一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物【技术领域】。苯丙氨酸脱氨酶基因的克隆对采用酶法生物合成L-苯丙氨酸具有重要的作用。本发明所述的苯丙氨酸脱氨酶基因是通过提取粘红酵母的RNA，反转录获得全长的苯丙氨酸脱氨酶基因，该基因全长2121bp，编码705个氨基酸。本发明进一步扩大了苯丙氨酸脱氨酶基因资源，为分子改造苯丙氨酸脱氨酶，提高酶的稳定性和催化活性提供了科学依据。
【专利说明】一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在pH8.0时催化L-苯丙氨酸(L_phe)脱氨生成反式肉桂酸和氨，pHll.0时能催化逆向反应合成L-phe，工业上利用这一特性，生产人体必须氨基酸L-phe和甜味剂阿斯巴甜。PAL广泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是红酵母属中。其中粘红酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆柏，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，已经成功应用于食品、制药等工业领域。但是由于该酶是诱导酶，在对数生长期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差。
[0003]为进一步提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，但到目前为止，仅仅获得PAL的部分cDNA，缺少5’端的基因序列。由于该基因的5’端序列的GC含量高，容易形成发夹结构，传统的反转录很难成功。
[0004]为此，本发明提供了一种粘红酵母PAL全长的基因序列，经表达，获得4.2U/mgPAL。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0006]所述苯丙氨酸脱氨酶基因是以工业生产用菌株粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的cDNA，最终获得全长为2121bp的基因序列，编码706个氨基酸，酶活达到4.2U/mg，是目前已报到的最高酶活。
[0007]苯丙氨酸脱氨酶基因编码的苯丙氨酸脱氨酶可用于催化生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。
[0008]本发明要解决的第二个技术问题是提供一种表达所述苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌。优选以大肠杆菌为宿主，以 pET-22b (+)、pET-23 (+)、pET_28a (+)或 pET_20b (+)为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化 E.coli BL21。
[0009]本发明要解决的第三个技术问题是提供一种表达所述基因获得苯丙氨酸脱氨酶的方法。优选以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23 (+)、pET-28a(+)或pET_20b (+)为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21后诱导表达该基因。
[0010]所述方法进一步优选将带有pET-28-pal的重组大肠杆菌培养至0D_为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM,于24°C培养12h后离心收集菌体，用含有1mM的咪唑、150mM氯化钠，pH7.5的50mM的磷酸缓冲液洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30min后离心收集上清，上清用带有His标签的亲和层析柱纯化，用含250mM咪唑、150mM NaC, pH7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱脱盐得到纯化后的PAL。
[0011]本发明提供了一种完整的新的粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，编码的苯丙氨酸脱氨酶酶活达到4.2U/mg，是目前已报到的最高酶活。该基因的获得为进一步利用分子生物学手段对酶进行改造，以提高酶活及其稳定性提供了基础。所得苯丙氨酸脱氨酶及相应基因工程菌都可以应用于生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为粘红酵母总RNA的电泳图。
[0013]图2为反转录后PCR扩增全长基因的电泳图。
[0014]图3为粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的阅读框及翻译的氨基酸序列。
[0015]图4为重组酶的表达；M,蛋白marker ；1,不带重组质粒pET-28-pal的E.coilBL21全细胞电泳；2，带重组质粒pET-28-pal，未用IPTG诱导的E.coil BL21全细胞电泳；3，带重组质粒pET-28-pal，IPTG诱导的E.coil BL21全细胞电泳。
[0016]图5SDS-PAGE检测纯化的蛋白；M，为蛋白marker ;1，全细胞电泳；2，采用His纯化柱纯化后获得的PAL。
[0017]图60.5mM反式肉桂酸标样的HPLC图(出峰时间为6.35min)。
[0018]图7重组酶催化L-苯丙氨酸后HPLC分析(在6.25min出现产物峰，与标样出峰时间一致)。
【具体实施方式】
[0019]实施例1提取粘红酵母总RNA
