EGFRvIII嵌合抗原受体及其用途的制作方法

egfrviii嵌合抗原受体及其用途
1.本发明一般地涉及被工程化以表达egfrviii嵌合抗原受体(car)的t细胞用于治疗与egfrviii的表达相关的疾病的用途。
2.发明背景
3.胶质母细胞瘤(glioblastoma，gbm)是人类最常见、最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，大多数病例恶性程度比较高。由于高发病率、高死亡率和低治愈率，gbm在世界范围内造成了巨大的社会和医疗负担，而且几乎无法用传统的治疗方法治愈，因此患者总体生存期很不理想。具体而言，目前现有的标准化治疗策略，是最大安全限度的手术切除肿瘤，术后同步放疗和化疗，以及随后六个月的替莫唑胺辅助化疗的标准治疗方案。然而，患者平均生存期仅为14.6个月。
4.嵌合抗原受体(car)t细胞疗法是一种新兴的免疫疗法，可治疗包括胶质母细胞瘤在内的多种恶性肿瘤。表达gbm特异性嵌合抗原受体(car)的t细胞的免疫疗法提供了一个有希望的治疗平台，因为它有可能专门针对肿瘤组织，同时保留正常大脑。实体瘤免疫治疗面临的挑战包括正常细胞组织表达肿瘤靶抗原、血脑屏障等因素限制car-t细胞向肿瘤部位的运输、以及car-t细胞作用于肿瘤部位有时缺乏长期持久性。
5.有一些表达嵌合抗原受体(car)的转基因t细胞在临床前模型中一定程度上显示出治疗胶质瘤的效果，但早期临床测试显示抗胶质瘤活性有限，这些car-t细胞针对的靶标是il13受体亚单位α2(il13rα2)、her2和egfr变体iii(egfrviii)或eph受体a2(epha2)。而我们尝试使用基于egfrviii的嵌合抗原受体构建体在免疫缺陷的正位胶质母细胞瘤小鼠模型中解决这些问题。
6.iii型egf缺失突变受体(egfrviii)在多种肿瘤类型中均有表达，包括多形性胶质母细胞瘤(gbm)，但在正常组织中很少观察到。egfrviii在24％至67％的gbm病例和存活患者中表达≥1年后，egfrviii的表达是一个独立的不良预后指标。
7.尽管中枢神经系统(cns)通常被认为具有免疫屏障，但最近对恶性胶质瘤患者的疫苗研究取得了积极的结果。然而，依赖于完整的宿主免疫活性的疫苗效力，可能由于免疫抑制细胞因子的肿瘤表达以及化疗和放疗而受到全身免疫抑制。另一方面，用自体t细胞，特别是用嵌合抗原受体(cars)转导的t细胞进行过继性细胞转移(act)治疗，在血液学癌症试验中显示出良好的前景。自2017年以来，以cd19为靶点的car-t疗法已被fda批准用于临床应用，这是癌症基因治疗领域的又一重大突破(https://www.fda.gov/)最近，首次通过嵌合抗原受体(car)将单剂量自体t细胞重新定向到egfrviii的人体内静脉输注研究报告，制造和输注car修饰的t细胞(cart)-egfrviii细胞是可行和安全的，没有肿瘤外毒性或细胞因子释放综合征的证据。临床试验的一名患者在18个月的随访中有残留的稳定疾病。
8.我们构建了第三代嵌合抗原受体(car)t细胞，表达表皮生长因子受体egfrviii的肿瘤特异性突变和共刺激cd28bbζ内域，并在体外和体内评估了效应器功能。在细胞毒性试验中，car t细胞杀死egfrviii阳性细胞，与体外和体内未转化的t细胞相比，egfrviii阳性细胞促进car t细胞活化。
9.发明概述
10.本发明针对egfrviii构建了第三代car。
11.因此，在一些方面，本发明涉及结合egfrviii的嵌合抗原受体，以及包含其的t细胞。
12.在一些方面本发明还涉及编码所述嵌合抗原受体的核酸、包含其的表达载体、病毒和t细胞。
13.本发明还涉及包含嵌合抗原受体的t细胞的用途，用于治疗肿瘤，优选地所述肿瘤高表达egfrviii，更优选地所述肿瘤是胶质瘤，最优选地所述肿瘤是胶质母细胞瘤。
14.在一些实施方案中，提供了一种分离的的嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体从其n端到c端包含顺序连接的：胞外结合区，铰链区/间隔区，跨膜区和包含共刺激结构域和刺激信号结构域的胞内信号区，其中所述胞外结合区结合egfrviii。
15.在一些实施方案中，所述胞外结合区包含重链可变区vh和/或轻链可变区vl，其中所述重链可变区包含互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述轻链可变区包含互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3。在一些具体的实施方案中，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3是氨基酸序列如seq id no:7所示或如与seq id no:7具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列所示的重链可变区的3个互补决定区，和/或所述lcdr1、lcdr2和lcdr3是氨基酸序列如seq id no:8所示或如与seq id no:8具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列所示的轻链可变区的3个互补决定区。在一些具体的实施方案中，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别包含与seq id no:1、2、3、4、5和6具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些具体的实施方案中，所述hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3分别包含与seq id no:1、2、3、4、5和6相比具有不超过3个氨基酸变化、不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的序列。
16.在一些实施方案中，所述胞外结合区包含重链可变区vh，所述vh包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:7的序列或与seq id no:7具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
17.在一些实施方案中，所述胞外结合区包含轻链可变区vl，所述vl包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:8的序列或与seq id no:8具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
18.在一些实施方案中，所述胞外结合区包含重链可变区vh和轻链可变区vl，其中所述vh包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:7的序列或与seq id no:7具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且所述vl包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:8的序列或与seq id no:8具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
19.在一些实施方案中，所述结合egfrviii的胞外结合区是抗体或其抗原结合片段，例如scfv。
20.在一些实施方案中，所述scfv包含vh和vl，优选地，其中所述vh包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:7的序列或与seq id no:7具有80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，且所述vl包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：seq id no:8的序列或与seq id no:8具有80％、85％、90％、93％、95％、
96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一个优选的实施方案中，所述vh和vl之间通过接头连接。在一个更优选的实施方案中，所述接头的序列是如seq id no:11或12所示的序列或与其具有至少80％同一性的序列。
21.在一些实施方案中，所述scfv包含选自seq id no:17-20任一项所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
22.在一些实施方案中，铰链区包含igg4铰链区和/或cd8铰链区。在一些实施方案中，铰链区包含如seq id no:13或14所示的序列或与其具有至少80％同一性的序列。
23.在一些实施方案中，跨膜区包含cd28跨膜结构域，cd4跨膜结构域和/或cd8跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜区包含如seq id no:15-17任一项所示的序列或与其具有至少80％同一性的序列。
24.在一些实施方案中，任选地，所述跨膜区经由铰链区连接至胞外结合区。
25.在一些实施方案中，所述的胞内信号区包含cd3ζ的信号传导结构域(刺激信号结构域)和共刺激结构域。在一些实施方案中，所述cd3ζ信号传导结构域包含seq id no:20所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述共刺激结构域是从4-1bb(cd137)蛋白得到的功能性信号传导结构域，或从cd28蛋白得到的功能性信号传导结构域，或优选地，所述共刺激结构域包含源自cd28和4-1bb的两者。在一些实施方案中，所述4-1bb(cd137)信号传导结构域包含seq id no:19所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述cd28信号传导结构域包含seq id no:18所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成。
26.在一些实施方案中，所述共刺激结构域在cd3ζ的信号传导结构域之前(即，更接近n端)。
27.在一些实施方案中，提供了一种靶向egfrviii的人源化嵌合抗原受体(car)多肽，其从n端到c端包含：
28.(1)胞外结合区，其为人源化抗egfrviii scfv序列，其中所述scfv序列特异性结合egfrviii且包含：
29.(i)重链可变区，其包含根据kabat编号的
30.(a)氨基酸序列seq id no:1所示的重链互补决定区hcdr1、或所述hcdr1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
31.(b)氨基酸序列seq id no:2所示的hcdr2、或所述hcdr2的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
32.(c)氨基酸序列seq id no:3所示的hcdr3、或所述hcdr3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；和
33.(ii)轻链可变区，其包含根据kabat编号的
34.(d)氨基酸序列seq id no:4所示的轻链互补决定区lcdr1、或所述lcdr1的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
35.(e)氨基酸序列seq id no:5所示的lcdr2、或所述lcdr2的不超过2个氨基酸变化
或不超过1个氨基酸变化的变体；和
36.(f)氨基酸序列seq id no:6所示的lcdr3、或所述lcdr3的不超过2个氨基酸变化或不超过1个氨基酸变化的变体；
37.其中所述氨基酸变化是氨基酸的添加、缺失或取代；
38.(2)铰链区/间隔区，其选自
39.(i)igg4铰链区(seq id no:13)，或其具有至少80％的序列同一性的igg4铰链区；
40.(ii)cd8铰链区(seq id no:14)，或其具有至少80％的序列同一性的cd8铰链区。
41.(3)跨膜区(tm)，其选自
42.(i)cd28跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，seq id no:15所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
