本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用。
背景技术：
手性d-芳香丙氨酸广泛应用于医药、农药和食品工业领域，如d-苯丙氨酸被用作生产治疗2型糖尿病药物“那格列奈”、β-内酰胺抗生素及新型抗肿瘤药物的前体。生产d-芳香丙氨酸的方法有发酵、化学合成、酶催化等方法。由于d-芳香丙氨酸代谢过程复杂，采用工程菌发酵的产量太低，达不到工业化生产的要求，因此目前工业生产d-芳香丙氨酸最主要的方法是化学合成，但是由于合成的立体选择性低，合成的产物是对消旋体，为获得高纯度的d-芳香丙氨酸，需要昂贵的手性拆分试剂，而且合成的原料都具有剧毒，生产过程复杂，导致d-芳香丙氨酸的价格昂贵。酶催化法是一种最具前景的生产方法，因为酶具有反应条件温和，立体选择性高，反应副产物少，环境友好等优点。具有催化合成d-芳香丙氨酸的酶有转氨酶、d-氨基酸氧化酶、酰胺酶、海因酶等，然而目前接近工业化生产的是采用海因酶和氨甲酰水解酶两种酶连续催化。该方法中，以dl-5替代海英作为原料，在海因酶的作用下，dl-5替代海英生成n-氨基甲酰-d-苯丙氨酸，然后在氨甲酰水解酶的作用下，水解生成d-苯丙氨酸(d-phe)。这种方法是两种酶参与的合成过程，其中由于氨甲酰水解酶的活性、稳定性较海因酶低，在生产过程中氨甲酰水解酶是限制性因素，导致产率低。而且该方法的原料价格昂贵，dl-5替代海英是通过l-5-替代海英经过消旋酶消旋获得，而海因消旋酶不稳定，活性低，消旋产率低，导致原料价格昂贵。为降低d-芳香丙氨酸的生产成本，需改进现有的生产方法。
由于苯丙氨酸脱氨酶在碱性条件下具有立体选择性，能一步催化3-芳香基丙烯酸加氨合成d-芳香丙氨酸，而且原料3-芳香基丙烯酸是一种工业原料，容易生产，价格低廉，以其作为苯丙氨酸脱氨酶的底物生产手性d-芳香丙氨酸，能大幅度降低生产成本。但苯丙氨酸脱氨酶的立体选择性不高，产物是l，d-型芳香丙氨酸的混合物，工业生产中，副产物l-型的产物难以分离，导致产物d-芳香基丙氨酸光学纯度不高，为此需要改善苯丙氨酸脱氨酶的活性，降低l-芳香丙氨酸的生成能力。
近年来，基因工程技术广泛应用于改造酶的立体选择性，并取得非常好的效果，但是该技术在成功改善苯丙氨酸脱氨酶立体选择性的应用未见文献报道。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体，使其应用于合成d-芳香丙氨酸的方法，提高底物转化率和产物d-芳香丙氨酸的光学纯度，满足工业化生产的要求。
本发明的技术方案为：一种高立体选择性的新型苯丙氨酸脱氨酶突变体，该突变体是原核生物anabaenavariabilis的苯丙氨酸脱氨酶的氨基酸序列通过定点突变而产生的，即第311位的谷氨酰胺突变为谷氨酸，第448位的谷氨酸突变为苏氨酸，该突变体可特异选择性催化合成d-芳香丙氨酸，所述突变体的蛋白氨基酸序列如seqidno.1所示。
本发明还提供了一种编码该突变体的dna分子，所述dna分子核苷酸序列如seqidno.2所示。
进一步地，所述dna分子以来源于原核生物anabaenavariabilis的苯丙氨酸脱氨酶的基因作为模板，通过pcr定向突变得到。
进一步地，pcr定向突变采用的如seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7所示的双引物对。
本发明还提供了一种含有编码该突变体的dna分子的重组表达质粒。
本发明还提供了一种含有上述重组表达质粒的宿主细胞。
明显地，上述所述突变体或编码该突变体的dna分子或含有编码该突变体的dna分子的重组表达质粒或含有上述重组表达质粒的宿主细胞均可用于d-芳香丙氨酸合成。
该突变体能在60℃保存24h，前12h活力为90％，24h活力为50％。
本发明所述的具有生物活性的苯丙氨酸脱氨酶突变体可以通过iptg诱导的方式大量产生获得，通过亲和层析方法，对该突变体蛋白进行分离纯化，得到了高活性的突变体蛋白。结果表明，突变体酶的立体选择性发生了改变，能以3-苯基丙烯酸为底物，催化合成d-苯基丙氨酸，副产物l-苯丙氨酸的生成量与天然酶催化的相比下降了90％，仅仅为5.9％。
本发明的有益技术效果是：
在本发明通过定点突变技术对来源于原核生物anabaenavariabilis的天然苯丙氨酸脱氨酶的氨基酸序列进行改造，将天然的苯丙氨酸脱氨酶氨基酸序列第311位谷氨酰胺(gln)和448位谷氨酸(glu)分别突变为谷氨酸(glu)和苏氨酸(thr)，获得苯丙氨酸脱氨酶突变体，提高了其催化立体选择性，并且使副产物l-苯丙氨酸形成能力显著降低。本发明获得的突变体同时具有活力高、热稳定性高等优良性能，为其在手性d-芳香丙氨酸合成中的大规模、低成本的工业应用奠定基础。目前，这是对源于原核生物anabaenavariabilis的苯丙氨酸脱氨酶进行立体选择性成功改造的首次研究报道。
