郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其编码基因，所述蛋白质为如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ?ID?NO.1所示的核酸序列。本发明为今后利用基因工程技术调控郁金香TfPAL基因的时空表达特性，从而调控花色提供了理论依据，具有实践应用价值。
【专利说明】郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子生物学领域，涉及郁金香花色苷合成途径中的关健酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其编码基因。
【背景技术】
[0002]苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-1yase, PAL)为植物苯丙烷类物质代谢途径的关键酶(Okada等，2008)，是连接初生代谢和次生代谢的纽带，它在类黄酮、黄酮醇、花青素、单宁、异黄酮、黄烷酮、木质素、香豆素、芥子酸酯和水杨酸等次生代谢产物合成中起着重要作用，这些物质涉及植物生长发育、抗虫抗病、信号转导、紫外线防御和花粉育性等方面(Dixon等，2002)，因此PAL与植物有着十分密切的关系，是近年来的研究热点。
[0003]近年来，已有研究者对包括凤仙花、尾穗苋、甜叶菊、甘薯、玉米、棉花和桃在内多种植物的PAL活性进行了研究，结果表明:(I)PAL的活性与植物花色苷含量明显正相关。
(2)强光、激素、低温、机械损伤及病虫害侵染都可以诱异PAL活性升高。(3)PAL活性与组织中氮素含量呈负相关。具体到PAL活性与花色苷合成的关系，Arakawa认为，活性受光调节的PAL才是花色苷合成的关键酶(Arakawa 0，1988)。苹果果皮中PAL活性的增加伴随着花色苷含量的增加，但可能不是控制花色苷的唯一关键酶(周爱琴等，1997)。另有研究证实乙烯可以通过诱导PAL活性而提高花色苷合成量(Cheng G和Breen P, 1991)
[0004]PAL基因在植物中以多基因家族的形式存在，覆盆子中至少有2个基因成员，拟南芥中有4个成员，番爺中至少有26个,而马铃薯(Solanum tuberosum)中更多,估计有40~50 个(Chang 等 2008 Joos 和 Hahlbrock, 1992 ；Kumar 和 Ellis, 2001)。PAL 存在于所有绿色植物中，已从水稻、小麦、玉米等多种植物中得到分离纯化，真菌和藻类细胞中也有发现(Heilmann 和 Mer fort, 1998)。但郁金香(Tulipa fosteriana)中 PAL 基因的克隆及其表达模式尚不清楚。目前，未有任何与郁金香PAL蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白及其编码基因。本发明提供了一种郁金香TfPAL蛋白序列，以及一种编码上述蛋白质的核酸序列；公开了郁金香TfPAL蛋白及其核苷酸序列在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式；为今后利用基因工程技术调控郁金香TfPAL基因的时空表达特性，从而主调控花色提供了理论依据，具有一定的应用价值。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的，
[0007]第一方面，本发明涉及一种具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵花瓣的不同着色阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。[0008]优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0009]进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0010]第二方面，本发明涉及一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0011]优选的，所述核酸序列具体为:
[0012](a)碱基序列如SEQ ID N0.1第I~2136位所示；
[0013]或(b)与SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0014]或(c)能与SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸进行杂交的序列。
[0015]优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
[0016]本发明提供的分尚出的DNA分子,该分子包括:具有SEQ ID N0.1所不核苷酸序列的DNA分子；或者编码具有郁金香TfPAL蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且与SEQ IDN0.1所示序列有至少70%的同源性；或者能与SEQ ID N0.1所示序列的核苷酸序列杂交。
[0017]在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0018]在本发明中，术语“郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白编码基因”指编码具有郁金香TfPAL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.1所示序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.1所示序列的同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.1所示序列中从核苷酸第I~2136位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0019]该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfPAL相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
[0020]在本发明中，术语“郁金香苯丙氨酸解氨酶TfPAL蛋白”是指具有郁金香TfPAL蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfPAL相关相同功能的、SEQ ID N0.2所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfPAL蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0021]本发明的郁金香TfPAL多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfPAL相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfPAL多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0022]在本发明中，“郁金香TfPAL保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.2所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0023]表1
[0024]
【权利要求】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香苯丙氨酸解氨酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所 述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码如权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为: (a)喊基序列如SEQ ID N0.1第I~2136位所不； 或(b)与SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能与SEQ ID N0.1第I~2136位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID N0.1第I~2136位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
【文档编号】C12N9/88GK103695406SQ201310689303
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红, 陶秀花 申请人:上海交通大学