43.(ii)cd4跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，seq id no:16所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
44.(iii)cd8跨膜结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，seq id no:17所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
45.(4)共刺激信号结构域(csd)，其是：
46.(i)cd28共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，seq id no:18所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；和
47.(ii)4-1bb共刺激结构域或其具有1-5个氨基酸修饰的变体，例如，seq id no:19所示的序列或其具有1-2个氨基酸修饰的变体；
48.(5)刺激信号结构域(ssd)，为cd3ζ信号传导结构域或其具有1-10个氨基酸修饰的变体，例如，seq id no:20所示的序列或其具有1-10个、1-5个氨基酸修饰的变体。
49.在一些实施方案中，本发明的靶向egfrviii的人源化嵌合抗原受体(car)多肽从n端到c端包含：
50.(1)胞外结合区，其为人源化抗egfrviii scfv序列，其中所述scfv序列特异性结合egfrviii且包含：
51.(i)重链可变区，其包含seq id no:7的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列，和
52.(ii)轻链可变区，其包含seq id no:8的序列或与其具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列；
53.例如，(i)重链可变区，其包含seq id no:7的序列，和
54.(ii)轻链可变区，其包含seq id no:8的序列；
55.(2)铰链区/间隔区，其选自
56.(i)igg4铰链区(seq id no 13)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的igg4铰链区；
57.(ii)cd8铰链区(seq id no 14)，或其具有至少90％、至少95％的序列同一性的cd8铰链区。
58.(3)跨膜区(tm)，其选自
59.(i)seq id no:15所示的cd28跨膜结构域或其具有1-3个氨基酸修饰的变体；
60.(ii)seq id no:16所示的cd4跨膜结构域或其具有1-3个氨基酸修饰的变体；
61.(iii)seq id no:17所示的cd8跨膜结构域或其具有1-3个氨基酸修饰的变体；
62.(4)共刺激信号结构域(csd)，其是：
63.(i)seq id no:18所示的cd28共刺激结构域或其具有1-3个氨基酸修饰的变体；和
64.(ii)seq id no:19所示的4-1bb共刺激结构域或其具有1-3个氨基酸修饰的变体；
65.(5)刺激信号结构域(ssd)，为seq id no:20所示的cd3ζ信号传导结构域或其具有1-3个氨基酸修饰的变体；
66.其中所述氨基酸修饰是氨基酸的添加、缺失或取代。
67.在一些实施方案中，本发明的靶向egfrviii的人源化嵌合抗原受体(car)多肽从n端到c端包含：：
68.(1)胞外结合区，其为人源化抗egfrviii scfv序列，其中所述scfv序列特异性结合egfrviii且包含：
69.(i)seq id no:7所示的重链可变区，和
70.(ii)seq id no:8所示的轻链可变区；
71.(2)seq id no:11或12所示的铰链区；
72.(3)跨膜区(tm)，其是seq id no:15所示的cd28跨膜结构域；
73.(4)共刺激信号结构域(csd)，其是：
74.(i)seq id no:18所示的cd28共刺激结构域；和
75.(ii)seq id no:19所示的4-1bb共刺激结构域；
76.(5)seq id no:20所示的cd3ζ信号传导结构域。
77.在一些实施方案中，本发明的靶向egfrviii的人源化嵌合抗原受体(car)多肽还包含位于n端的信号肽，例如，但不限于，具有如seq id no:21所示或与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的信号肽。
78.在一些实施方案中，本发明的靶向egfrviii的人源化嵌合抗原受体(car)多肽具有seq id no:22所示的氨基酸序列或与其具有至少90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的同一性的氨基酸序列。
79.在一些实施方案中，本发明提供了任一前述嵌合抗原受体组成元件/全长的编码核酸；在一些更具体的实施方案中，所述编码核酸包含seq id no:30和/或31的序列。
80.在一些实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含前述的本发明的编码核酸。
81.在一些实施方案中，所述载体选自dna载体、rna载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述的表达载体来源于逆转录病毒质粒；优选地，所述逆转录病毒质粒是sfg。
82.在一些实施方案中，本发明提供了一种病毒，其包含任一前述载体。
83.在一些实施方案中，本发明提供了一种免疫效应细胞，其转导有任意前述的编码核酸，或任意前述的表达载体或任意前述的病毒，优选地，所述免疫效应细胞是t细胞，更优选地，是t淋巴细胞。
84.在一些实施方案中，本发明提供了一种免疫效应细胞，其表面表达任意前述的嵌合抗原受体，优选地，所述免疫效应细胞是t细胞，更优选地，是t淋巴细胞。
85.在一些实施方案中，本发明的免疫效应细胞，由于转导/表达本发明的嵌合抗原受
体，表现出增强的肿瘤细胞杀伤力。在一些优选的实施方案中，增强的靶细胞杀伤力体现为更高的抗肿瘤细胞因子分泌量和/或更强的直接溶瘤能力。在一些优选的实施方案中，更高的抗肿瘤细胞因子分泌量是指细胞因子(例如，但不限于，ifn-γ，il-2，il-6，il-10，il-17，和/或tnf-α等)的分泌相对于非特异性对照的效应细胞提升了0.1倍，0.2倍，0.3倍，0.4倍，0.5倍，0.6倍，0.7倍，0.8倍，0.9倍，1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍，200倍，300倍，400倍，500倍，600倍，700倍，800倍，900倍，1000倍或更高。更强的直接溶瘤能力是指本发明的免疫效应细胞对靶肿瘤细胞的直接杀伤数量相对于非特异性对照的效应细胞提升了0.1倍，0.2倍，0.3倍，0.4倍，0.5倍，0.6倍，0.7倍，0.8倍，0.9倍，1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍，100倍，200倍，300倍，400倍，500倍，600倍，700倍，800倍，900倍，1000倍或更多。
86.在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明的免疫效应细胞的方法，包括用本发明的核酸、表达载体和/或病毒导入所述细胞，和/或使得细胞表达本发明的嵌合抗原受体，例如，自人pbmc分离t细胞，并用核酸、表达载体和/或病毒转导所述分离的t细胞。
87.在一些实施方案中，本发明提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)或提供抗肿瘤免疫的方法，其包括给所述的受试者施用有效量的表达任意前述的嵌合抗原受体的细胞,或任意前述的t细胞。
88.在另一些实施方案中，所述的肿瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)egfrviii，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。
89.在另一些实施方案中，所述细胞与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用。在一个具体的实施方案中，所述其它治疗剂是化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、治疗性单克隆抗体、小分子药物、免疫调节剂(例如免疫抑制剂)或其任意组合。在一个优选的实施方案中，所述其他治疗剂是治疗性单克隆抗体，更优选地是pd-1抗体。
90.在另一些实施方案中，本发明提供了前述任一实施方案所述的嵌合抗原受体、核酸、载体、病毒或细胞的用途，用于制备药物。所述药物用于预防或治疗肿瘤。优选地，所述肿瘤具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)egfrviii，优选地，所述肿瘤为胶质瘤，更优选地，所述肿瘤为胶质母细胞瘤。在另一些实施方案中，本发明提供了所述药物，即，本发明提供了这样一种药物组合物，其包含前述任一实施方案所述的嵌合抗原受体、核酸、载体、病毒或细胞。
91.在一些进一步的实施方案中，所述药物是单独使用，或与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用。在一个具体的实施方案中，所述其它治疗剂是化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、治疗性单克隆抗体、小分子药物、免疫调节剂(例如免疫抑制剂)或其任意组合。在一个优选的实施方案中，所述其他治疗剂是治疗性单克隆抗体，更优选地是pd-1抗体。
附图说明：
92.图1.egfrviii car-t细胞在体外介导了优异的抗肿瘤疗效。a.与u373-egfrviii(右图)或u87-egfrviii(左图)细胞系共培养6小时后，用流式细胞仪分析car-t细胞(非特
异性cars(顶部)；egfrviii cars(底部))的cd107a上调情况。egfrviii cars在两个共培养系统中与靶细胞共培养时都表现出脱颗粒现象。t细胞群是通过分析cd3的表达来确定的。b.体外实验数据的统计结果。为了评估egfrviii
+
靶细胞的识别，将非特异性t细胞(未转化的t细胞非特异性car-t细胞)或egfrviii
+
car t细胞与egfrviii
+
靶细胞共培养。对cd107a+的胞内染色(ics)阳性细胞的量化显示，egfrviii car诱导的t细胞活化产生明显的cd107a表达。c.显示了ifn-γ+的胞内染色(ics)阳性细胞的定量。t细胞转导对ifn-γ+细胞比例的影响在mock car细胞和egfrviii+car t细胞之间有显著差异。d.由egfrviii特异性car触发的细胞因子产生。egfrviii特异性car和非特异性t细胞(包括未转导t细胞和非特异性car)以10:1的e:t比例与靶细胞共培养，24小时后，通过elisa测定t细胞产生的ifn-γ。e.通过rt-pcr验证egfrviii cars对靶细胞的细胞毒性。f.共培养24小时后egfrviii阳性靶细胞的残留状态(中间)，egfrviii car对靶细胞有很强的毒性(a代表u87-egfrviii细胞，b代表u373-egfrviii细胞)。所有结果均以至少一式两份的平均值
±
sd表示。(*p《0.05,**p《0.005,***p《0.005)。
93.图2.egfrviii car-t细胞在体外表现出egfrviii特异性肿瘤细胞杀伤活性。a.基于阻抗的细胞毒性检测测量了在效应细胞e：靶细胞t＝10：1时测量靶细胞的生长曲线，细胞指数作为靶细胞活力的反向度量。使用xcelligence系统(agilent)，在肿瘤细胞与car t细胞共孵育和仅肿瘤细胞进行孵育期间，肿瘤细胞的细胞指数值持续图形化输出，直到50小时的时间点。根据共培养方案，对mock-和egfrviii-car-t细胞进行实时阻抗分析。根据所用的共培养方案，u87-egfrviii(左)和u373-egfrviii(右)细胞的细胞指数值。实验一式两份进行。红色线表示仅有靶细胞的生长曲线，蓝色线表示细胞毒性实验的生长曲线。b.荧光素酶报告实验。在标准的24小时细胞毒性实验中，egfrviii car t细胞杀伤u87-egfrviii和u373-egfrviii细胞，与egfrviii阴性细胞形成对比。
94.图3.颅内递送egfrviii car t细胞显著延长了小鼠的生存期。a.将u87-egfrviii细胞(2
×
105，左图)和u373-egfrviii细胞(2
×
