重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法
【专利摘要】本发明公开一种重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法，是对其成熟肽编码区进行密码子优化，采用重叠PCR单向延伸方法获得经优化的Defb-1蛋白成熟肽编码序列，连入pET-32a(+)载体，获得重组表达质粒，并转化至大肠杆菌TransB（DE3）感受态细胞中；通过IPTG诱导获得重组蛋白的可溶性表达；利用重组蛋白含有的His标签，对重组蛋白进行鉴定和纯化，可以快速高效获得重组红鳍东方鲀抗菌肽。不仅操作简单，降低制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏，重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，表达产物可用于制作饲料添加剂、产品保鲜剂和医药产品等。
【专利说明】重组红鳍东方鈍抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物基因工程【技术领域】，尤其涉及一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业规模化生产的重组红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法。
【背景技术】
[0002]红鳍东方飩(/?济/在我国主要分布于黄海、渤海和东海，是近海底层肉食性鱼类，其肉味鲜美，具有很高的食用价值，在红鳍东方飩的生殖腺和肝脏等内脏中产生河豚毒素，其高活性和高特异性的生物特征具有潜在的医药开发价值，在临床上具有广阔的前景。抗菌肽是一类具有杀菌抑菌功能的小分子多肽，红鳍东方飩抗菌肽Defb-1对革兰氏阴性菌和阳性菌都有较好的抑菌杀菌功效，同时还会增强鱼体的免疫反应；而其本身又是一种鱼源多肽，不会残留，不会引发生态问题。然而，从红鳍东方飩中直接提取该蛋白的操作复杂、成本高、产量少，不能大规模产业化生产。
【发明内容】
[0003]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本低廉、重组蛋白纯度好、得率高、适应于工业规模化生产的重组红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种重组红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法，其特征按如下步骤进行:
a.以pET32a+载体为模板，用引物pETF19/pETR19进行PCR扩增；所述引物pETF19/pETR19序列如下:`
PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，；
b.以a步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物76F20/pETR19进行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ；
c.以b步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物50F21/pETR19进行PCR扩增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ；
d.以c步骤反应产物的20倍稀释液为模版，用引物25F21/pETR19进行PCR扩增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ；
e.以d步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物NcoIF/XhoIR进行PCR扩增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下:
上游引物 NcoIF:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；下游引物 XhoIR:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ；
f.电泳回收e步骤PCR产物与克隆载体pMD19T连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5ci，再涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB固体平板上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择120bp大小的条带进行回收；
g.用限制性内切酶AfcoI和通ol分别双酶切f步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5 α进行培养并筛选提取重组表达质粒；
h.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)大肠杆菌感受态细胞内，挑取单克隆经IPTG诱导后收集菌体；
1.将收集的菌体用pH8.0、0.5M Tris-HCl缓冲溶液重悬，进行超声波破碎，离心取上清，过N1-TNA柱纯化，收集洗脱液；
j.将洗脱液透析，获得重组表达蛋白。
[0005]所述a步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述b步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述c步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，59°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述d步骤的PCR反应条件为`:94°C预变性5min，94°C变性30s、60°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述e步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存。
[0006]本发明设计了针对红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白编码序列的引物，对其成熟肽编码区进行密码子优化，采用重叠PCR单向延伸方法获得经优化的Defb-1蛋白成熟肽编码序列，连入pET-32a(+)载体,获得重组表达质粒，并转化至大肠杆菌TransB (DE3)感受态细胞中；通过IPTG诱导获得重组蛋白的可溶性表达；利用重组蛋白含有的His标签，对重组蛋白进行鉴定和纯化，可以快速高效获得重组红鳍东方飩抗菌肽。不仅操作简单，降低制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏，重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，表达产物可用于制作饲料添加剂、产品保鲜剂和医药产品等。
【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为本发明实施例的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0008]图2为本发明实施例的重组表达产物SDS-PAGE凝胶电泳图及Western bloting鉴定结果。
[0009]图3为本发明实施例纯化后重组蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。
[0010]图4为本发明实施例重组蛋白的Elisa鉴定结果。
【具体实施方式】
[0011]按如下步骤进行:a.以pET32a+载体为模板，用引物pETF19/pETR19进行PCR扩增；所述引物pETF19/pETR19序列如下:
PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，；
PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C复性30s、72°C延伸20s，循环30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
b.以a步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物76F20/pETR19进行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ；
PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C复性30s、72°C延伸20s，循环30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
c.以b步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物50F21/pETR19进行PCR扩增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ；
PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，59°C复性30s、72°C延伸20s，循环30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
d.以c步骤反应产物 的20倍稀释液为模版，用引物25F21/pETR19进行PCR扩增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ；
PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、60°C复性30s、72°C延伸20s，循环30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
e.以d步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物AfcoI/ZAoI进行PCR扩增，所述引物AfcoI/lSoI序列如下:
上游引物Afco1:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；
下游引物IAo1:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ；
PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s、72°C延伸20s，循环30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
a^e步骤PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示:图1中1、2、3、4分别为a、b、
c、d步骤延伸PCR产物，5为e步骤扩增反应产物，M为DL2000bp ；
f.电泳回收e步骤PCR产物与克隆载体pMD19T连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5ci，再涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB固体平板上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择120bp大小的条带进行回收；
按照现有技术方法，对所回收的PCR产物进行测序，其序列如下:ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTGC
与天然红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白成熟肽区域序列对比，可以看出:经密码子优化的DNA序列中，第3号氨基酸Pro (CCC)替换为Pio (CCA)，第7号氨基酸Gly (GGA)替换为Gly (GGC)，第10号氨基酸Arg (AGA)替换为Arg (AGG)，第15号氨基酸Pro (CCC)替换为Pro (CCA)，第19号氨基酸Phe (TTC)替换为Phe (TTT)，第21和26号氨基酸Gly (GGA)替换为 Gly (GGG)，第 28 号氨基酸 Gly (GGA)替换为 Gly (GGC)；
g.用限制性内切酶AfcoI和通ol分别双酶切f步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断按摩尔比10:1比例混匀，用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5ci进行培养并挑选单克隆菌落，筛选用T7promoter/ T7 terminator primer通用引物菌检结果为765bp的阳性克隆,提取重组表达质粒;
h.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)大肠杆菌感受态细胞内，接种于100ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm培养至菌液OD6tltl为
0.6时，向菌液中加入IPTG至总浓度为0.5mM，于4°C培养6h，4°C 6000rpm离心，富集菌体，弃上清，得菌体；
1.将收集的菌体用pH8.0、0.5M Tris-HCl缓冲溶液重悬，将重悬菌体于超声波破碎(750W 9s/9s 4°C) 25min，将破碎产物于12000rpm 4°C离心20min，取上清。对上清夜进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting鉴定(电泳步骤参见蛋白质技术册),结果如图2所示=M为蛋白Maker，O为pET32a+载体转化TransB (DE3)宿主菌诱导后结果，A为重组表达载体转化TransB (DE3)宿主菌诱导后结果，NC膜为Western blotting鉴定结果；结果表明:重组表达载体表达框正确，表达产物为目的表达产物。
[0012]将上清液加入事先平衡好的N1-NTA柱子中过柱吸附，3倍柱体积Washing Buffer过柱洗漆，IOmL Elution Buffer过柱洗脱,收集洗脱液(具体步骤参见蛋白手册)；对洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图3所示:M为蛋白Maker，I为纯化后的重组蛋白；结果表明:纯化结果为目的融合蛋白，且纯度好，得率高； k.将收集的洗脱液充入透析袋中于缓冲液中，4°C透析过夜，收集透析产物。
[0013]对透析产物进行Elasa检测(具体步骤参见蛋白质技术手册)，以Ant1-Defensinbeta2抗体为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG为二抗的直接Elisa反应；检测结果如图4所示:A、B、C、D、E 和 F 分别为 20/200，40/200，60/200，80/200，100/200 和 200/200 稀释度重组蛋白样品；G为1%小牛血清蛋白对照；注20/200为20 μ L重组蛋白样品稀释至200 μ L。结果表明=Elisa反应OD492结果与重组蛋白样品浓度呈正相关，结果表明:重组蛋白样品构象正确。
[0014]按现有技术对透析产物进行测序，结果为与天然重组红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白相同。
【权利要求】
1.一种重组红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法，其特征按如下步骤进行: a.以pET32a+载体为模板，用引物pETF19/pETR19进行PCR扩增；所述引物pETF19/pETR19序列如下: PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，； b.以a步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物76F20/pETR19进行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ； c.以b步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物50F21/pETR19进行PCR扩增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ； d.以c步骤反应产物的20倍稀释液为模版，用引物25F21/pETR19进行PCR扩增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ； e.以d步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物NcoIF/XhoIR进行PCR扩增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下:
上游引物 NcoIF:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；
下游引物 XhoIR:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ； f.电泳回收e步骤PCR产物与克隆载体PMD19T连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5ci，再涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB固体平板上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择120bp大小的条带进行回收； g.用限制性内切酶AfcoI和通ol分别双酶切f步骤所回收产物的质粒和表达载体pET-32a(+)，将得到的两种目的基因片断用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5 α进行培养并筛选提取重组表达质粒； h.将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)大肠杆菌感受态细胞内，挑取单克隆经IPTG诱导后收集菌体； 1.将收集的菌体用pH8.0、0.5M Tris-HCl缓冲溶液重悬，进行超声波破碎，离心取上清，过N1-TNA柱纯化，收集洗脱液； j.将洗脱液透析，获得重组表达蛋白。
2.根据权利要求1所述重组红鳍东方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法，其特征在于: 所述a步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，56°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述b步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，58°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述c步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，59°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述d步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、60°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72°C延伸7min，4°C保存；` 所述e步骤的PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s、72°C延伸20s，循环30次，72℃延伸7min，4℃保存。
【文档编号】C12N15/12GK103773772SQ201310689151
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】仇雪梅, 徐进, 王秀利, 姜志强, 高长富 申请人:大连海洋大学