一种植物DNA的简便、快速提取方法与流程

本发明公布了一种植物dna的简便、快速提取方法，属于分子生物学领域。本发明极大地简化了植物dna提取方法，该方法简便、快速、稳定性好，可广泛应用于提取分子鉴定所需的各种植物叶片dna。
背景技术：
：随着水稻、玉米、小麦等主要农作物全基因组测序的完成，这些经济作物的分子标记开发难度明显下降，利用分子标记进行辅助育种、品种鉴定开始被应用到实际生产之中。但分子鉴定和表观鉴定不同，必须通过dna提取和鉴定等一系列程序，故而进行大样本筛选时，工作量极大，急需适应高通量筛选要求的方法体系，而这其中最需要优化的就是dna的提取过程。现有dna提取方法十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法(doyleetal.arapiddnaisolationprocedureforsmallquantitiesoffrexhleaftissue.phytochembull.1987,19:11-15.)，需经过研磨、裂解、氯仿抽提、离心、沉淀和清洗等步骤，整个流程需要两小时，可同时操作二十个样品，平均耗时约六分钟，需要用去污剂ctab、有毒有害的有机溶剂氯仿及大量的乙醇，其间需将样品转管三次，提取效率低，而且对操作的专业程度、细心程度要求较高，不适合高通量操作；现在应用于高通量dna提取的dna提取工作站(余婧等.自动化工作站批量提取烤后烟叶dna方法的建立与应用.贵州农业科学.2015,5:217-219.)，虽然简单便捷，但是需要昂贵的设备、专用试剂，对实验人员的操作要求也比较高；而直接pcr法(rogersetal.directpcramplificationfromleafdiscs.plantsci.1999,143:183-186.)虽然可以省去dna提取的步骤，但是材料用量对实验结果有显著影响，稳定性难以保证，需要使用扩增效果更好也更加昂贵的酶以及pcr增强试剂，而且每次取样仅能用于一次pcr扩增。所以急需开发一种操作简单方便，稳定性好，不需要特殊设备仪器，也不需使用有毒有害或者昂贵试剂，可大批量同时处理的新dna提取方法。本发明公布了一种植物dna的简便提取方法，使用三羟甲基氨基甲烷(tris)为dna样品提供良好的缓冲条件，保证dna的稳定性；使用乙二胺四乙酸(edta)抑制dna酶活性，防止细胞破碎后细胞中的dna酶对dna进行降解；高温加热，不仅能裂解植物细胞，释放dna，还能灭活植物细胞释放的各种酶类和附着在植物样品上的微生物；高速离心能够去除非水溶性的细胞碎片等杂质。由于提取物中所添加的较高浓度的edta会抑制taqdna聚合酶的活性，所以在后续的pcr过程中需要增加相应浓度的镁离子，以中和过多的edta，保证pcr正常进行。操作周期约20分钟，批量处理时可达到每人每分钟处理一个样品。只需要edta和tris，后续扩增只需要使用普通的taqdna聚合酶。提取每一个样品，试剂成本不到0.01元人民币，而且一次提取可用于多次pcr扩增。其间不需要转管等操作，减少了人为失误。不需要特殊的仪器设备，没有太多的操作要求，这将极大的节约人力和材料成本。本发明在遗传作图、分子标记辅助育种、品种纯度检测、品种的真实性鉴定等领域具有重要的应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于公布一种植物叶片基因组dna提取方法，所述的dna提取方法可满足分子标记筛选的dna模板需要，且省时、操作容易、设备要求低、成本低、安全无毒无污染。技术方案：一种植物dna的简便、快速提取方法，按照下述步骤进行：(1)剪取1～2cm2植物叶片置于离心管中，用研磨棒快速研磨得到匀浆；(2)向所述植物匀浆中加入提取液，70～90℃加热10～15分钟，再经过10000～13000r/min离心1分钟，即得到可直接用于pcr的dna提取物。所述提取液由tris溶液和edta溶液组成，其中tris和edta的含量分别为20～50mm和13～25mm，ph8.0。所述tris溶液配制方法如下：0.5mtris-hcl(200ml)：称取60.55gtris，溶于100ml蒸馏水中，再用浓盐酸调至ph8.0，定容至200ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。低温(4℃)储存。所述edta溶液配制方法如下：(2)0.5medta(200ml)：称取29.2gedta溶于100ml蒸馏水中，再用10mnaoh调至ph8.0，定容至200ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。低温(4℃)储存。所述提取液配制方法如下：提取液(100ml)：10ml0.5mtris(ph8.0)，5ml0.5medta(ph8.0)，定容至100ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)；低温(4℃)储存。优选的，如上所述的植物叶片基因组dna提取方法，所述提取液的体积为所述植物匀浆体积的10～20倍。优选的，如上所述的植物叶片基因组dna提取方法，所述提取液中tris的浓度为25～50mm，edta的浓度为13～25mm；优选的，如上所述的植物叶片基因组dna提取方法，所述加热温度为70～90℃，加热时间为10～15分钟；优选的，如上所述的植物叶片基因组dna提取方法，所述离心转速为10000～13000r/min离心时间1分钟；本发明中离心的速度经过优选，所需时间更短，dna模板质量相同。若离心速度过小，则不利于杂质的沉淀；优选的，如上所述的植物叶片基因组dna提取方法，在作为dna模板进行pcr的时候，补加的镁离子的量为25～30mm。