105，右图)原位植入nod-scid小鼠体内，植入后用颅内效应细胞(1
×
107)处理。使用kaplan-meier乘积极限估计法对每组的生存曲线进行了估计。每组的曲线的主要比较分析是使用log-rank检验进行的。b.u87-egfrviii肿瘤随时间延长的生物发光成像，n＝4只小鼠。c.u373-egfrviii肿瘤随时间延长的生物发光成像，n＝3只小鼠。
95.图4.egfrviii car-t细胞归巢到肿瘤部位。进行免疫组化分析以检测a.组织形态学，b.egfrviii蛋白，和c.t细胞。
96.图5.a.egfrviii car分子的示意图。b.流式细胞仪检测核染后9天pbmc转染体的egfrviii car细胞表面表达。gam的表达通常被检测作为0.5对数单位的平均荧光的低量级群体转换。egfrviii car+t细胞在活细胞(左)、cd4+(中)、cd8+(右)上进行门控。阴性染色对照是通过染色未转染的t细胞进行的。c.核染后9天，用western blot检测pbmc转染体的细胞表面egfrviii car。d.t细胞膜上egfrviii car的平均表达率。
97.图6.a.稳定地转染了绿色荧光蛋白和荧光素酶的细胞系。绿色荧光蛋白是用流式细胞仪进行的。b.通过rt-pcr检测egfr和egfrviii的表达。
98.图7.t细胞活化标志物的上调。a.mock t细胞或b.egfrviii-car t细胞与u87-egfrviii或u373-egfrviii共培养。通过特异性抗体偶联的apc通过流式细胞仪对cd25的分
析，与对照(mock)细胞相比，car-t细胞的表达比例显著更高。
99.图8.显示了对ifn-γ+的ics阳性细胞的定量。a.t细胞转导对ifn-γ+细胞比例的影响在mock car细胞和egfrviii+car t细胞之间有显著差异。单独培养的egfrviii+car t细胞(即无靶细胞)作为对照，或者与egfrviii阴性胶质瘤细胞共培养的egfrviii+car t细胞作为对照；b.对ifn-γ+的ics阳性细胞的定量可以忽略不计。
100.图9.与egfrviii-细胞相比，egfrviii+细胞诱导显著更高水平的各种细胞因子，尤其是ifnγ和tnf。il17a没有达到最低的检测灵敏度，所以未计入其变化(未显示)。u373(仅肿瘤细胞)组作为统计阴性对照。
101.图10.荧光素酶报告实验。在标准的24小时细胞毒性试验中，egfrviii car t细胞杀死了u87-egfrviii和u373-egfrviii细胞，与egfrviii阴性细胞形成对比。a.在共培养体系中检测到的荧光素酶荧光强度。b.对照组(egfrviii阴性细胞)显示出较低的细胞溶解活性。相对裂解率(％)是指egfrviii car的更高致死率与其基础致死率(mock-car t细胞)的比值。
102.图11.来自同一供体的t细胞转导egfrviii car或mock car，并与egfrviii阳性或阴性肿瘤细胞培养过夜。a.用car转导的t细胞的增殖。car-t细胞根据b.t细胞表型或c.cd4和cd8门控的组别用流式细胞仪进行分组。d.效应细胞与靶细胞以10:1的e:t共培养。通过流式细胞仪在第1天(刺激后，上)和第7天(下)评估t细胞的表型。我们分别计数了cd3(左)、cd4(中)、cd8(右)阳性t细胞亚群。e.24小时抗原刺激后，用流式细胞仪测量耗竭标志物。
103.图12.egfrviii car-t在体内产生的抗肿瘤反应。肿瘤随时间生长的生物发光成像，移植后用颅内效应细胞处理。a.u373-egfrviii细胞被植入皮下，n＝5只小鼠。b.u251细胞原位植入，n＝5只小鼠。c.皮下模型中cd3的免疫组化显示，实验结束时car-t细胞不存在于肿瘤中(10x)。d.使用kaplan-meier乘积极限估计法评估各组的生存曲线。使用log-rank检验对各组的曲线进行主要比较分析(皮下模型，上；原位模型，下)。
104.发明详述
105.i.定义
106.在下文详细描述本发明前，应理解本发明不限于本文中描述的特定方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解本文中使用的术语仅为了描述具体实施方案，而并不意图限制本发明的范围，其仅会由所附权利要求书限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域中普通技术人员通常的理解具有相同的含义。
107.为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。
108.术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。
109.如本文所用，术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
110.如本文所用，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。在本文中，当使用术语“包含”或“包括”时，除非另有指明，否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组合的情形。例如，当提及“包含”某个具体序列的元件/多肽时，也旨在涵盖由该具体序列组成的元件/多肽。
111.本文所用的术语“egfrviii”是指egfrviii(egfr variant type-iii)基因，或由该基因所表达的蛋白。egfr的表达增强经常在多种癌中检测到，包括乳腺癌、肺癌、头颈部癌以及胶质母细胞瘤。egfr基因的自发重排首先在原发性人类胶质母细胞瘤中被发现，并且在几乎所有病例中，egfr扩增的肿瘤中都有这种改变的报道。这些重排导致三种不同类型的突变体，iii型是其中最常见的，全称为iii型egf缺失突变受体，相比于野生型egfr(表皮生长因子受体)，其mrna中的外显子2-7缺失。这些缺失对应于cdna核苷酸275-1075，其编码氨基酸6-276，可能通过选择性剪接或重排。egfr基因胞外区内801bp的缺失导致正常egfr蛋白的框内截短，产生145kda受体，从而产生肿瘤特异性和免疫原性表位。egfrviii在多种肿瘤类型中均有表达，包括多形性胶质母细胞瘤(gbm)，但在正常组织中很少观察到。egfrviii在24％至67％的gbm病例和存活患者中表达≥1年后，egfrviii的表达是一个独立的阴性预后指标。
112.本文所用的术语“抗egfrviii抗体”、“抗egfrviii”、“egfrviii抗体”或“结合egfrviii的抗体”是指这样的抗体，所述抗体能够以足够的亲和力结合(人)egfrviii以致所述抗体可以用作靶向(人)egfrviii的治疗剂。在一些实施方案中，所述(人)egfrviii抗体在体外或体内以高亲和力结合(人)egfrviii。
113.术语“抗体片段”包括完整抗体的一部分。在优选的实施方案中，抗体片段为抗原结合片段。
[0114]“抗原结合片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于fv，fab，fab’，fab
’‑
sh，f(ab’)2；dab(domain antibody)；线性抗体；单链抗体(例如scfv)；单结构域抗体例如vhh；双价抗体或其片段；或骆驼科抗体。术语“scfv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scfv可以以任何顺序(例如相对于多肽的n-末端和c末端)具有所述的vl和vh可变区，scfv可以包括vl-接头-vh或可以包括vh-接头-vl。
[0115]
当本文提及“抗egfrviii抗体”、“抗egfrviii”、“egfrviii抗体”或“结合egfrviii的抗体”时，也可也指特异性结合egfr的抗体片段，例如scfv，除非另有说明。
[0116]“互补决定区”或“cdr区”或“cdr”是抗体可变结构域中在序列上高变并且形成在结构上确定的环(“超变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。cdr主要负责与抗原表位结合。重链和轻链的cdr通常被称作cdr1、cdr2和cdr3，从n-端开始顺序编号。位于抗体重链可变结构域内的cdr被称作hcdr1、hcdr2和hcdr3，而位于抗体轻链可变结构域内的cdr被称作lcdr1、lcdr2和lcdr3。在一个给定的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各cdr的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体cdr指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和cdr环的拓扑学的chothia(chothia等人.(1989)nature 342:877-883，al-lazikani等人,“standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,journal of molecular biology,273,927-948(1997))，基于抗体序列可变性的kabat(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第4版,u.s.department of health and human services,
national institutes of health(1987)),abm(university of bath)，contact(university college london)，国际immunogenetics database(imgt)(在万维网上imgt.cines.fr/上)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinity propagation clustering)的north cdr定义。
[0117]
例如，根据不同的cdr确定方案，每一个cdr的残基如下所述。
[0118][0119]
cdr也可以基于与参考cdr序列(例如本发明示例性cdr之任一)具有相同的kabat编号位置而确定。
[0120]
除非另有说明，否则在本发明中，术语“cdr”或“cdr序列”涵盖以上述任一种方式确定的cdr序列。
[0121]
除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据kabat编号系统(kabat等人，sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))的编号位置。
[0122]
在一些实施方案中，本发明抗体的重链可变区cdr按照kabat规则确定
[0123]
在一些实施方案中，本发明抗体的轻链可变区cdr按照kabat规则确定。
[0124]
在一些实施方案中，本发明抗体的重链可变区cdr按照kabat规则确定；且轻链可变区cdr按照kabat规则确定。
[0125]
在另一个可替代的实施方案中，本发明抗体的重链可变区cdr和/或轻链可变区cdr按照非kabat规则确定，例如按照chothia、abm、contact、imgt和north等等本领域公知的规则。
[0126]
应该注意，基于不同的指派系统获得的同一抗体的可变区的cdr的边界可能有所差异。即不同指派系统下定义的同一抗体可变区的cdr序列有所不同。因此，在涉及用本发明定义的具体cdr序列限定抗体时，所述抗体的范围还涵盖了这样的抗体，其可变区序列包含所述的具体cdr序列，但是由于应用了不同的方案(例如不同的指派系统规则或组合)而导致其所声称的cdr边界与本发明所定义的具体cdr边界不同。
[0127]
具有不同特异性(即，针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的cdr(在同一指派系统下)。然而，尽管cdr在抗体与抗体之间是不同的，但是cdr内只有有限数量的氨
基酸位置直接参与抗原结合。使用kabat,chothia,abm、contact和north方法中的至少两种，可以确定最小重叠区域，从而提供用于抗原结合的“最小结合单位”。最小结合单位可以是cdr的一个子部分。正如本领域技术人员明了，通过抗体的结构和蛋白折叠，可以确定cdr序列其余部分的残基。因此，本发明也考虑本文所给出的任何cdr的变体。例如，在一个cdr的变体中，最小结合单位的氨基酸残基可以保持不变，而根据kabat或chothia定义的其余cdr残基可以被保守氨基酸残基替代。
[0128]