[0020](I)以工业生产用菌株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CCTCC N0:M2011490为出发菌株，从粘红酵母平板上挑取单菌落至5mL的种子培养基中于30°C培养24h后，取50 μ L的种子液至装有50mL培养基的250mL三角瓶中，30°C培养18_20h至OD6tltl = 1.0，1500g离心5min收集菌体，用冷水将菌体洗涤2次，弃上清。
[0021](2)用 400μ L 的 TES(10mM Tris-HCI, 1mM EDTA,0.5% SDS, pH7.5)缓冲液重悬细胞，加入400 μ L酸性酚，剧烈震荡10sec，65°C温育lh，不时用涡旋振荡器短暂震荡。
[0022](3)冰育 5min,于 4°C, 12000g 离心 5min。
[0023](4)将水相移至另一 1.5mL的离心管中，加入400 μ L酸性酚，剧烈震荡lOsec，重复步骤(3)。
[0024](5)将水相移至另一 1.5mL的离心管中，加入氯仿，剧烈震荡lOsec，于4°C，12000g离心5min。
[0025](6)将水相移到新的1.5mL离心管中，加入40 μ I的3Μ NaAc及Iml冰冷的无水乙醇，于 4°C，12000g 离心 5min。
[0026] (7)加入lmL，75%乙醇快速震荡洗涤RNA沉淀。
[0027](8)沉淀于无菌操作台上风吹15min至酒精挥发完全，加入经DEPC处理的无菌水50 μ L重悬，-80°c保藏备用，采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量(图1)。
[0028]实施例2反转录获得cDNA
[0029](I)于 0.5mL 的离心管中加入 50ng 总 RNA，lyL5’ _CDS(5’ -(T)25VN(N=A, C, G, T ；V = A，G，C)-3，)和 IyL SMARTer II A Oligonucleotide (5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGGGGG - 3’)，加水至 4.75 μ L 混匀。
[0030](2) 72°C温育 3min 后于 42°C温育 2min，1500g 离心 lOsec。
[0031](3)力卩 Λ 2μ L5Xbuffer (250Mm Tris-HCI, 375mM KCl, 30mM MgCl2)，I μ L 的DTT (20mM)，I μ L dNTP (1mM)，0.25 μ L RNase 抑制剂和 I μ L SMARTer? 反转录酶，42。。温育90min后于70°C变性lOmin，冷却至室温加入20 μ L无菌水，获得cDNA。
[0032]实施例3获得pal5’端的序列
[0033](I)往 0.25mL 的离心管加入 I μ L cDNA、5 μ L Mix 引物(5，-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’ ；5’ - CTAATACGACTCACTATAGGGC - 3’)，I μ L GSP 特异性引物(5，-GGTGATGCCG TGGTTG AGGAAGTT-3'), 5 μ LlO Xbuffer, 5 μ L dNTP (2mM)，0.5 μ Lpfu DNA聚合酶，3 μ L MgSO4 (25mM)，加去离子水至50 μ L。
[0034](2)进行PCR扩增，PCR扩增条件:94 V预变性4min，94 V变性Imin，58 °C退火30sec,72°C延伸60sec,2 5个循环,琼脂糖凝胶电泳检测。
[0035](3)往 0.25mL 的离心管中加入 5 μ L PCR 产物，I μ LlOXTaq buffer, I μ LdATP (2mM), I μ L Taq SI (5U/ μ L)加水至10 μ L，70°C反应30min后酚仿抽提，乙醇沉淀，无菌操作台风吹15min至酒精挥发完全，用10 μ L无菌水重悬。
[0036](4)取上一步反应液 5 μ L，加入 I μ L 连接 buffer，lyL50% PEG, I μ L pUCm-T 载体，IyL T4连接酶，加去离子水至10 μ L，于16 °C过夜连接。
[0037](5)取连接产物 10 μ L，10 μ L5 X KCM (0.5Μ KCl，0.15Μ CaCl2, 0.25Μ MgCl2)，去离子水30 μ L，加至50 μ L的E.coli JM109感受态中，冰浴30min，42°C热击90sec，冰浴2min，加入100 μ L的新鲜LB培养基，37°C培养30_60min，取100 μ L涂布含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB平板，37°C培养10h，挑取单菌落，接入5mL含50ug/mL的氨苄青霉素LB培养基中37°C培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得5’端的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0038]实施例4构建克隆载体pUCm-T-pal
[0039](I)根据步骤3获得的5’端序列，设计一对特异性引物(primer F:5’-GGAATTCCATATGATGGCCCCC TCCGTCGACTCGATC-3’ ；primer R:5’-CGGAATTCCTAGTATGGTCTACGTCCAAAGG-3’),0.25mL 的离心管加入 I μ L cDNA, primer F 和 R 各 I μ L，5μ L10Xbuffer,5y L dNTP(2mM),0.5 μ L pfu DNA 聚合酶，加去离子水至 50 μ L。
[0040](2)进行PCR扩增，PCR扩增条件:94 V预变性4min，94 V变性Imin，58 °C退火30sec，72°C延伸2min，25个循环，琼脂糖凝胶电泳检测(图2)。
