鼠表皮和总蛋白提取方法结合起来，操作简单快速，经济 适用，分离的小鼠表皮量大、无真皮细胞组织搀杂，提取的总蛋白质量好、纯度高，可以满足 许多分子生物学实验比如，2-D电泳，Westenblot等的需要。
图1为部分表皮分离皮肤的HE染色示意图；图2为小鼠表皮总蛋白的13% SDS-PAGE (银染)示意图；图3为Western Blot检测β -actin的表达示意图；图4为表皮总蛋白的双向电泳检测示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1小鼠表皮的分离和皮肤的HE染色将小鼠处死，背部剃毛，用70 80 %乙醇浸泡的棉球手术法擦拭干净，将背部 4cm2的皮肤剪下，用两片载玻片夹住，放在加热台上，60°C加热1 3分钟，用眼科镊迅速的 将表皮揭开。将小鼠皮肤浸入4%的PFA中固定20小时以上，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡 包埋，9μπι切片，HE染色。结果如图1所示，其中，A为部分分离的小鼠皮肤组织全景图；B 为所分离后的组织，既有表皮又有毛囊；D为分离之后的真皮组织，可看到在真皮组织中没 有残留的表皮和毛囊；C为未分离部分的组织对照。结论利用本发明分离的小鼠表皮较为完整、连续，没有真皮组织的搀杂，而且可 以分离到皮肤中的完整的毛囊结构。实施例2提取表皮总蛋白将实施例分离的表皮放入蛋白裂解液(7Μ尿素；2Μ硫脲；4 % CHAPS ；65mM DTTO. 5%SDS;5mM乙酸镁)中，超声(6秒 6秒，2分钟)；室温放置1小时，离心，18000g， 4°C，1小时，取上清，再次离心，18000g，4°C，l小时，取上清。将样品进行纯化或_80°C分装 冻存。实施例3测定样品表皮总蛋白的浓度利用标准曲线法测定实施例2所得4个样品表皮总蛋白的浓度，表1是4个标准 品的浓度及吸光值，拟合曲线是y = 52. 83x-0. 5698，R2 = 0. 9985。表 1
标准品吸光值0.031 0.067 0.103 0.145-----------------
标准品浓度(mg/ml)13 5 7测定4个样品的吸光度，根据拟合曲线计算得到样品的浓度，结果见表2。表2
样品一样品二样品三样品四测量值一0.0940.1070.1160.114测量值二0.0920.0980.1140.107平均吸光值0.0930.1030.1150.111t浓度(mg/ml)4.6335.1545.8405.593结论通过表2可知，本方法所提取的总蛋白浓度比较大，也比较稳定。实施例4 SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳检测总蛋白将实施例2所得到的表皮总蛋白进行13%聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，结 果如图2所示，由图2可以看出，条带比较丰富，比较清晰，样品间的重复性也很好，可以佐 证本方法提取的总蛋白质量很好。结论说明本方法有很好的稳定性，并且提取的总蛋白质量很好。实施例5 Western Blot 检测 β -actin 的表达取实施例2所得到的表皮总蛋白20 μ g，加入等体积loading buffer,在沸水中煮 5分钟后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕后，利用半干电转仪(BIO-RAD)将蛋白转到PVDF膜 上。加封闭液(PBST溶液+5%脱脂奶粉)，37°C封闭1 2小时。加入按要求稀释的一抗， 37°C，1 2小时或4°C过夜。PBST洗膜，5分钟X3次。加入二抗室温1小时。PBST洗膜， 10分钟X3次。加入ECL系统，显色1分钟，压片、洗膜，观察结果(如图3)，条带清楚、干 净、无杂带。结论说明所提的总蛋白可以满足Western Blot的需要。实施例6双向电泳检测表皮总蛋白取50yg样品加入上样缓冲液至450ul，采用24cm非线性PH3 7的胶条，胶内 溶胀上样，进行等电聚焦(30V电压水化12小时或以上；200V, 1小时；500V, 1小时；1000V, 1小时；1000V 8000V，线性升高1小时；8000V，聚焦至64，OOOVh)。将胶条进行两步平衡 (20mM DTT和IOOmM碘乙酰胺)。进行12. 5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳(稳流15mA/胶30 分钟，然后40mA/胶至结束)。电泳结束进行固定，考马斯G250染色。进行图像扫描，结果 见图4。结论说明所提的总蛋白可以满足双向电泳的需要。
权利要求
1.一种小鼠表皮总蛋白的提取方法，其特征在于，步骤如下(1)取已被处死的小鼠，对其皮肤剃毛，并用70 80%乙醇浸泡的棉球手术法擦拭干净；(2)将皮肤剪下，放在加热台上，热击处理；(3)加热后，立即将表皮撕下，放入蛋白裂解液中；(4)超声处理，然后在室温下放置0.5 2小时；(5)离心，≥18000g，4°C，0.5 2小时，取上清；(6)再次离心，≥18000g，4°C，0.5 2小时，取上清，即得小鼠表皮总蛋白，将所得上清 液进行纯化或-80°C分装冻存。
2.根据权利要求1所述小鼠表皮总蛋白提取方法，其特征在于所述步骤(2)中热击 处理的参数为60°C加热，1 3分钟。
3.根据权利要求1所述小鼠表皮总蛋白提取方法，其特征在于所述步骤(3)中，蛋白 裂解液的组成为7M尿素；2M硫脲；4% CHAPS ；65mM DTT ；0. 5% SDS ；5mM乙酸镁。
4.根据权利要求1所述的一种小鼠表皮总蛋白的提取方法，其特征在于所述步骤(4) 中超声处理的参数为6秒 6秒，1 3分钟。
全文摘要
本发明公开了一种小鼠表皮总蛋白的提取方法，步骤如下(1)取已被处死的小鼠，对其皮肤剃毛，并用70～80％乙醇浸泡的棉球手术法擦拭干净；(2)将皮肤剪下，用两片载玻片夹住，放在加热台上，热击处理；(3)加热后，立即用眼科镊迅速地将表皮撕下，放入蛋白裂解液中；(4)超声处理，然后在室温下放置0.5～2小时；(5)离心，取上清；(6)再次离心，取上清，即得小鼠表皮总蛋白，将所得上清液进行纯化或-80℃分装冻存。本发明将热击法分离小鼠表皮和总蛋白提取方法结合起来，操作简单快速，经济适用，分离的小鼠表皮量大、无真皮细胞组织搀杂，提取的总蛋白质量好、纯度高，可以满足许多分子生物学实验的需要。
文档编号C07K1/14GK102146119SQ20111000901
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者刘晓燕, 孔北华, 杨其峰, 杨宁, 苑存忠, 闫实 申请人:山东大学齐鲁医院