如本文中所用，“来源于人”或“来源于小鼠”的区域是指所述区域具有天然人或天然小鼠的该区域的氨基酸序列或编码核酸序列，或由该氨基酸序列或编码核酸序列组成。“来源于”人或小鼠的区域还涵盖这样的区域，其基本上与天然人或天然小鼠的该区域的氨基酸序列或编码核酸序列相同，或与所述序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且仍然具有与该区域相同或相似的活性和/或功能。例如当定义“所述cd3ζ链来源于人”时，是指所述cd3ζ链具有天然人cd3ζ链的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成；或者是指cd3ζ链的氨基酸序列与天然人cd3ζ链的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，并且仍然具有天然人cd3ζ链的活性和/或功能。
[0129]“人源化”抗体是指包含来自非人cdr的氨基酸残基和来自人fr的氨基酸残基的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体将包含基本上所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有的cdr(例如，cdr)对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的fr对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可以包含至少一部分的来源于人抗体的抗体恒定区。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”是指已经进行了人源化的抗体。
[0130]“人抗体”或“全人抗体”或“全人源抗体”可以互换使用，其指具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于下述抗体的氨基酸序列，所述抗体由人或人细胞生成或来源于非人来源，其利用人抗体库或其它人抗体编码序列。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
[0131]
如本文所用，术语“结合”或“特异性结合”意指结合作用对抗原是选择性的并且可以与不想要的或非特异的相互作用区别。抗原结合位点与特定抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定法(elisa)或本领域已知的常规结合测定法如通过放射性免疫测定(ria)或生物膜薄层干涉测定法或msd测定法或表面等离子体共振法(spr)或细胞结合实验测定。
[0132]
术语“嵌合抗原受体”或备选地“car”是指一组多肽，当其在免疫效应细胞中时，给所述的细胞提供针对靶细胞(通常是癌细胞)的特异性，并且具有细胞内信号产生。在某些实施方案中，car包括至少一个胞外结合区、跨膜区和胞内信号区。在某些方面，多肽组彼此邻接。
[0133]
术语“胞内信号区”是指通过在细胞内传递信息而起作用的蛋白质的功能性部分，用来通过产生第二信使或通过响应这样的信使起效应物作用经由确定的信号传导途径调节细胞的活性。
[0134]
术语“胞外结合区”是指嵌合抗原受体识别抗原的部分，在一些实施方案中，胞外结合区是来自单克隆抗体的scfv，或dab(domain antibody)或vhh。
[0135]
术语“跨膜区”嵌合抗原受体跨越膜的部分。跨膜区可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是包含几个疏水残基的alpha螺旋。任何跨膜蛋白的跨膜区可以用于
提供嵌合受体的跨膜部分，例如跨膜区可以是来自cd8α或cd28的跨膜区，优选的包含seq id no:15-17任一项的氨基酸序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
[0136]
术语“cd3-ζ”，又称为cd247，定义为如genban acc.no.bag36664.1提供的蛋白质或来自非人类种类(例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等)的等同残基；“cd3-ζ信号传导结构域”定义为来自cd3-ζ的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能性衍生物，其足以在功能上传递t细胞活化所需的起始信号。在一个实施例中，“cd3-ζ信号传导结构域”包含如seq id no:20提供的序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
[0137]
术语“4-1bb”是指具有如genbank acc.no.aaa62478.2提供的氨基酸序列的tnfr超家族的成员，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1bb共刺激结构域”被定义为genbank acc.no..aaa62478.2的氨基酸残基第214-255位，或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基。在一个方面，“4-1bb共刺激结构域”为如seq id no:19提供的序列或来自非人类物种例如小鼠、啮齿类动物、猴子、猿等的等同残基或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
[0138]
术语“cd28”是指人白细胞分化抗原28，它在ncbi genebank的官方名称为cd28，id号为940，有3个异构体(cdna序列/蛋白序列)，分别为nm_006139.3/np_006130.1，nm_001243077.1/np_001230006.1，nm_001243078.1/np_001230007.1。如本文使用的，术语“cd28共刺激结构域”包含如seq id no:18提供的序列或与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％或以上的同一性的序列。
[0139]
本文所用术语“逆转录病毒”是指逆转录病毒即rna病毒中，作为常用的基因工程/基因治疗载体所使用的那些病毒。在一个具体的实施方案中，本发明所使用的逆转录病毒载体是基于moloney小鼠白血病病毒(sfg)质粒，也称为“载体pmsgv1”。常用的逆转录病毒载体是可获得的，并且是本领域技术人员已知的，例如，来自addgene公司。
[0140]
本文所述的术语“治疗剂”涵盖在预防或治疗肿瘤，例如癌症中有效的任何物质，包括化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、治疗性单克隆抗体、小分子药物或免疫调节剂(例如免疫抑制剂)。
[0141]
术语“细胞毒性剂”用在本发明中指抑制或防止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。
[0142]“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化学化合物。
[0143]
术语“小分子药物”是指低分子量的能够调节生物过程的有机化合物。“小分子”被定义为分子量小于10kd、通常小于2kd和优选小于1kd的分子。小分子包括但不限于无机分子、有机分子、含无机组分的有机分子、含放射性原子的分子、合成分子、肽模拟物和抗体模拟物。作为治疗剂，小分子可以比大分子更能透过细胞、对降解更不易感和更不易于引发免疫应答。
[0144]
本文使用的术语“免疫调节剂”指抑制或调节免疫应答的天然或合成活性剂或者药物。免疫应答可以是体液应答或细胞应答。免疫调节剂包含免疫抑制剂。
[0145]
本文使用的“免疫抑制剂”、“免疫抑制药物”或“免疫抑制物”是在免疫抑制治疗中
用于抑制或阻止免疫系统活性的治疗剂。
[0146]
术语“有效量”指本发明的抗体或片段或缀合物或组合物或组合的这样的量或剂量，其以单一或多次剂量施用患者后，在需要治疗或预防的患者中产生预期效果。
[0147]“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量也是这样的一个量，其中抗体或抗体片段或其缀合物或组合物或组合的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。相对于未治疗的对象，“治疗有效量”优选地抑制可度量参数(例如肿瘤体积)至少约20％、更优选地至少约40％、甚至更优选地至少约50％、60％或70％。
[0148]“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
[0149]“个体”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或受试者是人。
[0150]
如下进行序列之间序列同一性的计算。
[0151]
为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，将所述序列出于最佳比较目的比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而抛弃非同源序列)。在一个优选实施方案中，为比较目的，所比对的参考序列的长度是至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、100％的参考序列长度。随后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
[0152]
可以利用数学算法实现两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算。在一个优选实施方案中，使用已经集成至gcg软件包的gap程序中的needlema和wunsch((1970)j.mol.biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用gcg软件包中的gap程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用nwsgapdna.cmp矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。特别优选的参数集合(和除非另外说明否则应当使用的一个参数集合)是采用空位罚分12、空位延伸罚分4和移码空位罚分5的blossum 62评分矩阵。还可以使用pam120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4)，利用已经并入align程序(2.0版)的e.meyers和w.miller算法,((1989)cabios,4:11-17)确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。额外地或备选地，可以进一步使用本文所述的核酸序列和蛋白质序列作为“查询序列”以针对公共数据库执行检索，以例如鉴定其他家族成员序列或相关序列。
[0153]
术语“抗肿瘤作用”指可以通过多种手段展示的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少或肿瘤细胞存活减少。
[0154]
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
[0155]
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生
理疾患。在某些实施方案中，适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括胃癌或胰腺癌，包括那些癌症的转移性形式。
[0156]
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
[0157]
术语“胶质瘤”是神经胶质瘤的简称，也称为胶质细胞瘤。胶质瘤是一种中枢神经系统的肿瘤疾病，是指是发生于神经外胚层的肿瘤，其源自神经元细胞或间质细胞的癌变。胶质瘤是颅内最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半。胶质母细胞瘤是胶质瘤中比较常见的一种类型，又称多形性胶质母细胞瘤(gbm)，是世界卫生组织对胶质瘤的分级中第ⅳ级的代称，ⅳ级胶质瘤是恶性程度最高的胶质瘤。胶质母细胞瘤的发病高峰年龄一般为50—60岁。
[0158]