[0041](3)参照实施例3，将扩增到全长基因序列与pUCm-T连接，转入E.coli JM109，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，挑单菌落至LB培养基中37°C培养10h，取2mL菌液提质粒进行测序，获得全长的序列，采用PCR验证构建的pUCm-T-pal，分析阅读框(图3)，从图中可知该酶的阅读框全长2121bp，编码706个氨基酸。
[0042]实施例5构建表达载体pET_28a (+) -pal表达PAL
[0043]Ndel和EcoRl分别对pUCm-T-pal和空载体pET_28a(+)进行双酶切，胶回收后于16°C连接过夜，转化E.coli JM109，在含有卡那霉素抗性的LB平板挑阳性重组子，提取重组质粒并进行PCR和双酶切验证，阳性克隆即pET-28a(+) -pal。
[0044]取IyL pET-28a(+)-pal，转入 E.coli BL21，取 100 μ L 涂布含有卡那霉素(50 μ g/mL)的LB平板，37°C培养10h，挑取单菌落至5mL的LB培养基中37°C培养10h，取ImL培养液至10mL的LB培养基中37°C培养至OD6tltl为0.6时加入终浓度为0.4mM的IPTG，26°C诱导表达12h后离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测表达情况，结果见图4，从图中可知，该基因成功表达。目的条带的分子量70kD左右，与理论分子量大小一致。
[0045]实施例6重组PAL的纯化
[0046]将带有pET-28a(+)_pal的重组大肠杆菌培养至OD6tltl为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM,于24°C培养12h后离心收集菌体，用50mM的磷酸缓冲液(含有1mM的咪唑，150mM氯化钠，pH7.5)洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30min后离心收集上清，上清用带有His标签的亲和层析柱(HisTrap FF crude column ImL)纯化,用含58.3%咪唑的磷酸缓冲液(250mM咪唑，150mM NaC，pH7.5)进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱(HiPrep26/10desalting column)脱盐。SDS-PAGE检测纯化的蛋白，结果如图5,从图中可知，获得高纯度的PAL蛋白，蛋白的大小与理论一致。
[0047]实施例7 HPLC测定酶的活性
[0048]取适量的实施例6得到纯酶与40mM的L-苯丙氨酸于40°C下反应30min后加入50%的甲醇终止反应,反应结束后用0.22 μ m的纤维素膜过滤后进行HPLC分析。HPLC测定条件:日立C18柱，50%甲醇作为流动相，流速0.5ML/min,进样10 μ L。标准样品及酶催化后的HPLC图谱如图6和7，从图中可知，该重组酶具有催化苯丙氨酸生成肉桂酸的功能。纯酶的比酶活达到4.2U/mg，是目前已报道的最高活性。
[0049] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
【权利要求】
1.一种苯丙氨酸脱氨酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述基因编码的苯丙氨酸脱氨酶。
3.携带权利要求1所述基因的载体、重组细胞或基因工程菌。
4.一种获得权利要求1所述基因的方法，其特征在于，以粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的cDNA，最终获得全长基因序列。
5.一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的基因工程菌，其特征在于，将苯丙氨酸脱氨酶基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coliBL21，筛选获得阳性菌株。
6.一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的方法，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以 pET-22b (+)、pET-23 (+)、pET_28a (+)或 pET_20b (+)为表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将编码丙氨酸脱氨酶的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化Ε.coli BL21后诱导表达该基因。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将带有pET-28a(+)-pal的重组大肠杆菌培养至0D_为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM,于24°C培养12h后离心收集菌体；用含有1mM的咪唑 、150mM氯化钠、pH7.5的50mM的磷酸缓冲液洗涤，然后超声波破碎细胞后离心收集上清；上清用带有His标签的亲和层析柱纯化，用含250mM咪唑、150mM NaCl,PH7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；将收集的目的蛋白脱盐得到纯化后的PAL。
9.权利要求2所述苯丙氨酸脱氨酶在生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。
10.权利要求5所述基因工程菌在生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。
【文档编号】C12N15/10GK104131017SQ201410362681
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】周哲敏, 朱龙宝, 崔文璟, 周丽 申请人:江南大学