细粒棘球绦虫Sigma‑谷胱甘肽S‑转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法与流程

本发明涉及一种细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法。

背景技术：

谷胱甘肽s-转移酶（gst）是一种具有多种生理功能的酶，该酶在微生物、植物、昆虫、鸟类及哺乳动物细胞内广泛存在。在哺乳动物体内共发现8类细胞质(alpha,mu，pi，theta，sigma，zeta，kappa，omega)gsts。gst在解毒内源和外源性有毒物质中起着重要作用，gst能催化内源还原性谷胱甘肽（gsh）与各种有害的亲电性底物相结合，增加有害物质的可溶性从而有利于其从细胞内排出，起到解毒的作用，进而保护生物体内的核酸和蛋白质免受亲电基团攻击。同时也参与胞内物质转运、激素的合成和细胞氧化应激损伤的保护。寄生蠕虫的gst被认为是对蠕虫感染化学治疗理想的药物靶标。基于以上研究背景，本发明构建了编码细粒棘球绦虫sigma-gst基因的原核表达质粒，转化入大肠杆菌表达系统，诱导其表达，并进行蛋白纯化，得到了该蛋白，为包虫病治疗药物的研究提供了有效的药物靶点，并有望用于囊型包虫病患者的免疫诊断。

技术实现要素：

本发明通过基因工程技术，提供了一种细粒棘球绦虫sigma-gst原核表达载体pet30a-sigma-gst，利用该载体转化大肠杆菌（bl21-de3）实现了sigma-gst的高水平可溶性表达。并提供了一种亲和层析纯化方法，纯化出了大量高纯度的新的细粒棘球绦虫sigma-gst，用于gst生化特性分析、功能的研究及抗包虫药物的研发及囊型包虫病患者的免疫诊断。

本发明的第一个目的是提供细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白，所述细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白的氨基酸序列为序列表seqidno.2。

作为优选，所述细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白编码的核苷酸序列为序列表seqidno.1中第63位-701位碱基。

本发明的第二个目的是提供上述细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白的可溶性表达，步骤如下：

（1）目的基因sigma-谷胱甘肽s-转移酶的扩增；

（2）构建sigma-gst表达质粒：将步骤（1）制备的目的基因sigma-谷胱甘肽s-转移酶纯化后酶切，构建入pet-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pet30a-sigma-gst；

（3）将步骤（2）制备的质粒pet30a-sigma-gst转化入e.colibl21(de3)感受态细胞中，将活化表达的菌液加入lb液体培养基中，置于摇床上于37℃，160r/min振荡培养4小时，再加入0.2mmol/l的iptg于20℃诱导振荡培养7小时，离心、超声后收集上清。

本发明的第三个目的是提供上述细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白的纯化方法，其特征在于：步骤如下：

（1）清洗histalon^tmgravitycolumns预装柱；

（2）加入结合缓冲液，所述结合缓冲液为：50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0；

（3）加入细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白上清液，

（4）加入漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液的配方为：50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0；

（5）加入1号洗脱液，所述1号洗脱液的配方为：50mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4；

（6）加入2号洗脱液，所述2号洗脱液的配方为：100mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4；

（7）加入3号洗脱液，所述3号洗脱液的配方为：200mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4；

（8）加入4号洗脱液，所述4号洗脱液的配方为：300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4；

（9）加入5号洗脱液，所述5号洗脱液的配方为：400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4；

（10）分别收集4号和5号洗脱液。

作为优选，所述细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白上清液与1号洗脱液、2号洗脱液、3号洗脱液、4号洗脱液、5号洗脱液的体积比为2:1:1:1:1:1。

本发明还提供上述细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白在制备检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒，所述elisa试剂盒中包被抗原为权利要求1或2所述的细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白。

作为优选，所述包被抗原用ph9.6的0.05m/l碳酸盐缓冲液稀释至终浓度6μg/ml。

作为优选，所述试剂盒还包括封闭液，所述封闭液为含有5%脱脂奶粉的tbst，所述百分比的单位为g/ml。

作为优选，所述试剂盒还包括酶标二抗，所述酶标二抗为过氧化物酶标记的羊抗人igg。

本发明公布了一种新的细粒棘球绦虫sigma-gst基因序列及其编码的蛋白质序列，并应用分子克隆技术构建细粒棘球绦虫sigma-gst的原核表达载体pet30a-sigma-gst，然后将上述原核表达载体pet30a-sigma-gst转化大肠杆菌（bl21-de3），在较低温度、较低诱导剂浓度及较短诱导时间条件下诱导该菌，可实现sigma-gst的高效可溶性表达：用0.2mmol/l异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷（iptg）于20℃诱导振荡培养e.colibl21(de3)-pet30a-sigma-gst7小时，重组蛋白质大部分为可溶性蛋白，占大肠杆菌可溶性总蛋白的75%；最后用hispurcobalt（clontech）亲和层析纯化蛋白，纯化蛋白的操作简单，成本低，极易重复使用，在使用4号洗脱液（300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl）2ml和5号洗脱液（400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl）2ml时可得到一种高纯度的细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶。