术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂或治疗方式(例如放射疗法或手术)以治疗本文所述疾病。这种施用包括以基本上同时的方式共同施用这些治疗剂，例如以具有固定比例的活性成分的单一胶囊。或者，这种施用包括对于各个活性成分在多种或在分开的容器(例如片剂、胶囊、粉末和液体)中的共同施用。粉末和/或液体可以在施用前重构或稀释至所需剂量。此外，这种施用还包括以大致相同的时间或在不同的时间以顺序的方式使用每种类型的治疗剂。在任一情况下，治疗方案将提供药物组合在治疗本文所述的病症或病状中的有益作用。
[0159]
用于本文时，“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。
[0160]
用于本文时，“预防”包括对疾病或病症或特定疾病或病症的症状的发生或发展的抑制。在一些实施方案中，具有癌症家族病史的受试者是预防性方案的候选。通常，在癌症的背景中，术语“预防”是指在癌症的病征或症状发生前，特别是在具有癌症风险的受试者中发生前的药物施用。
[0161]
术语“载体”当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。
[0162]
本文中的术语“标志物”是指这样的一类物质，其来自于在体或离体样本，并且相对而言容易利用本领域已有的或常规的实验方法和工具来检测其在样本中的存在水平，而这种存在水平(例如，高低或有无)与某种特定的生理或病理状态有关联，因此可以藉由获取该标志物的存在水平而推断或辅助推断这种特定的生理或病理状态。标志物可以是机体内存在的任何物质，例如但不限于，核酸、多糖、蛋白质、无机或有机小分子，或它们的聚合物或杂合物(例如，糖蛋白、磷酸化的蛋白、甲基化的核酸序列，等等)，或它们(例如，蛋白质)的编码基因。在本发明的一些实施方案中，标志物是ifn-γ。在本发明的一些实施方案中，需要被推断的特定的生理或病理状态是指本发明的car-t细胞进入受试者体内后所表现出或将要表现出的对靶肿瘤的杀伤或抑制能力。在一些进一步的实施方案中，所述样本是转染car分子后的t细胞的体外培养上清，或接受car-t细胞治疗后受试者的血清。
[0163]
本文中的术语“ifn-γ”是指细胞因子干扰素(interferon)的一种亚型，其由活化
t细胞和自然杀伤细胞分泌，特别是i型辅助t细胞(th1细胞)，以水溶性二聚体存在。ifn-γ的受体由两个亚基组成，与ifn-γ结合后被其激活，调节jak-stat通路。多项研究表明，ifn-γ具有抗病毒、免疫调节及抗肿瘤等活性。
[0164]
cd107a是一种t细胞的表面标志物。ctl和nk细胞中的细胞毒性颗粒主要存在于分泌性溶酶体，而cd107a又称溶酶体相关膜蛋白-1，是存在于溶酶体膜上的一种蛋白，当分泌性溶酶体分泌的过程中，溶酶体与细胞膜结合，cd107a随溶酶体膜与细胞膜结合而表达在细胞膜上，因此，cd107a分子是ctl细胞脱颗粒的一种敏感标志，与细胞毒活性直接相关，可反映细胞毒性细胞杀伤活性水平
[0165]
ii.嵌合抗原受体以及其编码核酸
[0166]
在本发明的一个方面，本发明涉及分离的嵌合抗原受体(car)分子，其包含(例如顺序连接的)结合egfrviii的胞外结合区、跨膜区和胞内信号区(例如包含共刺激结构域)。
[0167]
ii-1胞外结合区
[0168]
在一些实施方案中，本文所述的结合egfrviii的胞外结合区结合野生型egfrviii，例如人野生型egfrviii。
[0169]
结合egfrviii的胞外结合区可以是结合egfrviii的任何抗原结合结构域：包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于scfv、单结构域抗体，比如重链可变结构域(vh)、轻链可变结构域(vl)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(vhh)，且结合本领域已知的备选的支架以抗原结合结构域形式起作用。在某些情况下，抗原结合结构域来源于与car的最终用处相同的物种是有利的。例如，为了用于人类，car的抗原结合结构域包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的残基可能是有利的。因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人抗体或抗体片段。在一个方面，抗原结合结构域是scfv。
[0170]
在一种实施方案中，所述的结合egfrviii的胞外结合区包含本文中描述的一个或更多个(例如，所有3个)轻链互补决定区1(lcdr1)、轻链互补决定区2(lcdr2)和轻链互补决定区3(lcdr3)以及本文中描述的一个或更多个(例如，所有3个)重链互补决定区1(hcdr1)、重链互补决定区2(hcdr2)和重链互补决定区3(hc cdr3)。
[0171]
在一些实施方案中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含3个来自重链可变区的互补决定区(hcdr)，hcdr1、hcdr2和hcdr3。
[0172]
在一些实施方案中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(lcdr)，lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0173]
在一些实施方案中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含3个来自重链可变区的互补决定区(hcdr)和3个来自轻链可变区的互补决定区(lcdr)。
[0174]
在一些方面中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含重链可变区(vh)。在一些方面中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含轻链可变区(vh)。在一些方面中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含重链可变区和轻链可变区(vh)。在一些实施方案中，所述重链可变区包含3个来自重链可变区的互补决定区(cdr)，hcdr1、hcdr2和hcdr3。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含3个来自轻链可变区的互补决定区(cdr)，lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0175]
在一些实施方案中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区的重链可变区
[0176]
(i)包含与选自seq id no:7的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
[0177]
(ii)包含选自seq id no:7的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
[0178]
(iii)包含与选自seq id no:7的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在cdr区中。
[0179]
在一些实施方案中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区的轻链可变区
[0180]
(i)包含与选自seq id no:8的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
[0181]
(ii)包含选自seq id no:8的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或者
[0182]
(iii)包含与选自seq id no:8的氨基酸序列相比具有1个或多个(优选不超过10个，更优选不超过5、4、3、2、1个)的氨基酸改变(优选氨基酸置换，更优选氨基酸保守置换)的氨基酸序列由所述氨基酸序列组成，优选地，所述氨基酸改变不发生在cdr区中。
[0183]
在一些实施方案中，本发明的3个来自重链可变区的互补决定区(hcdr)，hcdr1、hcdr2和hcdr3选自
[0184]
(i)如seq id no:7所示的vh中所含的三个互补决定区域hcdr1、hcdr2和hcdr3,或
[0185]
(ii)相对于(i)中任一序列，在所述三个hcdr区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
[0186]
在一些实施方案中，本发明的3个来自轻链可变区的互补决定区(lcdr)，lcdr1、lcdr2和lcdr3选自
[0187]
(i)如seq id no:8所示的vl中所含的三个互补决定区域lcdr1、lcdr2和lcdr3，或
[0188]
(ii)相对于(i)中任一序列，在所述三个lcdr区上共包含至少一个且不超过5、4、3、2或1个氨基酸改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的序列。
[0189]
在一些实施方案中，hcdr1包含seq id no:1的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者hcdr1包含与seq id no:1的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
[0190]
在一些实施方案中，hcdr2包含seq id no:2的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者hcdr2包含与seq id no:2的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
[0191]
在一些实施方案中，hcdr3包含seq id no:3的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者hcdr3包含与seq id no:3的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
[0192]
在一些实施方案中，lcdr1包含seq id no:4的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者lcdr1包含与seq id no:4的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
[0193]
在一些实施方案中，lcdr2包含seq id no:5的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者lcdr2包含与seq id no:5的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨
基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
[0194]
在一些实施方案中，lcdr3包含seq id no:6的氨基酸序列，或由所述氨基酸序列组成，或者lcdr3包含与seq id no:6的氨基酸序列相比具有一个、两个或三个改变(优选氨基酸置换，优选保守置换)的氨基酸序列。
[0195]
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的结合egfrviii的胞外结合区包含vh和vl，其中所述vh和vl分别包含如以下所示的氨基酸序列或由如以下所示氨基酸序列组成：seq id no:7和8。
[0196]
在本发明的一些实施方案中，本文所述的氨基酸改变包括氨基酸的置换、插入或缺失。优选的，本文所述的氨基酸改变为氨基酸置换，优选地保守置换。
[0197]
在优选的实施方案中，本发明所述的氨基酸改变发生在cdr外的区域(例如在fr中)。更优选地，本发明所述的氨基酸改变发生在重链可变区外和/或轻链可变区外的区域。
[0198]
在一些实施方案中，置换为保守性置换。保守置换是指一个氨基酸经相同类别内的另一氨基酸置换，例如一个酸性氨基酸经另一酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸经另一碱性氨基酸置换，或一个中性氨基酸经另一中性氨基酸置换。示例性的置换如下表所示：
[0199][0200]
在某些实施方案中，置换发生在egfrviii的胞外结合区的cdr区。通常，获得的变
体相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体。
[0201]
