使用源自Idiomarina loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙 ...的制作方法
【专利说明】使用源自Idiomarinaloihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉 桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法
[0001] 本申请是申请号为200780033815. 8的中国专利申请的分案申请，原申请是国际 申请PCT/EP2007/007945的中国国家阶段申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及制备对映异构体富集的（enantiomericallyenriched)苯丙氨酸化合 物的方法，其中使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与氨基供体反应。
【背景技术】
[0003] 对映异构体富集的苯丙氨酸化合物是例如药物制品的重要中间体，尤其是在对血 管紧张素I转化酶抑制剂（ACE)的制备中，ACE被用于治疗高血压（highbloodpressure， 也作hypertension)。例如，光学活性的（S)_吲噪啉-2-羧酸（(S)-indoline-2_carboxylic acid)(可通过（S)-2_氯苯丙氨酸闭环制备）可用于制备[2S_[1[R*(R*)，2a, 3ab, 7ab] ]-l-[2-[[l-(乙氧羰基）丁基]氨基]-1-氧代丙基]八氢-1H-吲哚-2-羧酸，后者也 作为商品名培噪普利（Perindopril)已知，其可用作抗高血压药（ACE抑制剂）或强心 药（cardiotonic)活性成分。其它有用的应用为例如喷托普利（Pentopril)和Π引噪普利 (Indolapril)〇
[0004] 从W02006/069799A1可获知制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，其 中在一个特定的实施例中，通过在存在来自R.glutinis的苯丙氨酸氨裂解酶（PAL)时将 3-(2-氯-苯基）丙稀酸与水性NH3反应，来制备（S)-2-氨基-3-(2-氯-苯基）-丙酸。来 自Rhodotorulaglutinis的氨基酸序列可见W0 01/11071A2 和本文的SEQIDN0.9。
[0005] W02006/069799A1中所述工艺的缺点是发生底物抑制。因此，该工艺需要在低浓 度下运行。因此为了生产可接受量的产物，需要大体积或复杂的补料方案，使得从商业观点 来看该工艺较不吸引人。
[0006] 因此，提供下述工艺是本发明的一个目的，所述工艺用于制备苯丙氨酸化合物，其 中底物抑制被降低。
【发明内容】
[0007] 该目的已通过工艺方法达成，所述工艺用于制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合 物，其使相应的肉桂酸在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与氨基供体反应，所述苯丙氨 酸解氨酶与SEQIDN0. 4具有至少50%的序列同一性。
[0008] 因此，本发明的工艺提供了用于制备苯丙氨酸化合物的改进的和/或有商业吸引 力的工艺。通过使用与SEQIDN0. 4具有至少50%的序列同一性的PAL，底物抑制得以降低 (即随着底物浓度的提高，酶最初活性的降低）。另外，在E.coli中容易地过表达了与SEQ IDN0. 4具有至少50%同一性的苯丙氨酸解氨酶（PAL)。与SEQIDN0. 4具有至少50%同 一性的PAL与来自R.glutinis的PAL相比的另一优点是它们具有更高的活性。
[0009] 在使用CloneManager6(6.00 版/alignPlus4,4.10 版 (Scientific&EducationalSoftware))的序列比对研究中，使用BL0SUM62作为评分矩阵 来测定本文定义的％同一性。
[0010] 优选地，在本发明的工艺中，使用的PAL与SEQIDN0. 4具有至少50%，更优选地 至少53 %，更优选地至少55 %，更优选地至少57 %，进一步更优选地至少60 %，进一步更优 选地至少62 %，进一步更优选地至少65 %，进一步更优选地至少70 %，尤其是至少75 %，更 尤其是至少80 %，更尤其是至少85 %，更尤其是至少90 %，进一步更尤其是至少95 %，进 一步更尤其是至少97%，进一步更尤其是至少98%，进一步更尤其是至少99%，最尤其是 100 %的序列同一性。
[0011] 本发明工艺中可使用的PAL序列可由本领域技术人员容易地鉴定，例如在数据库 (例如NCBI数据库）中使用BLAST搜索。编码这些PAL序列的核酸序列可容易地被鉴定， 例如使用可通过NCBI的BLAST获得的程序来进行。或者，也可以按照针对期望的宿主细胞 来说优选或优化的密码子选择，例如由商业公司如GenScript或DNA2. 0,从氨基酸序列开 始合成核酸序列。编码本发明工艺中使用的PAL酶的氨基酸序列的核酸序列可以被克隆在 合适的载体中，在引入合适的宿主后，可根据本领域技术人员已知的标准克隆和表达技术 (例如如Sambrook,J.，Fritsh,E.F.，andManiatis,T.MolecularCloning:ALaboratory Manual. 2nd,ed. ,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratory Press,ColdSpringHarbor,NY, 1989 中所述），来（过）表达该序列，产生与SEQIDNO. 4 具有至少50%序列同一性的PAL酶。
