苯丙氨酸脱氢酶突变体及其在l
‑
高苯丙氨酸合成中的应用
技术领域
1.本发明涉及苯丙氨酸脱氢酶突变体及其在l
‑
高苯丙氨酸合成中的应用，属于酶工程和微生物工程技术领域。
背景技术：
2.l
‑
高苯丙氨酸，又名(s)
‑2‑
氨基
‑4‑
苯基丁酸，是一种非天然的手性氨基酸，其结构比常见的l
‑
苯丙氨酸多一个亚甲基(图1)。
3.光学纯l
‑
高苯丙氨酸是制备血管紧张素转换酶抑制剂药物的重要原料，同时是当下世界上大约20种抗高血压药物的共同结构砌块。一方面，它可以直接用于制造benazepril(贝那普利)、enalapril(依那普利)、cilazapril(西拉普利)、lisinopril(赖诺普利)等；另一方面，还可通过制成双肽化合物的方式来生产抗高血压药物，如quinapril(喹那普利)、delapril(地拉普利)等(图1)。这类药物可以用于治疗或缓解不同程度的高血压，对于心力衰竭，心肌梗塞，左心功能不全，肾脏疾病和糖尿病的患者也适用。此外，该类药物对于保护高血压的靶器官同时具有较好作用。因此，l
‑
高苯丙氨酸的高效绿色合成具有极大的实际应用价值。
4.当与辅因子循环系统，如葡萄糖脱氢酶配对时，苯丙氨酸脱氢酶只需消耗廉价的无机氨供体即可一步催化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸生成l
‑
高苯丙氨酸，其副产物仅为水，十分绿色，且其产物的光学纯度(ee值)可达99％，因此，苯丙氨酸脱氢酶催化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的不对成还原胺化反应是目前最具潜力的生产l
‑
高苯丙氨酸的方法(图2)。
5.但是，上述通过苯丙氨酸脱氢酶结合辅因子循环系统合成l
‑
高苯丙氨酸的方法仍存在许多问题，其中，最主要的两个问题是野生型苯丙氨酸脱氢酶对底物2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的催化效率及底物载量低，这大大影响了上述方法的应用前景。现有的技术中，bradshaw等人以来源于红球菌属(rhodococcus sp.m4)的苯丙氨酸脱氢酶作为生物催化剂不对称还原胺化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸生产l
‑
高苯丙氨酸，其产物的光学纯度(ee值)可达到99％，但在60mmol/l底物浓度下的转化率仅为63％。ahmad等人通过对来源于红球菌属(rhodococcus sp.m4)的苯丙氨酸脱氢酶进行细胞固定化，增强了酶的热稳定性，但在67mmol/l底物浓度下最终也仅实现了80％的转化率。当前，由于催化效率低，野生型苯丙氨酸脱氢酶催化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸制备l
‑
高苯丙氨酸的单批次底物浓度未超过100mmol/l，低底物负载量难以满足工业化生产的要求。
6.因此，亟需获得对2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的催化效率更高的苯丙氨酸脱氢酶以解决现有l
‑
高苯丙氨酸生产方法中存在的缺陷。此外，目前尚未有利用蛋白质工程提高苯丙氨酸脱氢酶制备l
‑
高苯丙氨酸催化效率的相关报道。
技术实现要素：
7.为解决上述技术问题，本发明提供了一种苯丙氨酸脱氢酶突变体(苯丙氨酸脱氢酶，phedh)，所述苯丙氨酸脱氢酶突变体是通过将出发氨基酸序列如seq id no.1所示的苯
丙氨酸脱氢酶的第306位、第309位、第144位、第50位的氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。
8.在本发明的一种实施方式中，所述突变体为以下(a)～(g)任一：
9.(a)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第306位的亮氨酸突变为缬氨酸得到的，突变体命名为l306v；
10.(b)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第309位的缬氨酸突变为丙氨酸得到的，突变体命名为v309a；
11.(c)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第309位的缬氨酸突变为甘氨酸得到的，突变体命名为v309g；
12.(d)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第309位的缬氨酸突变为甘氨酸，同时将50位的亮氨酸突变为缬氨酸得到的，突变体命名为v309g/l50v；
13.(e)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第309位的缬氨酸突变为甘氨酸，同时将306位的亮氨酸突变为缬氨酸得到的，突变体命名为v309g/l306v；
14.(f)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第309位的缬氨酸突变为甘氨酸，同时将306位的亮氨酸突变为缬氨酸，同时将144位的缬氨酸突变为丙氨酸得到的，突变体命名为v309g/l306v/v144a；
15.(g)将氨基酸序列如seq id no.1所示的苯丙氨酸脱氢酶的第309位的缬氨酸突变为甘氨酸，同时将306位的亮氨酸突变为缬氨酸，同时将144位的缬氨酸突变为甘氨酸得到的，突变体命名为v309g/l306v/v144g。
16.本发明还提供了编码上述苯丙氨酸脱氢酶突变体的基因。
17.本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。
18.在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pet质粒为表达载体。
19.在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pet28a(+)质粒为表达载体。