在一些实施方案中，本发明的egfrviii的胞外结合区是抗egfrviii抗体的scfv片段。
[0202]
在一些实施方案中，所述scfv片段包含接头。在一些实施方案中，所述接头是肽接头。肽接头可以主要包括或可以不主要包括以下氨基酸残基：gly、ser、ala或thr。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n、(gggs)n和(ggggs)ng，其中n是至少1(且优选2、3、4、5、6、7、8、9、10)的整数。在一些实施方案中，接头包含(gsggs)3(seq id no:11)的氨基酸序列。在一些实施方案中，接头包含(gsggs)4(seq id no:12)的氨基酸序列。
[0203]
在一些实施方案中，所述scfv片段包含选自seq id no:9或10所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
[0204]
ii-2跨膜区
[0205]
在多种实施方案中，关于跨膜区，car可以被设计成包括连接至car的胞外结构域的跨膜区。跨膜区可以包括一个或更多个邻接跨膜区域的另外氨基酸，例如一个或更多个与所述跨膜所源自的蛋白质的胞外区域相关联的氨基酸(例如，胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)和/或与所述跨膜蛋白所源自的蛋白质的胞外区域相关联的一个或更多个另外的氨基酸(例如，胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15个氨基酸)。在一个方面，跨膜区是与使用的car的其它区中的一个有关的区，例如，在一种实施方案中，所述跨膜区可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所源自的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜区不是来源于car的任何其它区来源的相同蛋白质。在某些情况下，跨膜区可以被选择或通过氨基酸取代修饰以避免这样的区与相同或不同表面膜蛋白的跨膜区结合，例如以使与受体复合体的其它成员的相互作用最小化。在一个方面，跨膜区能够与表达car的细胞的细胞表面上的另一个car同型二聚化。在一个不同的方面，跨膜区的氨基酸序列可以被修饰或取代，以便使与存在于表达相同car的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小化。
[0206]
跨膜区可以来源于天然或重组来源。当所述来源是天然的时，所述结构域可以来源于任何膜结合的蛋白质或跨膜蛋白质。在一个方面，跨膜区能够向胞内区传导信号，无论何时所述car与靶结合。在本发明中特别使用的跨膜区可以包括至少以下的跨膜区：例如，cd28、cd8(例如，cd8α，cd8β)、cd4。在一种实施方案中，所述的跨膜结构域包含本文中描述的的跨膜结构域,例如，其具有seq id no:15-17任一项的序列、具有seq id no:15-17任一项的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列,或与seq id no:15-17任一项的氨基酸序列具有90-99％同一性的序列。
[0207]
在某些情况下，跨膜区可以经由铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)连接至car的胞外区域，例如car的抗原结合结构域。例如，在一种实施方案中，铰链可以是人ig(免疫球蛋白)铰链(例如，igg4铰链、igd铰链)、gs接头(例如，本文所述的gs接头)、kir2ds2铰链或cd8a铰链。在一种实施方案中，铰链区是人igg4或cd8铰链；在一些实施方案中，铰链区序列
与人igg4或cd8铰链具有至少95％序列同一性；在一种实施方案中，铰链区包含(例如，由其组成)seq id no:13或14的氨基酸序列。
[0208]
ii-3胞内信号区
[0209]
在一些实施方案中，所述car分子包含胞内信号区。在一些实施方案中，所述胞内信号区包含共刺激结构域。在一种实施方案中，所述的共刺激结构域是从选自由下列组成的组的蛋白质得到的功能性信号传导结构域:cd28和/或4-1bb(cd137)或其功能性变体。在一种实施方案中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:seq id no:18的序列和/或seq id no:19的序列。在一种实施方案中，所述的共刺激结构域包含下列或由其组成:具有seq id no:18和/或seq id no:19的氨基酸序列的至少1、2或3个修饰(例如，取代)但不超过20、10或5个修饰(例如，取代，例如保守取代)的氨基酸序列,或与seq id no:18和/或seq id no:19的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
[0210]
胞内信号区通常负责其中已经引入car的免疫细胞的正常效应子功能中至少一个的活化。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。t细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号区”是指转导效应子功能信号且引导细胞执行特定功能的蛋白质的部分。虽然通常可以应用全部胞内信号区，但是在许多情况下不必使用整个链。就使用胞内信号区的截短部分来说，可以使用这样的截短部分代替完整的链，只要其转导效应子功能信号。因此，术语胞内信号区意味着包括足以转导效应子功能信号的胞内信号区的截短部分。
[0211]
用于本发明的car的胞内信号区还包括共同作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的t细胞受体(tcr)和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。众所周知通过单独的tcr产生的信号不足以完全活化t细胞，并且也需要二级和/或共刺激信号。因此，t细胞活化可以被称为是由两个不同种类的细胞质信号传导序列介导的：通过tcr引发抗原依赖性一级活化的那些(一级胞内信号区)以及以抗原独立方式起作用以提供二级或共刺激信号的那些(二级细胞质结构域，例如共刺激结构域)。一级细胞质信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合体的一级活化。以刺激方式起作用的一级胞内信号区可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或itam。特别地用于本发明中的含有itam的一级胞内信号区的实例包括如下那些：cd3ζ。在一种实施方案中，本发明的car包含胞内信号区，例如cd3-ζ的初级信号传导结构域。
[0212]
car的胞内信号区可以包含cd3-ζ信号传导结构域本身，或者其可以与用于本发明的car的其它的胞内信号区例如共刺激信号传导结构域组合。例如，car的胞内信号区可以包括cd3ζ链部分和共刺激信号传导结构域，优选地，所述共刺激传导结构域在cd3ζ的信号传导结构域之前。
[0213]
可以使本发明的car的细胞质部分之内的胞内信号区以随机或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2和10个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)之间的短的寡肽或多肽接头可以在胞内信号区之间形成连接。在一种实施方案中，甘氨酸-丝氨酸二联体可用作合适的接头。在一种实施方案中，单个氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作合适的接头。
[0214]
在一个方面，胞内信号区被设计成包含两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激
信号传导结构域。在一种实施方案中，两个或多个，例如2、3、4、5个或多个共刺激信号传导结构域被接头(例如本文所述的接头)分子分开。在一种实施方案中，胞内信号区包含两个共刺激信号传导结构域。在某些实施方案中，接头分子为甘氨酸残基。在某些实施方案中，接头为丙氨酸残基。
[0215]
在一个方面，胞内信号区被设计成包含cd3-ζ的信号传导结构域和cd28的信号传导结构域。在一个方面，胞内信号区被设计成包含cd3-ζ的信号传导结构域和4-1bb的信号传导结构域。在一个方面，cd3-ζ的信号传导结构域包含seq id no:20所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成。
[0216]
car分子还可以包含信号肽，例如，但不限于，具有如seq id no:21所示或与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的信号肽。
[0217]
因此，本发明的car分子可以包含结合egfrviii的胞外结合区，例如结合egfrviii的scfv，例如包含选自seq id no:9或10所示的氨基酸序列或与所述序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；铰链区，例如igg4铰链区，其例如包含seq id no:13的氨基酸序列或由其组成，或例如cd8铰链区，其例如包含seq id no:14的氨基酸序列或由其组成；跨膜区，例如cd28跨膜区，例如包含seq id no:18的氨基酸序列或由其组成，或例如cd8跨膜区，例如包含seq id no:17的氨基酸序列或由其组成，例如cd4跨膜区，例如包含seq id no:16的氨基酸序列或由其组成；胞内信号区，其包含cd28信号传导结构域，例如包含seq id no:18的氨基酸序列或由其组成，和/或4-1bb信号传导结构域，例如包含seq id no:19的氨基酸序列或由其组成，以及cd3ζ，例如包含seq id no:20所示的序列或与之具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列；以及报告基因，例如gfp，例如添加了t2a的gfp。
[0218]
iii.编码核酸和载体
[0219]
本发明提供car的编码核酸，其包括编码一个或更多个本发明的car的核酸序列。在一个方面，以dna构建体形式提供car编码核酸。
[0220]
car编码核酸可以在5’端包含kozak序列，以促进稳定性和翻译效率。在一些实施方案中，kozak序列包含gccaccatgg(seq id no:29)的核酸序列或由其组成。
[0221]
本发明进一步提供包含car转基因的载体。在一个方面，可以直接地把car载体转导到细胞中，例如t细胞，例如t淋巴细胞。在一个方面，载体为克隆载体或表达载体，例如包括，但不限于一个或更多个质粒(例如表达质粒、克隆载体、微环(minicircles)、微载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体。在一个方面，载体能够在哺乳动物t细胞中表达car分子。在一个方面，哺乳动物t细胞为人t细胞，例如t淋巴细胞。
[0222]
本发明还提供其中插入本发明的编码car的核酸的载体。在一些实施方案中，所述载体为dna、rna、质粒、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述的载体是慢病毒载体。在另一些实施方案中，所述的载体是逆转录病毒。在一个优选的实施方案中，逆转录病毒是sfg。
[0223]
在一些实施方案中，所述的载体进一步包含启动子。
[0224]
简言之，编码car的天然或合成核酸的表达通常通过将编码car多肽或其部分的核
酸与启动子有效连接，且将构建体掺入表达载体中来实现。载体可以适用于复制和整合真核生物。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节期望的核酸序列表达的启动子。
[0225]
本发明的表达构建体也可用于使用标准基因递送方案的核酸免疫和基因治疗。用于基因递送的方法是本领域已知的。可以把核酸克隆到大量类型的载体中。例如，可以把核酸克隆到包括，但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别目的载体包括表达载体、复制载体、产生探针的载体和测序载体。
[0226]