本发明所制备的重组蛋白可以用于囊型包虫病患者的免疫诊断，其作为免疫抗原能够被囊型包虫病患者血清识别，应用于间接elisa检测时，具备较高的特异性和灵敏度，临床检测符合率高达95％。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为细粒棘球绦虫sigma-gst基因pcr扩增；其中，m，markerⅲ；1，细粒棘球绦虫pbluescriptⅱsksigma-gst重组质粒dna提取结果；2，sigma-gstpcr扩增产物；

图2为细粒棘球绦虫sigma-gst在不同诱导条件下的原核表达；

图3为细粒棘球绦虫sigma-gst在最佳诱导条件下的原核表达；

图4为细粒棘球绦虫sigma-gsthispurcobalt亲和层析纯化。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。

实施例1细粒棘球绦虫sigma-gst基因序列及其编码的蛋白质序列

细粒棘球绦虫sigma-gst全长813个核苷酸，最大的开放阅读框（orf）位于第63-701位，含639bp，起始密码子为atg，终止密码子为taa，编码212个氨基酸，其核苷酸序列及orf编码的氨基酸序列分别见序列表中seqidno.1和2。

核苷酸序列

编码的氨基酸序列

实施例2细粒棘球绦虫sigma-gst的原核表达载体pet30a-sigma-gst的克隆构建

细粒棘球绦虫sigma-gst的原核表达载体pet30a-sigma-gst可以按照下述方法进行构建；也可以先提取细粒棘球绦虫rna，再转录成cdna，以其为模板进行克隆构建；提取rna和转录的方法为本领域的常规方法。

1、目的基因sigma-gst的扩增

以细粒棘球绦虫pbluescriptⅱsksigma-gst（细粒棘球绦虫pbluescriptⅱsksigma-gst从海南医学院寄生虫学教研室获得，社会公众也可从该教研室获得）为模板,根据细粒棘球绦虫sigma-gst基因序列设计如下两对引物：上游引物序列为：gcgaattcatggatctacaac，

下游引物序列为：ccaagcttttagaaatcgg，

扩增sigma-gst基因最大的开放阅读框（orf）中的基因序列（即63-701位基因序列），pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，69℃复性30s，72℃延伸50s，30个循环；72℃延伸10min；扩增产物电泳结果见图1。

2、构建sigma-gst表达质粒

pcr产物经纯化后，扩增得到片段被ecorⅰ和hindiii酶切并纯化后，构建入pet-30a相应的多克隆酶切位点，构建质粒pet30a-sigma-gst，经测序鉴定，sigma-gst的序列信息与目标基因序列一致：核苷酸序列为序列表seqidno.1中第63-701位，编码212个氨基酸，编码的氨基酸序列为序列表seqidno.2。

实施例3细粒棘球绦虫sigma-gst的原核表达

在不同诱导条件下，重组蛋白的可溶性表达量有所不同，以下为最佳诱导方法：

制备e.colibl21(de3)感受态细胞，将实施例2制备得到的质粒pet30a-sigma-gst转化入e.colibl21(de3)中，将活化表达sigma-gst的e．colibl21(de3)菌液1ml，移入500mllb液体培养基中，置于摇床上于37℃，160r/min振荡培养4小时，再加入iptg（0.2mmol/l）于20℃，120r/min诱导振荡培养7小时；4℃12000rpm离心10min收集细菌；超声破碎细菌，功率240w，超声5s，间歇5s，20min后提取上清，并进行sds-page电泳，可见蛋白在上清液中表达量很高，呈可溶性表达（见图2），可溶性蛋白表达量高，占大肠杆菌可溶性总蛋白75%。