[0012] 在本发明的范围内，PAL(苯丙氨酸解氨酶）被定义为具有苯丙氨酸解氨酶活性 (即催化肉桂酸到苯丙氨酸的可逆非还原性氨基化的能力）的酶。HAL(组氨酸解氨酶）被 定义为具有组氨酸解氨酶活性（即催化尿刊酸到组氨酸的可逆非还原性氨基化的能力）的 酶。
[0013] 优选地，在本发明的工艺中生产的苯丙氨酸化合物是式（1)的化合物或其盐，
[0014]
[0015] 其中Y表示羟基、具有1-10个碳原子的取代的或非取代的烷氧基、取代的或非取 代的芳氧基、或胺基或胺残基-NHR(其中R为包含1-10个碳原子和任选地一个或多个杂 原子的烷芳基（akaryl)、烷基、芳烷基、芳基），且其中Z代表芳基上的一个或多个取代基， 其选自氢、羟基、具有1-10个碳原子的任选含有一个或多个杂原子的任选被取代的环状或 非环状脂肪基、具有1-10个碳原子的任选被取代的脂肪族杂环基、任选被取代的（杂）芳 基、具有1-10个碳原子的任选被取代的烷氧基、卤素原子、胺基、硝基、羧酸、羧酸酯、羧酸 酰胺、腈或三氟甲基。在Z是环状或非环状的脂肪基、脂肪族杂环基、（杂）芳基或烷氧基 的情况下，任选的取代为，在Y是烷氧基或芳氧基的情况下，任选的取代可例如选自三卤化 物，例如三氟甲基、三氯甲基滷素原子，例如氟化物、氯化物或碘化物；胺基，例如甲胺、二 甲胺、苄胺、乙胺、丙胺、苯胺、4-氟苯胺；烷氧基或芳氧基，例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、 苄氧基、苯氧基、4-氟苯氧基、3-氟苯氧基、2-氟苯氧基；硫醚，例如甲基硫醚、乙基硫醚、苄 基硫醚；三卤素烷基醚（trihaloalkylether)，例如三氟甲基醚；芳基或杂芳基，例如苯基、 4-氟苯基、3-氟苯基、2-氟苯基、2-三氟甲基苯基、3-三氟甲基苯基、4-三氟甲基苯基、噻 吩、呋喃、吡唑、吡咯（pyro1e)、咪唑等等。优选的是其中Z为氢、卤素原子、三氟甲基、羟基、 甲氧基或腈且Y为羟基的化合物。
[0016] 更优选地，在本发明的工艺中生产的苯丙氨酸化合物是式（2)的化合物或其盐，
[0017]
[0018] 其中Y如上文针对式（1)所定义，且其中Z如上文针对式（1)所定义，且其中X代 表离去基团，例如选自氟化物、溴化物、氯化物或碘化物、甲磺酸基（mesylategroup)、间硝 基苯磺酸基（nosylategroup)、甲苯磺酸基（tosylategroup)、三氟甲磺酸、硼酸、硝基等 等的组的离去基团。。
[0019] 在本发明的上下文中，术语"离去基团"表示在制备下述化合物的工艺中适合 用作离去基团的基团，所述化合物为对映异构体富集的任选被取代的根据式（3)的吲哚 啉-2-羧酸或其盐，
[0020]
[0021] 其中Y和Z如上文定义，其中在低于约140°C的温度下对对映异构体富集的手性邻 位-X-取代的根据式（2)的苯丙氨酸化合物进行环化，形成对映异构体富集的根据式（3) 的吲哚啉-2-羧酸化合物。可存在于式（3)中Y或Z中的任何取代基如下文定义。该环化 反应已在W0 2006/069799A1中公开，其通过参考并入本文。
[0022] 根据式（1)、⑵和（3)的化合物的盐的合适例子为例如其HC1盐、HBr盐、铵盐、 乙酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐或葡糖酸盐。 [0023] 当式（1)、（2)和（3)中的Z为含有一个或多个杂原子的具有1-10个碳原子的取 代的环状或非环状脂肪基、具有1-10个碳原子的取代的脂肪族杂环基、取代的（杂）芳基、 具有1-10个碳原子的取代的烷氧基时，这些杂原子通常各自独立地选自Ρ、Ν、0和S的组。 当Y含有一个或多个杂原子时，这些杂原子也通常各自独立地选自p、N、0和S的组。
[0024] 优选地，在上式（e)中，Y代表0H或0R1，其中R1代表通常具有1-10个碳原子的烷 基，优选地为具有1-6个碳原子的烷基，最优选地Y代表0H。优选地，Z代表Η或卤素，例如 氟化物、氯化物、溴化物或碘化物，最优选地Ζ代表Η。优选地，式（2)中的X代表氟化物、 溴化物、氯化物或碘，最优选地代表氯化物或溴化物。由于其低成本和/或从环境的角度来 看，氯化物是最优选的。
[0025] 苯丙氨酸化合物的合适例子是例如2-溴-苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、2-碘-苯 丙氨酸、2-溴-苯丙氨酸甲酯、2-氯苯丙氨酸甲酯、2-碘-苯丙氨酸甲酯、2-溴苯丙氨酸 乙酯、2-氯苯丙氨酸乙酯、2-碘-苯丙氨酸乙酯、2-溴苯丙氨酸苄酯、2-氯苯丙氨酸苄酯、 2_碘-苯丙氨酸苄酯、2-溴苯丙氨酸酰胺、2-氯苯丙氨酸酰胺、2-碘-苯丙氨酸酰胺等等。 优选的是2-溴苯