进一步，可以以病毒载体的形式把表达载体提供到细胞中。病毒载体技术是本领域熟知的，并且被描述在例如sambrook等人,2012,molecular cloning:a laboratorymanual,volumes 1-4,cold spring harbor press,ny)和其它病毒学和分子生物学手册中。用作载体的病毒包括，但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选的标记物。
[0227]
在一种实施方案中，使用逆转录病毒载体。
[0228]
为了评价car多肽或其部分的表达，引入到细胞中的表达载体也可以含有可选的标记基因或报告基因或这两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在一些实施方案中，报告基因是gfp。在一些实施方案中，报告基因是荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶。
[0229]
向细胞中引入和表达基因的方法是本领域已知的。在表达载体的上下文中，载体可以通过本领域的任何方法容易地被引入宿主细胞中，例如哺乳动物、细菌、酵母菌或昆虫细胞。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
[0230]
用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的，参见例如sambrook等人,2012,molecular cloning:a laboratory manual,volumes 1-4,cold spring harbor press,ny)。一种用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选的方法是脂质体转染。
[0231]
iv.细胞
[0232]
在另一个方面中，本发明涉及包含所述载体或核酸的细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是人t细胞,例如，本文中描述的t细胞。在一种实施方案中，所述的t细胞是t淋巴细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是自体的t细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是同种异体的t细胞。
[0233]
在扩增和基因修饰之前，细胞来源(例如，t细胞或nk细胞)是从受试者获得的。术语“受试者”意味着包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人类、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可以从大量来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可以使用本领域可获得的许多t细胞系。在本发明的某些方面，t细胞可以使用本领域技术人员已知的多种技术的任一种(比如ficoll
tm
分离)从受试者收集的血液单位获得。在一个优选的方面，通过单采血液成分术，从个体的正在循环的血液获得细胞。
[0234]
在一个方面，通过溶解红细胞和例如通过离心穿过percolltm梯度或逆流离心机淘析耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞中分离t细胞。t细胞的特异性亚群体，比如cd3+、cd28+、cd4+、cd8+、cd45ra+和cd45ro+t细胞可以通过正选择或负选择技术进一步分离。例如，在一个方面，通过用抗-cd3/抗-cd28(例如3
×
28)-缀合的珠(比如m-450 cd3/cd28 t)培养足以正选择期望的t细胞的时期分离t细胞。
[0235]
在另一个方面中，本发明涉及生产细胞的方法，其包括给本文中描述的细胞(例如，t细胞)转导含有编码car分子(例如，本文中描述的car分子)的核酸的载体。在一种实施方案中，所述的载体是本文中描述的慢病毒载体。
[0236]
v.用途和方法
[0237]
本发明一方面提供了在受试者中预防或治疗肿瘤(例如癌症)或提供抗肿瘤免疫的方法，其包括给所述的受试者施用有效量的含有car分子的细胞,例如，本文中描述的表达car分子的细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是自体的t细胞。在一种实施方案中，所述的细胞是同种异体的t细胞或nk细胞。在一种实施方案中，所述的受试者是人。在一种实施方案中，所述t细胞是t淋巴细胞。
[0238]
在一些实施方案中，所述肿瘤(例如癌症)患者中具有(例如升高水平的，例如核酸或蛋白质水平的)egfrviii。
[0239]
在一些实施方案中，所述肿瘤例如癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤以及转移性病灶。在一些实施方案中，实体瘤的例子包括恶性肿瘤。癌症可以处于早期、中期或晚期或是转移性癌。
[0240]
在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于抑制核酸或蛋白质水平的egfrviii。在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于本发明的car-t细胞对肿瘤细胞的直接杀伤。在一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于本发明的car-t细胞所分泌的细胞因子对肿瘤细胞的生长抑制或杀伤。在另一些实施方案中，所述肿瘤治疗将受益于本发明的car-t细胞所分泌的细胞因子对体内免疫系统的整体或局部的调节，并由后者对肿瘤细胞造成生长抑制或杀伤。
[0241]
在一个具体的实施方案中，本发明的抗egfrviii抗体能够抑制肿瘤细胞增殖，例如表达egfrviii的肿瘤细胞，例如胶质瘤细胞，例如gbm细胞。
[0242]
在一些实施方案中，肿瘤是肿瘤免疫逃逸。
[0243]
在一些实施方案中，所述肿瘤是癌症，例如胶质瘤，例如gbm。
[0244]
受试者可以是哺乳动物，例如，灵长类，优选地，高级灵长类，例如，人类(例如，患有本文所述疾病或具有患有本文所述疾病的风险的个体)。在一些实施方案中，受试者患有本文所述疾病(例如，癌症)或具有患有本文所述疾病的风险。在某些实施方案中，受试者接受或已经接受过其它治疗，例如化疗治疗和/或放射疗法。在一些实施方案中，受试者之前已经接受过或正在接受免疫疗法。
[0245]
在其他方面，本发明提供car分子或其编码核酸或包含其的载体或包含其的细胞在生产或制备药物中的用途，所述药物用于本文所述的用途，例如用于预防或治疗本文提及的相关疾病或病症。
[0246]
在一些实施方案中，本发明的car分子或其编码核酸或包含其的载体或包含其的细胞会延迟病症和/或与病症相关的症状的发作。
[0247]
在一些实施方案中，本发明的car分子或其编码核酸或包含其的载体或包含其的细胞还能与一种或多种其它疗法例如治疗方式和/或其它治疗剂组合施用，用于本文所述的用途，例如用于预防和/或治疗本文提及的相关疾病或病症。
[0248]
在一些实施方案中，所述治疗方式或治疗剂增强表达car分子的细胞的活性或适应性，或减轻与施用表达car分子的细胞的副作用，或者治疗与egfrviii相关的疾病。
[0249]
在一些实施方案中，治疗方式包括外科手术；放射疗法、局部照射或聚焦照射等。在一些实施方案中，治疗剂选自化疗剂、细胞因子、细胞毒性剂、疫苗、治疗性单克隆抗体、小分子药物或免疫调节剂。示例性的免疫调节剂包括免疫抑制剂或抗炎剂。
具体实施方式
[0250]
本发明的全部实施例都是旨在说明性而非限制性的。本发明的全部实施例都在必要时经过了北京世纪坛医院机构评审委员会的批准，并征得所有参与者的知情同意。
[0251]
稳定表达本发明的egfrviii car分子的免疫效应细胞对稳定表达egfrviii的人胶质瘤细胞系u87-egfrviii和u373-egfrviii具有杀伤作用。在体外实验中，我们发现在共培养系统中，效应细胞被明显激活，并分泌各种与免疫功能有关的细胞因子，特别是inf-γ。通过检测靶细胞的存在，可以更直观地评估肿瘤的裂解情况。我们使用了多种方法来评估溶瘤效果，包括rt-pcr、rtca和荧光素酶报告实验。这些方法都证明了egfrviii car具有稳定、强大和特异的溶瘤作用。最重要的是，在异位移植正位模型中，egfrviii car与其他已发表的报告相比，显示出类似的细胞溶解潜力。虽然评价体系存在差异，但我们构建的第三代car-t细胞表现出稳定的细胞溶解作用。
[0252]
本发明的示例性scfv的序列seq id no编号(全部cdr应用kabat规则定义)
[0253] scfvhcdr11hcdr22hcdr33vh7lcdr14lcdr25lcdr36vl8scfv9或10
[0254]
实施例1.材料与方法
[0255]
细胞系和抗体
[0256]
表达egfrviii或wtegfr的胶质瘤细胞系是斯隆凯特琳纪念癌症中心webster k cavenee慷慨捐赠的，该细胞系保存在补充有1μg/ml嘌呤霉素的dmem中。其它胶质瘤细胞系，u87，u251，u373，从atcc获得。所有细胞系均稳定转染绿色荧光蛋白，荧光素酶在添加10％胎牛血清和1％10000iu/ml青霉素/10000μg/ml链霉素的dmem培养基中培养(图6)。pg-13和phoenix eco逆转录病毒产生细胞系在添加10％fbs、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠(lonza)的dmem培养基中培养。t细胞在t细胞培养基中培养，该培养基由x-vivo-15培养基
gcccttcgcacttactacttgcgg-3'，seq id no:24)扩增，egfrviii片段(150bp)用引物(正向，5'-atgcgcctccgggacggcc-3'seq id no:25；反向，5'-ctcatagtcggcccccagg-3'，seq id no:26)扩增，肌动蛋白用引物(正向，5'-acctgcccatacagg-3'，seq id no:27；反向，5'-agggccggactcgtcatact-3'，seq id no:28)扩增。
[0266]
构建稳定表达egfrviii的胶质瘤细胞系(u251、u87和u373)，并验证了其表达水平(参见图6b)。
[0267]
评估car t细胞的抗肿瘤活性的维持情况
[0268]
实时细胞分析(rtca)是一种基于细胞阻抗变化评估的系统。当细胞粘附时，细胞指数(ci)值为零。首先，将靶细胞以10000个细胞/孔的密度接种到e板上。在室温下培养30分钟后，将e板放置在培养箱(5％co2；37℃)内的rtca sp站上，进行连续阻抗记录。接种后第1天，在与10倍效应细胞共培养的另一天测量ci值，作为肿瘤细胞密度的指标。
[0269]
nod/scid小鼠胶质母细胞瘤的治疗和影像学研究
[0270]
实验使用6至8周龄的雌性nod/scid小鼠。所有动物都被安置在特定的无病原体环境中，并严格按照首都医科大学北京世纪坛医院批准的方案和标准动物护理要求进行饲养。尽量减少实验动物的痛苦。
[0271]
方案1：在适应性喂养1周后，小鼠接受颅内(i.c.)植入2
×
10^5egfrviii靶细胞或其他胶质瘤细胞系，使用立体定向坐标(距前囟点后2.5mm，侧2.5mm，深入实质内3.5mm)。在每次植入前，靶细胞在单独的微量离心管中轻微再悬浮。颅内肿瘤移植后第6天，静脉注射2
×
10^7效应细胞(egfrviii car或非特异性t细胞)。
[0272]
方案2：适应性喂养1周，小鼠接受颅内(i.c.)植入2
×
10^5egfrviii靶细胞或其他胶质瘤细胞系，使用立体定向坐标(距前囟点后2.5mm，侧2.5mm，深入实质内3.5mm)。小鼠在第一次手术后3天恢复，脑内注射1
×
10^7个效应细胞(egfrviii car或非特异性t细胞)(距前囟点前0.3mm，左2mm，深入实质内3.5mm)。
[0273]
方案3：皮下模型采用2
×
10^6u373-egfrviii细胞，最终体积为100μl。将每只nod/scid小鼠的右侧注射肿瘤细胞悬液。用游标卡尺测量皮下异种移植物的进展，并根据公式v＝长度
×
宽度
×
深度/2进行计算，以确保各组皮下模型的大小大致相同，在第8天静脉注射2
×
10^7个效应细胞(egfrviii car或非特异性t细胞)。
[0274]
肿瘤进展后进行生物发光成像(bli)，利用xenogen ivis成像系统(xenogen)和活体图像软件(xenogen)获取成像数据集。然后对病情缓解的小鼠实施安乐死，以进行进一步的组织学分析。简而言之，在成像前10分钟腹腔注射d-荧光素(200μl pbs中150mg/kg；)期间，使用1-2％异氟醚麻醉小鼠。在高灵敏度、冷却的ccd相机(xenogen)中每隔五分钟进行生物发光成像，直到获得峰值发射值，并观察到所有小鼠的荧光信号减少为止。