为了寻找到最佳诱导条件，申请人进行了大量实验，图2为细粒棘球绦虫sigma-gst在不同诱导条件下的原核表达。

其中，a图中，m：marker；1-5泳道分别为：bl21（de3）-pet30a-sigma-gst于37℃，iptg浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/l，诱导12小时后上清液的电泳图；

b图中，m：marker；1-4泳道分别为：bl21（de3）-pet30a-sigma-gst于25℃，iptg浓度分别为0.8、0.6、0.4、0.2mmol/l，诱导12小时后上清液的电泳图；5-6泳道分别为：bl21（de3）-pet30a-sigma-gst于20℃，iptg浓度为0.2mmol/l，分别诱导12,10小时后上清液的电泳图。

由图2可见，在诱导温度为37℃，iptg浓度分别为1、0.8、0.6、0.4、0.2mmol/l，诱导12小时后，在上清液中有可溶性表达的sigma-gst，但是表达量很小。

将诱导温度降至25℃，iptg浓度分别为0.8、0.6、0.4、0.2mmol/l，诱导12小时后，可见上清液中可溶性表达的sigma-gst的量较37℃诱导时有所增加。

进一步降低诱导温度至20℃，iptg浓度为0.2mmol/l，分别诱导12,10小时后，可使上清液中sigma-gst的表达量进一步增加，且诱导10小时比诱导12小时表达量更多。进一步缩短诱导时间至7小时，可使上清液中sigma-gst表达量更多，最后优化表达条件为20℃，iptg浓度为0.2mmol/l，诱导7小时，可使sigma-gst呈高效可溶性表达，占大肠杆菌可溶性总蛋白75%（见图3），故将此条件作为sigma-gst原核诱导表达的最优条件。

图3为细粒棘球绦虫sigma-gst在最佳诱导条件下的原核表达。其中，m：蛋白marker；1，bl21（de3）空菌诱导后上清；2，bl21（de3）-pet30a-sigma-gst上清原样。

实施例4细粒棘球绦虫sigma-gst的亲和层析纯化

应用hispurcobalt（clontech）纯化系统纯化目的蛋白。histalon^tmgravitycolumns预装柱购自日本clontech公司，型号为：635655。

在滴加各种物质时，滴加速度为1滴/10秒。

不同的纯化方法得到的重组蛋白的纯化效果不同，需要对纯化方法进行优化。以下为部分优化过程：

加入20ml超纯水于hispurcobalt预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入20mltris-结合缓冲液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0）,使其缓慢的流过柱内填充的介质；上样，加入4ml通过超声破碎e.colibl21(de3)-pet30a-sigma-gst提取的上清液,轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上，室温下轻轻振摇5分钟后控制流速使上清液缓慢流过柱内介质；加入40mltris-结合缓冲液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0）,控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入50mm/l咪唑-tris洗脱液（50mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入100mm/l咪唑-tris洗脱液（100mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入200mm/l咪唑-tris洗脱液（200mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入300mm/l咪唑-tris洗脱液（300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集；加入400mm/l咪唑-tris洗脱液（400mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其缓慢流过柱内介质并收集。将收集的洗脱液分别进行sds-page分析，检查蛋白的纯化程度，见图4中的a图。

图4为细粒棘球绦虫sigma-gsthispurcobalt亲和层析纯化结果。

其中，在a图中，m：marker；1，50mm/l咪唑-tris洗脱液；2，100mm/l咪唑-tris洗脱液；3，200mm/l咪唑-tris洗脱液；4，300mm/l咪唑-tris洗脱液；5，400mm/l咪唑-tris洗脱液。

由图4中的a图可见：用50mm/l咪唑-tris洗脱液并未将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，分别用100mm/l、200mm/l、300mm/l、400mm/l咪唑-tris洗脱液能够将目的蛋白洗脱下来，但是蛋白纯度不高，杂蛋白含量很高，故进一步优化蛋白纯化条件，使用以下方法进行纯化。

加入20ml超纯水于hispurcobalt预装柱中，使其缓慢的流过柱内填充的介质；加入结合缓冲液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）20ml；上样，加入4ml通过超声破碎e.colibl21(de3)-pet30a-sigma-gst提取的上清液，轻轻摇晃悬浮起介质，将该亲和柱置于摇床上轻轻振摇5分钟后，控制流速使上清液缓慢流过柱内介质；加入40ml漂洗缓冲液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使其缓慢流过柱内介质；加入1号洗脱液（50mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质；加入2号洗脱液（100mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质；加入3号洗脱液（200mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质；加入4号洗脱液（300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液；加入5号洗脱液（400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph7.4）2ml，使其缓慢流过柱内介质，并用5mlep管收集该洗脱液。将收集的4号和5号洗脱液分别进行sds-page分析，检查蛋白的纯化程度，最终得到纯度很高的sigma-gst，该蛋白分子量约为23.43kd。sds-page结果见图4中的b图。