20.本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的微生物细胞。
21.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。
22.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌e.coli bl21(de3)。
23.本发明还提供了上述苯丙氨酸脱氢酶突变体或上述基因或上述重组质粒或上述微生物细胞在制备l
‑
高苯丙氨酸中的应用。
24.本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了上述苯丙氨酸脱氢酶突变体。
25.在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以e.coli bl21(de3)为宿主，以pet28a(+)质粒为表达载体。
26.本发明还提供了一种生产l
‑
高苯丙氨酸的方法，所述方法为以2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸为底物，将上述苯丙氨酸脱氢酶突变体或上述重组大肠杆菌加入反应体系中进行反应，得到l
‑
高苯丙氨酸。
27.在本发明的一种实施方式中，所述反应体系为含有2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖以及辅酶的缓冲液。
28.在本发明的一种实施方式中，上述微生物细胞或重组大肠杆菌在反应体系中的终浓度为5～50g/l。
29.在本发明的一种实施方式中，所述2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸在反应体系中的终浓度为0.1～500mmol/l。
30.在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为nad
+
或nadh。
31.在本发明的一种实施方式中，所述辅酶为nad
+
。
32.在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为nh4cl
‑
nh4oh缓冲液、tris
‑
hcl缓冲液或pbs缓冲液。
33.在本发明的一种实施方式中，所述缓冲液为nh4cl
‑
nh4oh缓冲液。
34.在本发明的一种实施方式中，所述nh4cl
‑
nh4oh缓冲液的浓度为1～5mol/l。
35.在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为25～50℃、ph为7～11、辅酶nad
+
的浓度为0.05～1mmol/l。
36.有益效果：
37.(1)以2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸为底物进行动力学参数测定，野生型苯丙氨酸脱氢酶的催化效率(k
cat
/k
m
)为17.03mm
‑1·
s
‑1，三点突变体v309g/l306v/v144g的催化效率(k
cat
/k
m
)为219.16mm
‑1·
s
‑1，实现了催化效率(k
cat
/k
m
)12.9倍的提高。
38.(2)与已报道的催化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸合成l
‑
高苯丙氨酸的野生型苯丙氨酸脱氢酶相比，本发明所得的三点突变体v309g/l306v/v144g在单批次300mmol/l的高底物浓度下依然可以有效催化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸合成l
‑
高苯丙氨酸，转化率可达99％，300mmol/l底物浓度为目前报道的单批次可催化底物浓度的最高值。
39.(3)采用底物分批补料和产物过滤去除相结合的工艺，本发明所得的三点突变体v309g/l306v/v144g在210min内将1.08mol/l的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸完全转化为l
‑
高苯丙氨酸，比时空转化率可达到30.9mmol
·
g
‑1·
l
‑1·
h
‑1，为目前报道最高值。
40.(4)本发明获得的三点突变体v309g/l306v/v144g在成功提高2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸催化效率(k
cat
/k
m
)的基础上，仍保持野生型菌株良好的温度稳定性，更具有实际的工业应用价值。
附图说明
41.图1：含有l
‑
高苯丙氨酸结构单元的6种抗高血压药物的结构式。
42.图2：苯丙氨酸脱氢酶偶联葡萄糖脱氢酶催化2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸制备l
‑
高苯丙氨酸流程图。
43.图3：突变体v309g/l306v/v144g全细胞催化合成l
‑
高苯丙氨酸。
44.图4：结合底物分批补料和产物过滤去除工艺高效合成l
‑
高苯丙氨酸。
具体实施方式
45.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
46.下述实施例中涉及的大肠杆菌e.coli bl21(de3)购自北纳生物，pet
‑
28a(+)质粒购自novagen公司，nad
+
、nadh购自索莱宝生物科技有限公司(上述菌株大肠杆菌e.coli bl21(de3)可以购买得到，不需要进行用于专利程序的保藏)。
47.葡萄糖脱氢酶来源于bacillus amyloliquefaciens，重组菌信息见参考文献pongtharangkul t,chuekitkumchorn p,suwanampa n,et al.kinetic properties and stability of glucose dehydrogenase from bacillus amyloliquefaciens sb5 and its potential for cofactor regeneration[j].amb express,2015,5(68).
