郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白及其编码基因；所述蛋白质为如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或如SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香黄酮醇合成酶活性的蛋白质。本发明还提供了一种编码上述蛋白质的如SEQ?ID?NO.1所示的核酸序列。本发明的郁金香黄酮醇合成酶TfFLS基因，在大肠杆菌细胞中表达重组的黄酮醇合成酶蛋白，能使二氢山奈酚生成山奈酚，表明具有黄酮醇合成酶的功能。利用本发明的郁金香TfFLS基因，通过各种常规筛选方法，可筛选出与TfFLS发生相互作用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。
【专利说明】郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白及其编码基因【技术领域】
[0001]本发明属于植物分子生物学领域，涉及郁金香类黄酮合成途径中关健酶及其编码基因，具体涉及一种郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白及其编码基因。
【背景技术】
[0002]类黄酮化合物是一类多酚类化合物，广泛存在于自然界，根据对中心C环的不同修饰，可分为黄酮、异黄酮、黄烷酮、黄酮醇、黄烷醇和花青素等主要大类，其中以黄酮醇类化合物最为常见，占黄酮类化合物总数的1/3左右。黄酮醇类化合物广泛地分布于多种植物中，它们是几种与细胞内信号传导和细胞转化有关激酶的抑制剂，具有多种生物活性，由于它们能够有选择地阻断细胞内信号传导通路，因此黄酮类化合物被认为是治疗肿瘤的潜在的化合物。黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)是类黄酮合成途径中黄酮醇合成的直接调控酶，它催化黄酮结构中的C3位羟基化，从而形成各种黄酮醇类物质，决定着黄酮醇的合成。因此FLS基因是研究黄酮代谢调控中的关键基因之一。
[0003]类黄酮同时为花色素的一大类，它使花朵产生从黄到紫的全部颜色。黄酮醇一般为黄色或无色，能作为辅助色素影响花色。FLS基因的表达可直接影响植物的花色。在矮牵牛中，黄酮醇合成酶可通过影响共色素合成或底物竞争方式，改变黄酮醇与花色苷的比例，从而改变花色(Mol J等，1998)。藏报春(Primulasinensis Sabine ex L.)黄酮醇产生受基因B控制，含有共色素的花色为紫色，缺少黄酮醇的花色为绛紫色(Forkman G，1991)。矮牵牛中，增加黄酮醇合成酶基因的表达通常会使花显蓝色，反义表达FLS eDNA则使花色明显变淡(Holton TA 等，1993)。
[0004]目前，人们已在矮牵牛(Petuniahybrida)、马铃薯(Solanum tuberosum)、苹果(Malus pumila)、蜜柑(citrus)、葡萄(Vitis vinifera)、银杏(Ginkgo biloba)等植物中克隆了 FLS基因，但郁金香(T`ulipa fosteriana)中黄酮醇合成酶基因的克隆及其表达模式尚不清楚。目前，未有任何与郁金香FLS蛋白及其编码基因序列相关的文献报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白及其编码基因。本发明公开了郁金香TfFLS编码基因在郁金香不同器官、不同发育阶段的表达模式；本发明的郁金香TfFLS基因在大肠杆菌细胞中表达重组的黄酮醇合成酶蛋白，能使二氢山奈酚生成山奈酚。利用本发明的郁金香TfFLS基因，通过各种常规筛选方法，可筛选出与FLS发生相互用的物质、受体、抑制剂或拮抗剂等。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的，
[0007]第一方面，本发明涉及一种具有郁金香黄酮醇合成酶活性的蛋白质，所述蛋白质是由如SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或由SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香黄酮醇合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该蛋白质在花朵花瓣的不同着色阶段、不同器官内的有无及活性大小存在较大差异。
[0008]优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
[0009]进一步优选的，所述蛋白质为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
[0010]第二方面，本发明涉及一种编码上述蛋白质的核酸序列。
[0011]优选的，所述核酸序列具体为:
[0012](a)碱基序列如SEQ ID N0.1第I~999位所示；
[0013]或(b)与SEQ ID N0.1第I~999位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；
[0014]或(c)能与SEQ ID N0.1第I~999位所示的核酸进行杂交的序列。
[0015]优选的，所述核酸序列具体为SEQ ID N0.1第I~999位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
[0016]第三方面，本发明涉及一种上述的核酸序列在制备重组黄酮醇合成酶中的用途。
[0017]优选的，所述制 备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，得到重组黄酮醇合成酶
[0018]第四方面，本发明涉及一种重组黄酮醇合成酶，所述重组黄酮醇合成酶是通过如下方法制备而得的:构建含上述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，即得所述重组黄酮醇合成酶。