当遇到如田间取样等不能及时对样品进行处理的情况时，可现在1.5ml的离心管中加入200μl的提取液，采样时将叶片一端插入提取液中避光储存，使用时再研磨加热离心即可，条件不变。有益效果：(1)简便、快速、成本低、稳定性高、安全无污染。本发明提取dna时仅需edta和tris两种常用试剂，价格也相对低廉，易保存，且不需要使用氯仿等有机试剂，安全性高。利用高温加热使蛋白质变性，同时可以起到灭菌的效果。本发明提出的方法操作简便、快速，不需要转管等操作，减少了人为失误，也不需要特殊的仪器设备，这将极大地节约人力、成本。所获的dna提取物稳定性高，在低温下(如4℃)存放五个月仍能正常使用。(2)能够实现高通量操作。鉴于本发明公布的dna提取方法具有简便、快速、低成本、高稳定性的优点，在遗传作图、分子标记辅助育种、品种纯度检测、品种的真实性鉴定等领域可实现高通量操作。(3)适用性广本发明适用于小麦、大麦、玉米、番茄和水稻等经济作物，以及拟南芥等模式植物，其中有单子叶，也有双子叶植物，其他植物虽然没有一一进行试验验证，但是已经可以说明本发明也可以运用于许多植物dna的提取。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：小麦dna的pcr产物电泳检测图。m：dnamarkerdl2000，1～3泳道：提取完成后立即进行pcr的产物，4～6泳道：提取完成后置于4℃条件下储存五个月后再以相同条件进行pcr的产物。图2：簇毛麦、水稻、拟南芥、油菜、番茄和玉米dna的pcr产物电泳检测图。m：dnamarkerdl2000，1～5泳道：簇毛麦pcr产物，6～10泳道：水稻pcr产物，11～15泳道：拟南芥pcr产物，16～20泳道：油菜pcr产物，21～25泳道：番茄pcr产物，26～30泳道：玉米pcr产物。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例11、dna提取液的配制(1)0.5mtris-hcl(200ml)：称取60.55gtris，溶于100ml蒸馏水中，再用浓盐酸调至ph8.0，定容至200ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。低温(4℃)储存。(2)0.5medta(200ml)：称取29.2gedta溶于100ml蒸馏水中，再用10mnaoh调至ph8.0，定容至200ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。低温(4℃)储存。(3)提取液(100ml)：10ml0.5mtris(ph8.0)，5ml0.5medta(ph8.0)，定容至100ml，高温蒸汽灭菌(121℃，20分钟)。低温(4℃)储存。2、dna的提取(1)取小麦新鲜叶片约1～2cm2于灭过菌的1.5ml离心管中，用研磨棒研磨成匀浆状。加入200μl提取液，混匀。90℃加热15分钟。室温下13000r/min离心1分钟，上清液即用作pcr中dna模板使用，于低温(4℃)条件下储存。3、pcr扩增pcr反应体系：1×pcr缓冲液(无mg2+)，2.7mmmgcl2，0.2mmdntp，2μm引物，1utaqdna聚合酶(5u/μl)，1μldna提取物。其中，所用引物p1～p2见表1。pcr反应程序：①94℃3min；②94℃20s；③60℃30s；④72℃40s；⑤重复②③④进行35个循环；⑥72℃5min；⑦4℃保存。表1引物信息(f：正向引物；r：反向引物)引物名称引物序列(5’→3’)dna模板来源p1f:gccattatagtcaagagtgcactagctgt小麦p2r:agctcctctcgttctccaatgctp3f:gtgttcaagggaaaggctgcact簇毛麦，水稻p4r:acttcagtaggtgacagagcaaagagp5f:gtgttcaagggaaaggctgcact玉米p6r:ggattcagcaggcccaagactp7f:ggttccaaagacagctccgagt拟南芥p8r:tgtgacaggaaccacaaaatagtcap9f:ggtccccaggacagctctgagt油菜p10r:agacaggaaccacaatacggtcap11f:gtatggggaccagagattcttctga番茄p12r:gtgacaggaacagtaaaccgatca4、电泳检测采用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)，硝酸银染色，观察。结果表明，使用本发明提取的dna为模板，pcr产物条带清晰，反应可重复性高，低温长期储存稳定性高(见图1)。5、簇毛麦、水稻、拟南芥、油菜、番茄、玉米dna提取与pcr检测分别取簇毛麦、水稻、拟南芥、油菜、番茄、玉米的新鲜叶片约1cm2于灭过菌的1.5ml离心管中，用研磨棒研磨成匀浆状。加入200μl提取液，混匀。70～90℃加热15分钟。室温下13000r/min离心1分钟，上清液即用作pcr中dna模板使用。同上一步骤描述进行pcr检验。其中，所用引物p3～p12见表1。pcr反应产物采用6％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，结果如图2所示。簇毛麦、水稻pcr产物片段约1500bp，拟南芥pcr产物片段约490bp，油菜pcr产物片段约480bp、490bp，番茄pcr产物片段约700bp，玉米pcr产物片段约350bp、850bp，条带都很清晰，反应的可重复性高。由此可见，本发明公布的方法可广泛应用于簇毛麦、水稻、拟南芥、油菜、番茄、玉米等植物等dna的提取及分子鉴定。综上所述，本方法具有样品用量少、简便、快速，对设备要求低，稳定性好，应用范围广等优点，可应用于大规模品种鉴定，分子标记辅助育种，遗传分析等领域。当前第1页12