[0048]
下述实施例中涉及的培养基如下：
[0049]
lb液体培养基：酵母粉5.0g
·
l
‑1、胰蛋白胨10.0g
·
l
‑1、nacl 10.0g
·
l
‑1、卡那霉素50mg
·
l
‑1。
[0050]
lb固体培养基：酵母粉5.0g
·
l
‑1、胰蛋白胨10.0g
·
l
‑1、nacl 10.0g
·
l
‑1、琼脂粉20g
·
l
‑1、卡那霉素50mg
·
l
‑1。
[0051]
实施例1：苯丙氨酸脱氢酶突变体基因序列的制备
[0052]
具体步骤如下：
[0053]
参照文献“asano y,nakazawa a,endo k,et al.phenylalanine dehydrogenase of bacillus badius.purification,characterization and gene cloning[j].eur j biochem,1987,168(1):153
‑
159.”化学合成氨基酸序列如seq id no.1所示的野生型苯丙氨酸脱氢酶，编码野生型苯丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0054]
将获得的编码野生型苯丙氨酸脱氢酶的基因与pet
‑
28a(+)质粒经双酶切(xho i、bamhi)后进行连接，获得重组质粒pet28a
‑
phedh，并转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，得到重组大肠杆菌pet28a
‑
phedh/e.coli bl21。
[0055]
利用全质粒pcr技术，以获得的重组质粒pet28a
‑
phedh为模板进行定点突变，获得突变体l306v、v309a、v309g、v309g/l50v、v309g/l306v、v309g/l306v/v144a以及v309g/l306v/v144g；
[0056]
其中，突变l306v(l306v突变体)所用引物(5
’‑3’
)如下：
[0057]
l306
‑
for：gctacttggatnvcgcctcctgaattaacaatg(seq id no.3)；
[0058]
l306
‑
rev：gttaattcaggaggcgbnatccaagtagctgacg(seq id no.4)；
[0059]
突变v309a和v309g所用引物如下：
[0060]
v309
‑
for：cgtcagcnscttggataaggcctcctgaattaac(seq id no.5)；
[0061]
v309
‑
rev：ggccttatccaagsngctgacgaattgtatg(seq id no.6)；
[0062]
突变l50v所用引物如下：
[0063]
l50
‑
for：cgacatcctccnvctgctgggcctaaagtggt(seq id no.7)；
[0064]
l50
‑
rev：ggcccagcagbnggaggatgtcgcatgcagcc(seq id no.8)；
[0065]
突变l306v(v309g/l306v突变体)所用引物如下：
[0066]
l306
‑2‑
for：gcaccttggatnvcgcctcctgaattaacaatg(seq id no.9)；
[0067]
l306
‑2‑
rev：gttaattcaggaggcgbnatccaaggtgctgacg(seq id no.10)；
[0068]
突变v144a和v144g所用引物如下：
[0069]
v144
‑
for：ccggtactccnscgatgcaattcgtctccttc(seq id no.11)；
[0070]
v144
‑
rev：cgaattgcatcgsnggagtaccggaggcttatgg(seq id no.12)；
[0071]
pcr反应在50μl体系中进行，反应条件为94℃预变性4min；然后进入30个循环：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min；最后72℃延伸10min，4℃保温。
[0072]
pcr扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测pcr扩增产物的条带大小正确
of protein utilizing the principle of protein
‑
dye binding[j].anal biochem,1976,72,248
‑
254.)，单位为mg/ml。使用origin软件对计算得到的催化活性与对应的底物浓度进行非线性拟合，获得酶的催化效率(k
cat
/k
m
)。
[0081]
结果显示，野生型酶对2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的催化效率(k
cat
/k
m
)为17.03mm
‑1·
s
‑1；单点突变体酶l306v、v309a和v309g对2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的催化效率(k
cat
/k
m
)分别为50.63mm
‑1·
s
‑1，58.23mm
‑1·
s
‑1和73.77mm
‑1·
s
‑1；双点突变体酶v309g/l50v和v309g/l306v对2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的催化效率(k
cat
/k
m
)分别为143.34mm
‑1·
s
‑1和178.83mm
‑1·
s
‑1；三点突变体酶v309g/l306v/v144a和v309g/l306v/v144g对2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的催化效率(k
cat
/k
m
)分别为192.51mm
‑1·
s
‑1和219.16mm
‑1·
s
‑1。
[0082]
实施例4：不同苯丙氨酸脱氢酶突变体的热稳定性
[0083]
将实施例2获得的野生型酶、突变体酶l306v、v309a、v309g、v309g/l50v、v309g/l306v、v309g/l306v/v144a以及v309g/l306v/v144g浓缩酶液在温度范围30
‑