[0019]本发明提供的分尚出的DNA分子,该分子包括:具有SEQ ID N0.1所不核苷酸序列的DNA分子；或者编码具有郁金香TfFLS蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且与SEQ IDN0.3所示序列有至少70%的同源性；或者能与SEQ ID N0.1所示序列的核苷酸序列杂交。
[0020]在本发明中，“分离的DNA”、“纯化的DNA”是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。
[0021 ] 在本发明中，术语“郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白编码基因”指编码具有郁金香TfFLS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID N0.1所示序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID N0.1所示序列的同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列。该术语还包括与SEQ ID N0.1所示序列中从核苷酸第I~999位的核苷酸序列的同源性至少70%的核苷酸序列。
[0022]该术语还包括能编码具有与天然的郁金香TfFLS相同功能的蛋白的SEQ ID N0.1所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加为60个以内核苷酸。
[0023]在本发明中，术语“郁金香黄酮醇合成酶TfFLS蛋白”是指具有郁金香TfFLS蛋白活性的SEQ ID N0.2所示序列的多肽。该术语还包括具有与天然郁金香TfFLS相关相同功能的、SEQ ID N0.2所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):通常为I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或为20个以内氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括郁金香TfFLS蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0024]本发明的郁金香TfFLS多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与郁金香TfFLS相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用郁金香TfFLS多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0025]在本发明中，“郁金香TfFLS保守性变异多肽”指与SEQ ID N0.2所示序列的氨基酸序列相比，有至多10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
[0026]表1
[0027]
【权利要求】
1.一种如下(a)或(b)的蛋白质: (a)由如SEQID N0.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)SEQID N0.2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有郁金香黄酮醇合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.2所示氨基酸序列经过I~50个氨基酸的缺失、插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加I~20个以内氨基酸而得到的序列。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征是，所述蛋白质为SEQID N0.2所示氨基酸序列中I~10个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的序列。
4.一种编码权利要求1所述蛋白质的核酸序列。
5.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为: (a)喊基序列如SEQ ID N0.1第I~999位所不； 或(b)与SEQ ID N0.1第I~999位所示的核酸有至少70%的同源性的序列； 或(c)能与SEQ ID N0.1第I~999位所示的核酸进行杂交的序列。
6.如权利要求4所述的核酸序列，其特征是，所述核酸序列具体为SEQID N0.1第I~999位所示的核酸序列中I~90个核苷酸的缺失、插入和/或取代，或者在5’和/或3’端添加60个以内核苷酸形成的序列。
7.—种如权利要求4所述的核酸序列`在制备重组黄酮醇合成酶中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述制备包括如下步骤:构建含所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，得到重组黄酮醇合成酶。
9.一种重组黄酮醇合成酶，其特征在于，所述重组黄酮醇合成酶是通过如下方法制备而得的:构建含如权利要求4所述核酸序列的原核表达载体，将所述原核表达载体转化到大肠杆菌中，诱导培养，即得所述重组黄酮醇合成酶。
【文档编号】C12N9/06GK103756982SQ201310689297
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年12月16日 优先权日:2013年12月16日
【发明者】袁媛, 史益敏, 唐东芹, 马晓红, 陶秀花 申请人:上海交通大学