本发明涉及高苯丙氨酸血症基因突变的检测，具体涉及一种高苯丙氨酸血症基因突变检测引物、试剂盒及使用方法。
背景技术：
1、高苯丙氨酸血症(hyperphenylalaninemia,hpa)是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,pah)缺乏或其辅酶四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,bh4)缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，血液和组织中苯丙氨酸(phenylalanine,phe)浓度增高的一组最常见的先天性氨基酸代谢病。hpa的病因分为pah缺乏症和bh4缺乏症两大类，均为常染色体隐性遗传病。高浓度的血phe及其代谢产物和低浓度的神经递质多巴胺、5-羟色胺均可引起神经系统损害，最终导致患儿智力发育落后，皮肤、毛发色素浅淡和尿液、汗液有鼠尿臭味。
2、各个国家与地区hpa的发病率及疾病谱有所不同，具有明显的地区差异性。我国1985-2011年3500万新生儿筛查资料显示，hpa患病率为1/10397，统计数据显示西北部地区要明显高于全国平均水平，其中陕西发生率为1/5 404，宁夏为1/2 280，青海为1/2 400，甘肃为1/2 320，新疆为1/3 495。根据西北地区人群中hpa发病率推算该地区hpa基因突变携带频率约为4％，因此对于全国范围内高苯丙氨酸血症的防治和研究工作要着重在西部地区展开，有必要建立一种准确、高效、低成本的基因检测手段，在西北地区开展孕前携带者筛查，该一级预防措施是是预防出生缺陷的关键，对于hpa防治意义重大。
3、在我国hpa中70％-90％属于为苯丙酮尿症(pku)，由于pah基因突变导致苯丙氨酸羟化酶酶活性降低或丧失引起，pah是高苯丙氨酸血症最重要的致病基因，pah基因数据库登记的突变有500多种，突变类型包括错义突变、缺失突变、剪接突变、无义突变等。pku的突变呈现明显的异质性，不同种族和地区人群之间pku突变部位及分布具有较大的差异。统计全国已报道的苯丙酮尿症患者pah基因突变谱，突变位点在pah基因外显子1、2、3、4、5、6、7、10、11、12及两侧的剪接区位点。我国hpa中12.9％为bh4缺乏症，也存在显著的地域差异，以6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(ptps)缺乏最常见，占比96％，因此编码ptps酶的pts基因也是高苯丙氨酸血症重要的致病基因，pts基因热点突变为c.155a>g、c.259c>t、c.286g>a和c.ivsl-291a>g等；但是，已公开的基因突变位点并不完全适用于不同地域的基因筛查。
4、目前单基因病基因检测以ngs技术平台为主，该技术高通量，但是其操作步骤复杂、试剂耗材昂贵，对技术人员和数据分析能力要求高，这些限制了其在疾病筛查中的应用。而taqman分型、高分辨率溶解曲线法和sanger测序等技术存在一次性检测位点少、通量低、性价比低等局限。
技术实现思路
1、本发明目的在于解决由于地域差异导致的高苯丙氨酸血症基因突变异质性，及现有检测方法筛检局限性大的技术问题，提出一种高苯丙氨酸血症基因突变检测引物、试剂盒及使用方法。
2、本发明技术方案为：
3、本发明提供一种高苯丙氨酸血症基因突变检测引物，其特殊之处在于：包括针对pah基因和pts基因的pcr扩增引物和延伸引物；
4、44对所述pcr扩增引物序列如seq id no 1-seq id no 88所示，延伸引物序列如seq id no 89-seq id no 138所示。
5、进一步地，所述pcr扩增引物序列和延伸引物序列覆盖64个基因突变位点；
6、所述64个基因突变位点中，pah基因的突变位点包括：c.158g>a、c.168+5g>c、c.168+5g>a、c.194t>c、c.194t>a、c.208_210deltct、c.320a>g、c.331c>t、c.355c>t、c.442-1g>a、c.442-1g>c、c.464g>a、c.464g>c、c.482t>c、c.498c>g、c.498c>a、c.473g>a、c.526c>t、c.611a>g、c.688g>a、c.694c>t、c.721c>t、c.722delg、c.728g>a、c.740g>t、c.755g>a、c.755g>c、c.764t>c、c.781c>t、c.782g>a、c.782g>c、c.838g>a、c.842c>t、c.842c>g、c.842+2t>a、c.898g>t、c.913-7a>g、c.929c>g、c.929c>t、c.935g>a、c.977g>a、c.1068c>a、c.1068c>g、c.1174t>a、c.1197a>t、c.1199g>a、c.1199g>c、c.1199+1g>c、c.1199+1g>a、c.1200-2a>c、c.1200-2a>g、c.1208c>t、c.1222c>t、c.1238g>c、c.1252a>c、c.1256a>g、c.1301c>a、c.1301c>t及c.1315+6t>a；
7、pts基因的突变位点包括：c.155a>g、c.259c>t、c.272a>g、c.286g>a及c.317c>t。
8、进一步地，所述pcr扩增引物的5’端加有一段10个碱基长的序列；
