本发明涉及一种苯丙氨酸解氨酶突变体及其在合成(s)-2-氯-苯丙氨酸中的应用，属于酶工程和微生物工程。
背景技术：
1、l-苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，常用作营养强化剂、氨基酸输液和复合氨基酸制剂的成分，在食品行业中可作为添加剂阿斯巴甜的合成原料，在医药行业中则可以用来合成左旋多巴(l-dopa)和肾上腺素等药物。对映异构体富集的苯丙氨酸化合物是上述药物制品的重要中间体，其中，(s)-2-氯-苯丙氨酸是治疗高血压(hypertension)的血管紧张素i转化酶抑制剂(ace)的主要生产原料。
2、wo2006/069799a1公开了一种制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，在其中一个实施例中，使用源自rhodotorula glutinis的苯丙氨酸解氨酶将2-cl-肉桂酸于氨水中进行反应，以制备(s)-2-氯-苯丙氨酸。该工艺的缺点是发生强烈的底物和产物抑制，因此需要在低浓度下进行。如有大规模制备产物的需求，则需要更大的体积或更复杂的补料方案，从工业生产的角度来看该工艺缺乏竞争力。
3、cn101517089a公开了一种制备苯丙氨酸类化合物的改进工艺，所使用的苯丙氨酸解氨酶源自idiomarina loihiensis，用以催化相应的肉桂酸类化合物与氨基供体进行反应，该方法使底物抑制得到了有效降低，且与来源于r.glutinis的苯丙氨酸解氨酶相比具有更高的活性。然而在实际生产过程中，来源于i.loihiensis的苯丙氨酸解氨酶催化活性仍较低，无法达到工业生产的要求。
4、cn106755160a公开了一种制备苯丙氨酸类化合物的改进工艺，所使用的组氨酸解氨酶源自pseudoalteromonas sp.p1-26，用于生产l-苯丙氨酸化合物，该方法与上述工艺相比，能够降低生产成本，提高生产效率。使用该方法进行生产，虽然产率与前述两种方法比较有了一定的提升，但筛选得到的组氨酸解氨酶对于底物的选择有限，在生产中所需的酶量也过高，不利于大规模推广。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本发明提供了一种催化活性升高，底物和产物抑制降低且底物谱较广的苯丙氨酸解氨酶突变体，该突变体将出发氨基酸第240位组氨酸突变为苯丙氨酸，或将第80位亮氨酸突变为缬氨酸，相对野生型苯丙氨酸解氨酶，对底物的转化率分别达到61.2％、92％，而野生型苯丙氨酸解氨酶的底物转化率仅有33.4％，因此本发明的苯丙氨酸解氨酶突变体在催化过程中表现良好，具有工业应用价值。
2、本发明的第一个目的是提供一种苯丙氨酸解氨酶突变体，所述苯丙氨酸解氨酶突变体是通过将如seq id no.1所示苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列的第240位组氨酸突变为苯丙氨酸得到，或第80位亮氨酸突变为缬氨酸得到。
3、本发明的第二个目的是提供一种编码所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
4、本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组质粒。
5、进一步地，所述重组质粒的载体为pet-28a(+)质粒、pet-28b(+)质粒或pet-20b(+)质粒。
6、本发明的第四个目的是提供一种携带所述基因或所述重组质粒的宿主细胞。
7、进一步地，所述宿主细胞为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
8、本发明的第五个目的是提供所述苯丙氨酸解氨酶突变体的制备方法，所述方法包括以下步骤：将上述重组细胞接种至发酵培养基中进行发酵，获得发酵液；将发酵液进行离心，收集菌体；将菌体进行破碎后离心，获得细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行提取，获得所述苯丙氨酸解氨酶突变体。
9、本发明的第六个目的是提供一种(s)-2-氯-苯丙氨酸的制备方法，包括采用所述苯丙氨酸解氨酶突变体或含有该突变体的表达系统进行催化转化的步骤。
10、进一步地，所述反应体系在氨水中进行。
11、进一步地，所述反应的温度为30～40℃，ph值为9.0～10.5。
12、本发明的有益效果：
13、本发明在来自微生物idiomarina abyssalis的苯丙氨酸解氨酶基础上，通过定点突变技术改造苯丙氨酸解氨酶分子结构最终获得了催化活性升高，催化底物范围增加的苯丙氨酸解氨酶突变体。与其他制备(s)-2-氯-苯丙氨酸的生物催化剂相比，本发明提供的苯丙氨酸解氨酶突变体能够催化高浓度底物，拥有更高的催化活性和更广的底物范围，且大幅度降低底物和产物抑制作用，因此在生产制备(s)-2-氯-苯丙氨酸中有极高的应用前景。
1.一种苯丙氨酸解氨酶突变体，其特征在于：所述苯丙氨酸解氨酶突变体通过将如seqid no.1所示出发氨基酸序列第240位组氨酸突变为苯丙氨酸，或第80位亮氨酸突变为缬氨酸得到。
2.一种编码权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：核苷酸序列如seq id no.3或seq id no.4所示。
4.一种包含权利要求2或3所述基因的重组表达载体。
5.一种包含权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞的类型为细菌、真菌、植物细胞或动物细胞。
7.权利要求1所述苯丙氨酸解氨酶突变体、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组表达载体或权利要求5所述的宿主细胞在合成(s)-2-氯-苯丙氨酸中的应用。
8.一种合成(s)-2-氯-苯丙氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶突变体或含有该突变体的表达系统添加至含有底物的反应体系中进行反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：反应温度为30～40℃，反应ph值为9.0～10.5。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述底物包括反式肉桂酸、2-cl-肉桂酸、3-cl-肉桂酸、4-cl-肉桂酸、2-no2-肉桂酸、3-no2-肉桂酸、4-no2-肉桂酸、2-br-肉桂酸、3-br-肉桂酸、4-br-肉桂酸、2-cf3-肉桂酸、3-cf3-肉桂酸、4-cf3-肉桂酸、2,4-2-cl-肉桂酸和2,5-2-cl-肉桂酸中的一种或几种。