附图说明
图1手性苯丙氨酸的hplc检测分析：a，d-phe和l-phe标准样品的hplc图，d-phe的出峰时间是6.4min，l-phe的出峰时间是8min；b，野生型未突变的酶合成的产物；c，突变体酶催化合成的产物；
图2突变体的热稳定性：在60℃保存24h，前12h活力为90％，24h活力为50％。
图3突变酶5l反应釜催化合成产物：突变酶催化反应24h以后d-phe的含量达到91％以上，与野生酶相比，l-phe含量从5.6mm降到0.61mm。
具体实施方式
实施例1
(1)以来源于原核生物anabaenavariabilis的苯丙氨酸脱氨酶的基因作为模板，设计2对寡聚核苷酸引物，以未突变的重组质粒pet-28-pal为模板，通过pcr的方法扩增，获得突变质粒pet-28-pal/gln311glu/glu448thr。
(2)2对寡聚核苷酸引物序列如下：
(3)pcr的扩增反应体系为：
(4)pcr的扩增条件为：94℃预变性1min，94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸7min，25个循环。
(5)对pcr扩增产物采用dna纯化试剂盒进行纯化回收。
实施例2
(1)对经过dna纯化试剂盒纯化的pcr产物采用dpni限制性内切酶进行酶切消化，于37℃消化1h。消化反应体系如下：
(2)消化后的产物采用dna纯化试剂盒进行纯化回收。
实施例3
(1)取经过dpni限制性内切酶进行酶切消化、纯化后的pcr产物，于42℃热击60s转化至大肠杆菌e.colijm109感受态细胞，涂布于含kan抗性(10mg/l)的固体lb平板上，37℃培养8h。挑取单菌落，接入含有50mg/lkan的lb液体培养基培养，提取质粒，进行酶切和pcr验证。选择阳性克隆质粒送至上海生工测序。测序正确的质粒进行42℃热击60s后转化至大肠杆菌e.colibl21感受态细胞，在含kan(10mg/l)抗性的lb平板37℃培养8h，挑选阳性转化子，即为苯丙氨酸脱氨酶突变体产生菌。
实施例4
(1)将苯丙氨酸脱氨酶突变体产生菌接入lb液体培养基中37℃培养8h，获得种子液。将种子液转接至新鲜的lb培养基中37℃培养至od600达0.6时，添加终浓度0.5mm的iptg(异丙基硫代-β-d-半乳糖苷)26℃诱导表达12h后离心收集菌体，从而获得大量的游离细胞中含有苯丙氨酸脱氨酶突变体，并进行sds-page检测和酶活性测定。
(2)采用超声破碎方法对游离细胞进行破碎(功率250w，超声1s，间歇3s，共15min)后冷冻离心，收集上层清液，制备获得无细胞抽提液，将获得的无细胞抽提液采用his-traptm/ff亲和层析柱进行分离纯化，采用含咪唑的洗脱液(20mmol/l磷酸钠+0.5mol/lnacl+250mmol/l咪唑，ph8.0)，进行梯度洗脱，收集活性部分，采用sds-page检测酶蛋白纯度。
(3)测定纯蛋白的酶活性，酶活定义是40℃下每分钟生成1mm的苯丙氨酸需要的酶量为一个酶单位(u)。
(4)将上述制备的突变体蛋白在60℃下保持1-12h后，测定酶的活力，从而检测其热稳定性，结果发现在60℃下保持12h后未见酶活力降低，表明其热稳定性非常好，适用于工业化生产(图2)。
实施例5
(1)将上述获得的突变体蛋白溶液中添加100umol的3-苯基丙烯酸，在30℃的条件下转化合成d-苯丙氨酸，利用hplc监测反应进程，结果表明，3-苯基丙烯酸在12h以后转化率达到90％以上，hplc检测反应液中的l-苯丙氨酸含量，突变体酶催化与野生型的酶催化相比，l-苯丙氨酸含量下降了90％，含量仅仅为5.9％(图1c)。
实施例6
(1)为实现工业化应用，在制备级规模水平进行转化生产d-苯丙氨酸。取上述获得的突变酶和野生酶各100mg置于5l的反应釜中，分别添加10mmol的3-苯基丙烯酸，在30℃的条件下转化合成d-苯丙氨酸，利用hplc监测反应进程。结果表明，突变酶催化3-苯基丙烯酸在24h以后d-苯丙氨酸的含量达到91％以上，与野生酶相比，l-苯丙氨酸含量从5.6mm降到0.61mm，含量下降了90％(图3)，合成了纯度较高的手性d-苯丙氨酸。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
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<120>一种高立体选择性苯丙氨酸脱氨酶突变体及其应用
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