在图4的b图中，m：marker；1，bl21（de3）-pet30a-sigma-gst上清原样；2，蛋白上样过柱后流穿液；3，收集的漂洗液；4，sigma-gst1号洗脱液；5，sigma-gst2号洗脱液；6，sigma-gst3号洗脱液；7，sigma-gst4号洗脱液；8，sigma-gst5号洗脱液。

由图4中的b图可知：4号和5号洗脱液的纯化效果较好，纯度高。

实施例5检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒

检测细粒棘球蚴病的elisa试剂盒包括以下组分：

1、包被抗原：以实施例4得到的纯化的重组蛋白为包被抗原，用ph9.6的0.05m/l碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度6μg/ml；

2、封闭液：5g脱脂奶粉溶于100mltbst中；

3、阴性对照：健康人血清，1:200稀释；

4、酶标二抗：过氧化物酶标记的羊抗人igg，1:10000稀释；

5、tmb显色液；

6、终止液：2mol/l浓硫酸。

实施例6细粒棘球绦虫sigma-gst的elisa检测

以纯化后的重组蛋白为抗原，对20份感染棘球蚴病人血清样品和20份健康人血清样品进行间接elisa检测。具体方法如下：

用ph9.6的0.05m/l碳酸盐缓冲液稀释纯化的重组蛋白至终浓度6μg/ml，每孔200μl包被96孔酶标板，4℃过夜；甩去孔中液体，以ph7.4的pbst洗板3次(5min/次)后每孔加入200μl封闭液（5g脱脂奶粉溶于100mltbst中），37℃封闭1小时。pbst洗板3次(5min/次)，每孔100μl分别加入细粒棘球蚴病患者和健康人血清（1∶200稀释），37℃温育1小时；pbst洗板3次，每孔100μl加入过氧化物酶标记的羊抗人igg（1：10000稀释），37℃温育1小时；pbst洗板3次，每孔100μl加入tmb显色液，37℃避光反应30分钟，每孔50μl加入2mol/l浓硫酸终止反应，测定吸光度（）值。以健康人血清的均值2倍加标准差为阳性判断值。elisa检测结果如表1所示，本发明的试剂盒对细粒棘球蚴病患者血清的诊断敏感性为95%（19/20），对细粒棘球蚴病有较好的免疫诊断价值。

表1细粒棘球绦虫sigma-gstelisa检测结果

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>兰州大学

<120>细粒棘球绦虫sigma-谷胱甘肽s-转移酶重组蛋白及其可溶性表达方法和纯化方法

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>813

<212>dna

<213>细粒棘球绦虫sigma-gst

<400>1

ccggggcacaaaagtagcatatactagttgcaccatcttcgagacagattagcaccacca60

gcatggatctacaacttaaacaggccaaattaagactgctttacttcaacattcgtggtc120

gcgcagagttgattcgactggtgctgaatgccgcggagaaggacttccaggatgtgcgtg180

taagtagcaccgagtggccctcactgaaggcccagatgcccttcaaccagctacctgtgc240

tggaagtcaccacgccgaggggtgagaaagttatgctcacggagagcatggccatcgctc300

gtctgctggcgcgcaccttcggcctctacagtgatgacgctgcagaagtctatctaattg360

agcgaatgaactctcttacaagttccctcttggaggaaatctacgccctgggcttgaaga420

aggtcgacagttttaaaaaattggttgaagcagagcacgtgcacgaatacatggacgcaa480

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ccgacctccaagtgatagttctaatcgacacgatggacaaatttcttgcgaacacgaaac600

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aaaaaaaaaaaaaaaacatgtcggccgcctcgg813

<210>2

<211>212

<212>prt

<213>人工蛋白

<400>2

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151015

ileargglyargalagluleuileargleuvalleuasnalaalaglu

202530

lysasppheglnaspvalargvalserserthrglutrpproserleu

354045

lysalaglnmetpropheasnglnleuprovalleugluvalthrthr

505560

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65707580

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859095

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100105110

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115120125

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145150155160

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180185190

valmetlysalalysproglyvalalaargtyrleuargserargpro

195200205

leuthraspphe

210