70℃的水浴锅中温浴30min，在30℃下测定温浴30min后的野生型、突变体l306v、v309a、v309g、v309g/l50v、v309g/l306v、v309g/l306v/v144a以及v309g/l306v/v144g对2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的残余催化活性，以不同温度温浴前的活性为100％，温浴后的残余催化活性与之相比计算相对活性，以考察野生型和一系列突变体的温度稳定性。
[0084]
结果显示，突变体酶l306v、v309a、v309g、v309g/l50v、v309g/l306v、v309g/l306v/v144a以及v309g/l306v/v144g的t
5030
(温浴30min后的活性为温浴前活性一半所对应的温度)值分别为60℃、59℃、54℃、60℃、58℃、63℃和59℃，野生型酶在相同条件下的t
5030
值为62℃，可见，突变体l306v、v309a、v309g、v309g/l50v、v309g/l306v、v309g/l306v/v144a以及v309g/l306v/v144g在提高催化效率的基础上仍保持优异的温度稳定性。
[0085]
实施例5：全细胞催化合成l
‑
高苯丙氨酸
[0086]
苯丙氨酸脱氢酶突变体v309g/l306v/v144g通过与葡萄糖脱氢酶(gludh)偶联用于合成l
‑
高苯丙氨酸。
[0087]
反应体系体积为100ml，反应体系为实施例2中获得的v309g/l306v/v144g湿菌体(1.0g)，gludh湿菌体(1.3g)，2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸(200、300、400或500mmol/l)，葡萄糖(240～600mmol/l)，nad
+
(0.3mmol/l)，nh4cl
‑
nh4oh缓冲液(3m，ph 8.5)。
[0088]
将反应体系在30℃和200rpm条件下反应，反应期间定时取样，样品用naoh水溶液(200μl，10m)淬灭。
[0089]
淬灭后的样品通过液相色谱法测定反应体系中的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的浓度，计算底物转化率，测定条件：diamonsil c18(2)液相色谱柱(5μm；250mm
×
4.6mm)；进样量，10μl；流动相a(55％甲醇加0.1％三氟乙酸)，30℃下20min；流速，0.8ml/min；波长230nm。
[0090]
结果如图3所示，苯丙氨酸脱氢酶突变体v309g/l306v/v144g催化200和300mmol/l 2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸时的底物转化率均能达到99％，催化400和500mmol/l 2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸产生了底物抑制现象，底物转化率分别为68％和23％。
[0091]
实施例6：结合底物分批补料和产物过滤去除工艺高效合成l
‑
高苯丙氨酸
[0092]
苯丙氨酸脱氢酶突变体v309g/l306v/v144g通过与葡萄糖脱氢酶(gludh)偶联用于合成l
‑
高苯丙氨酸。
[0093]
反应体系体积为100ml，反应体系为实施例2中获得的v309g/l306v/v144g湿菌体
(1.0g)，gludh湿菌体(1.2g)，2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸(300mmol/l)，葡萄糖(360mmol/l)，nad
+
(0.3mmol/l)，nh4cl
‑
nh4oh缓冲液(3m，ph 8.5)。将反应体系在30℃和200rpm条件下反应。
[0094]
第一批次反应30min，反应结束后取样并按实施例5中所述液相色谱法测定反应体系中的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的浓度，计算底物转化率。
[0095]
通过过滤去除反应体系中析出的l
‑
高苯丙氨酸沉淀，并向剩余的反应体系中添加2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸(300mmol/l)和葡萄糖(360mmol/l)进行第二批次反应。第二批次反应45min，反应结束后取样测定反应体系中的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的浓度，计算底物转化率。
[0096]
通过过滤再次去除反应体系中析出的l
‑
高苯丙氨酸沉淀，再次向剩余的反应体系中添加2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸(300mmol/l)和葡萄糖(360mmol/l)进行第三批次反应。第三批次反应60min，反应结束后取样测定反应体系中的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的浓度，计算底物转化率。
[0097]
通过过滤再次去除反应体系中析出的l
‑
高苯丙氨酸沉淀，且再次向剩余的反应体系中添加2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸(300mmol/l)和葡萄糖(360mmol/l)进行第四批次反应。第四批次反应75min，反应结束后取样测定反应体系中的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸的浓度，计算底物转化率。
[0098]
结果如图4所示，v309g/l306v/v144g催化第一批次反应的底物转化率达到99％，催化第二批次反应的底物转化率达到98.3％，催化第三批次反应的底物转化率为91.8％，催化第四批次反应的底物转化率为61.1％。在210min内将1.08mol/l的2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸完全转化为l
‑
高苯丙氨酸，比时空转化率为30.9mmol
·
g
‑1·
l
‑1·
h
‑1。
[0099]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。