9、所述延伸引物的长度在15-30bp之间，3’端的7-9bp范围内的碱基与参考序列完全匹配。
10、本发明还提供一种高苯丙氨酸血症基因突变检测试剂盒，其特殊之处在于：包括pcr扩增引物溶液、延伸引物溶液、pcr扩增反应体系、sap纯化体系、单碱基延伸反应体系和检测芯片；
11、所述pcr扩增引物溶液包括pcr扩增引物序列分别如seq id no 1-seq id no 88所示；
12、所述延伸引物溶液包括延伸引物序列分别如seq id no 89-seq id no 138所示。
13、进一步地，所述pcr扩增引物溶液包括四管pcr扩增引物混合液；
14、第1管pcr扩增引物混合液的扩增引物序列如seq id no.1～seq id no.13、seqid no.15～seq id no.17、seq id no.45～seq id no.57和seq id no.59～seq id no.61所示；
15、第2管pcr扩增引物混合液的扩增引物序列如seq id no.18～seq id no.31和seqid no.62～seq id no.75所示；
16、第3管pcr扩增引物混合液的扩增引物序列如seq id no.32～seq id no.38和seqid no.76～seq id no.82所示；
17、第4管pcr扩增引物混合液的扩增引物序列如seq id no.14、seq id no.39～seqid no.44、seq id no.58、seq id no.83～seq id no.88所示；
18、所述延伸引物溶液包括四管延伸引物混合液，第1管延伸引物混合液的延伸引物序列如seq id no.89～seq id no.97、seq id no.99～seq id no.102和seq id no.104～seq id no.106所示，第2管延伸引物混合液的延伸引物序列如seq id no.107～seq idno.121所示，第3管延伸引物混合液的延伸引物序列如seq id no.122～seq id no.130所示，第4管延伸引物混合液的延伸引物序列如seq id no.98、seq id no.103和seq idno.131～seq id no.138所示。
19、进一步地，所述pcr扩增反应体系包括ddh2o、pcr反应缓冲液、mgcl2、dntp和pcr反应taq酶；sap纯化体系包括ddh2o、sap反应缓冲液和sap酶；
20、所述延伸反应体系包括ddh2o、iplex反应缓冲液、iplex终止混合液和iplex酶。
21、进一步地，所述检测芯片为384孔芯片。
22、同时，还提供一种上述高苯丙氨酸血症基因突变检测试剂盒的使用方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
23、s1、根据对应的扩增引物序列配制四管pcr扩增引物混合液；根据对应的延伸引物序列配制四管延伸引物混合液；
24、s2、提取待测样本的dna；
25、s3、每个待测dna样本加至多孔pcr板的至少四个孔内，以步骤s2中提取的dna为模板，使用pcr扩增反应体系和步骤s1中的四管pcr扩增引物混合液分别通过pcr进行扩增，扩增程序完成后，通过sap纯化体系，消化pcr扩增反应中残余dntp，获得pcr扩增产物；
26、s4、以步骤s3中获得的pcr扩增产物为模板，加入对应的步骤s1中配制的延伸引物混合液，通过延伸反应得到延伸产物；
27、s5、采用树脂纯化s4中获得的延伸产物；
28、s6、采用massarray核酸质谱技术对纯化后的延伸产物进行检测和分型，完成待测dna样本的高苯丙氨酸血症基因突变检测。
29、进一步地，步骤s3中，所述多孔pcr板为384孔板。
30、本发明的有益效果：
31、1、突变位点覆盖率高：本发明用于高苯丙氨酸血症基因突变检测的pcr扩增引物及延伸引物覆盖64个突变位点，覆盖率广，包含具体实施例建立的“中国新疆高苯丙氨酸血症患者基因突变谱”和文献报道的西北地区苯丙酮尿症的全部热点突变，能满足西北地区开展孕前携带者筛查，对于hpa防治意义重大。
32、2、本发明采用多重pcr技术，将对应的基因突变位点分别在4个管中进行pcr扩增，其中第1管(well1)包括22个突变位点，第2管(well2)包括18个突变位点，第3管(well3)包括13个突变位点，第4管(well4)包括11个突变位点，使检测更高效，简化操作。
33、3、本发明提供的试剂盒的突变检出率高，对新疆临床高苯丙氨酸血症患者突变检出率达到74％；同时使基因检测操作简单，对应到单个样本成本低，检测效率高。
34、4、高准确率，高稳定性：本发明提供的引物组是通过优化获得，包括了pcr扩增引物和延伸引物浓度调试优化、位点孔位优化和引物靶向区段的调整等，同时经大样本测试，所有位点聚类清晰，基本无灰区，本发明中对50例临床样本进行检测，检测结果与sanger测序完全一致，精密度实验，批间和批内一致性均为100％。
35、5、通量高，成本低，操作简单周期短：massarray核酸质谱技术所可采用384孔芯片，可在一张芯片上完成384个反应的同时检测，本发明设计了4个反应孔，一块384孔板可一次完成多达94个样本的检测。只需要设计pcr引物和延伸引物，不需要探针设计及荧光标记，并且质谱检测的芯片是通用型的，检测灵活，平均每个样本检测综合成本低；且实验操作过程简单，可在一天内完成，检测结果软件直接判读，数据分析方便。