[0275]
免疫组织学染色
[0276]
为了评估肿瘤结构和生长模式，nod/scid小鼠接受了脑内或皮下肿瘤植入物，并在死亡前实施安乐死。在石蜡包埋之前，采集大脑，并在4℃的4％冷冻pfa中固定12小时。5微米冠状面切片，切片后在室温下用兔单克隆抗人cd3抗体和兔单克隆抗人egfrviii抗体进行免疫染色。为了进行解剖学评估，每10个连续切片的大脑都用苏木精和伊红(h&e)染色。图像在光学显微镜下放大10倍、40倍。
[0277]
实施例2.生成egfrviii特异性car t细胞
[0278]
第三代抗egfrviii特异性car-t细胞的构建与表达
[0279]
第三代抗egfrviii car(图5a)是通过在跨膜区和cd3ζ的信号传导结构域分子之间加入cd28-4-1bb胞内结构域而产生的。cd28跨膜结构域片段通过pcr扩增，使用适当设计的引物通过限制性酶切组装在构建物之间，氨基酸序列为seq id no:15。egfrviii结合部分来自scfv，其氨基酸序列如seq id no:9所示。来源于cd28.4-1bb的共刺激域和cd3ζ信号结构域序列分别seq id no:18、19和20。scfv与跨膜结构域之间通过铰链区(seq id no:13)相连。
[0280]
自逆转录病毒载体sfg(addgene公司，也称为“载体pmsgv1”)获得载体retro-sfg-igg4-cd28-4-1bb-cd3ζ，用smaⅰ/mluⅰ双酶切，然后利用克隆技术将前述抗egfrviii scfv序列的核苷酸序列连接至该载体，37℃连接1h后，转化涂于氨苄抗性lb平板上，通过挑亚克隆、抽提质粒、酶切验证后测序鉴定重组载体，构建出第三代car-t的逆转录病毒载体retro-sfg-egfrviii scfv-igg4-cd28-4-1bb-cd3ζ(如图5a所示)。
[0281]
使用所构建的egfrviii特异性car逆转录病毒载体，进行病毒包装。具体而言，将10μg的逆转录病毒载体retro-sfg-egfrviii scfv-igg4-cd28-4-1bb-cd3ζ通过磷酸钙试剂转染到phoenix eco细胞。48h后，收集上清液并用于转导逆转录病毒pg13包装细胞克隆。从最高滴度的pg13包装细胞克隆产生逆转录病毒上清液，过0.45μm
ꢀ‑
hp针式滤器，获得逆转录病毒原液。
[0282]
将病毒原液4℃、32000r/min超速离心2h，将逆转录病毒沉淀溶解在x-vivo培养液中。获得逆转录病毒浓缩液，分装后-80℃冻存。
[0283]
对逆转录病毒浓缩液进行了滴度检测。96孔尖底板每孔铺0.5
×
106个jurkat细胞，200μl/孔，将逆转录病毒浓缩液稀释100倍，按1:50、1:500和1:2000的比例加入各孔400μl、40μl和10μl。32℃、1200
×
g离心90min。4h后用dpbs将细胞洗一次后铺于12孔板，转导48h后通过流式细胞术检测。结果表明，本实施例制备的逆转录病毒浓缩液稀释100倍后能够感染jurkat细胞并表达car，因此，使用所述逆转录病毒浓缩液实施了car-t细胞的产生。
[0284]
上述病毒通过测序验证。
[0285]
逆转录病毒转导
[0286]
使用ficoll溶液(ge healthcare)通过梯度离心分离健康供者的外周血单个核细胞(pbmc)。纯化后立即用抗cd3/cd28 t细胞激活剂dynabeads(invitrogen)以1:1的珠细胞比激活。在活化48小时后，通过在逆转录连接蛋白(takara)涂层板上离心，用逆转录病毒上清液转导t细胞，以获得egfrviii-28bbζcar t细胞。9天后通过流式细胞术或western blot验证转导效率(图5b)。作为对照，用编码cd19特异性car基因的载体转导对照t细胞。
[0287]
car分子在t细胞上的表达
[0288]
用单克隆抗体cd3、cd4、cd8(bd-pharmingen)在室温下分析t细胞亚群并用fitc标记的山羊抗鼠igg(h+l)抗体(sigma)检测car表达。我们还使用western blot评估cars的表达，用pbs洗涤细胞，并使用含有蛋白酶抑制剂的ripa缓冲液进行裂解，在15％sds-page凝胶(bio-rad)上分离得到的蛋白质。随后将分离的蛋白质转移到pvdf膜上，并使用抗人cd3-ζ单克隆抗体(bd pharmingen，克隆8d3)进行检测。使用奥德赛成像系统(li-cor)观察条带，观察时以未转导的细胞作为对照。
[0289]
实施例3.表达egfrviii cars的t细胞识别表达egfrviii的细胞
[0290]
从健康志愿者身上获取了外周血单个核细胞(pbmc)，用于转导编码第三代egfrviii car的逆转录病毒。转导后，通过流式细胞术和western blot测定表面表达，发现t细胞在其细胞表面有效表达egfrviii car结构(图5)。
[0291]
接下来，我们转染并培养靶细胞(egfrviii+)和对照肿瘤细胞(egfrviii-)，使它们稳定表达gfp/luc(图6a)。并采用流式细胞术筛选获得gfp/luc完全表达的靶细胞。与血液肿瘤相比，我们发现胶质瘤细胞刺激下的cars细胞的激活程度相对较弱。首先通过测量t细胞脱颗粒功能标志物cd107a的表达来比较egfrviii car和非特异性car的相对效力。如图1a所示，观察到egfrviii car诱导的t细胞活化导致明显的cd107a表达。为了进一步证实egfrviii cars可被相应的靶细胞激活，在与u87-egfrviii或u373-egfrviii共培养后，通过流式细胞术评估cd25表达作为t细胞激活标记物。与转染mock的细胞相比，car-t细胞表达标记物的频率显著更高，分别为63.3％和67.6％(图7)。这些数据表明，在相应抗原存在的情况下，egfrviii car确实被激活。
[0292]
然后，为了评估egfrviii car是否具有杀伤胶质瘤细胞的潜力，我们检测了共培养24小时后细胞因子的水平，尤其是inf-γ的产生和释放，包括分泌和细胞内的inf-γ。如(图1c 1d，图8，图9)所示，我们观察到，与mock car-t细胞相比，egfrviii car诱导的t细胞激活导致ifn-γ产生增加20倍。car t细胞与egfrviii+细胞系共培养时也分泌th1/th2/th17细胞因子(图9)。
[0293]
最后，在共培养试验中确定了针对egfrviii的抗原特异性反应性。相比之下，尽管cd107a阳性t细胞的百分比并不高，但通过pcr(图1e 1f)和荧光素酶报告试验(图10)测定，egfrviii+car t细胞确实强烈诱导靶细胞死亡。重要的是，egfrviii+car t细胞观察到抗肿瘤活性，而非特异性t细胞未观察到抗肿瘤活性。
[0294]
实施例4.尽管有高水平的激活，但表达egfrviii+car的t细胞仍表现出类似的增殖水平
[0295]
鉴于细胞因子的高水平产生，我们测试了egfrviii car结构是否会诱发任何可能影响这些细胞在体内长期存活能力的潜在耗竭效应。
[0296]
我们评估了在转导启动后以及随后7天的体外egfrviii刺激后，由cd45ro、ccr7、cd27和cd95定义的初始t细胞(t cell,tn)、干样记忆t细胞(tscm)、中心记忆t细胞(tcm)、效应记忆t细胞(tem)或效应t细胞(tte)表型的多个表面标记物的表达。记忆表型t细胞在egfrviii car中比非特异性car更高(图11b、11d)。首先，我们发现cd8阳性t细胞的数量逐渐增加，随着细胞体外扩增和培养时间的延长，tscm和tcm逐渐被tem和tte取代(图11a、11b、11c)。
[0297]
通常，抗原非依赖性car-t信号的特点是存在多个细胞表面表达的共抑制受体(pd-1、lag-3和tim-3)。我们发现，抗原激活的car-t细胞与无egfrviii的t细胞相比，耗竭标记物的表达在相同水平，即未表现出耗竭。与表达非特异性car的t细胞相比，egfrviii car t细胞在egfrviii刺激后表达相同水平的耗竭标志物(图11e)。
[0298]
实施例5.利用实时细胞分析(rtca)监测car诱导的egfrviii+细胞的细胞毒性效应
[0299]
为了评估基于rtca的检测方法作为测量car-t细胞的细胞毒性效应的方法，使用xcelligence系统实时测量靶细胞的细胞阻抗，其中靶细胞分为与egfrviii cars共同培养
组和不共同培养组。将肿瘤细胞接种于16孔e板(e板)中，一式三份。肿瘤细胞贴壁24小时后，以每1个肿瘤细胞10个t细胞的比例添加t细胞。连续记录电阻抗作为肿瘤细胞密度的指标。
[0300]
图2a显示了根据所用共培养方案测量的肿瘤细胞阻抗。当细胞在培养基中培养24小时时，u87-egfrviii和u373-egfrviii的ci值分别从0(共培养前的ci)显著增加至1.76
±
0.14和0.97
±
0.03(cimin)。然后，在仅培养肿瘤细胞组，通过添加新鲜培养基，ci保持稳定增长，最终达到2.42
±
0.03和1.52
±
0.02(实验结束时的ci)。然而，添加相同体积、但含有10倍数量效应细胞的培养基(共培养组)会导致两种应用方案的ci明显随时间下降至零。而在效应细胞处理下的egfrviii阴性细胞表现出缺乏免疫反应，尽管ci值略有下降，但在实验期间，检测值在更长的共培养时间内保持稳定。
[0301]
总的来说，这些结果表明，细胞阻抗的动力学曲线受特异性免疫反应的影响，而在egfrviii阴性肿瘤细胞的培养中，它们没有差异。
[0302]
实施例6.egfrviii car细胞在原位异种移植模型和皮下模型中抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期
[0303]
为了进一步探讨egfrviii car t细胞的潜在治疗应用，我们检测了它们的体内抗肿瘤活性。
[0304]
首先，我们进行了皮下模型，接受egfrviii car的5只小鼠均未出现可检测到的毒性，所有小鼠均保持总体体重(图12a)。car-t细胞的治疗效果有限，甚至不能延长存活时间(图12d)。随后，免疫组化结果显示，在小鼠皮下肿瘤中未发现cd3+t细胞(图12c)，这表明从小鼠尾静脉注射的car-t细胞很难渗入皮下肿瘤。
[0305]
为了获得更接近人类胶质瘤治疗过程的结果，我们通过将表达egfrviii的u87和u373细胞经基因转染表达萤火虫荧光素酶并植入nod-scid小鼠大脑，建立了原位胶质瘤。萤火虫荧光素酶的表达使我们能够通过体内生物发光成像来监测肿瘤的生长。为了尽量减少潜在的全身毒性，我们在肿瘤细胞植入后3天在肿瘤内注射car-t。如图3所示，与注射mock car-t细胞的小鼠相比，携带u87-egfrviii或u373-egfrviii细胞的小鼠在用生物发光成像测定的方法处理egfrviii car-t细胞后，肿瘤生长显著减少(p《0.01)。重要的是，在患有iii级和ⅳ级胶质瘤细胞系或胶质母细胞瘤细胞系的小鼠中，肿瘤生长的减少看起来没有太大不同。
[0306]
为了进一步阐明egfrviii car t细胞对表达wtegfr的gb肿瘤的治疗效果，我们通过将u251细胞颅内植入nod-scid小鼠建立了原位模型。肿瘤细胞植入6天后，我们在肿瘤内注射egfrviii car t细胞或pbs作为载体对照。如图12b所示，与对照组相比，单次瘤内注射car-t细胞的小鼠没有显著降低肿瘤负担。此外，接受car-t细胞治疗的小鼠没有从存活中获益。
[0307]
综上所述，egfrviii car t细胞可以在体内有效靶向并杀死表达egfrviii的肿瘤细胞。
[0308]
实施例7.颅内注射后egfrviii car细胞迁移和延长的评估
[0309]
我们在异种移植模型中证明了颅内给药的可行性和安全性。在此基础上，我们分析了注射后肿瘤内细胞的分布。对瘤内注入mock或egfrviii-car-t细胞的荷瘤小鼠脑切片进行苏木精和伊红(h&e)染色，结果显示肿瘤并未完全消退(图4a)。在u87-egfrviii组中，
我们发现肿瘤组织仍然强烈表达靶蛋白分子，但我们惊讶地发现有非常少的cd3+t细胞，这证明在抗原刺激下，car-t细胞可以在大脑中长期存在。相比之下，在携带u373-egfrviii细胞的小鼠中也检测到目标蛋白分子egfrviii，但未发现t细胞存活很长时间(图4b 4c)。
[0310]
本文引用、提及和/或参照的专利申请、专利、文献、书籍等，均以其整体内容全文纳入本文之中作为参考。
[0311]
本发明所涉及的序列列表如下：
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