，2a，3ab，7ab]]-l-[2-[[l-(乙氧羰基）丁 基]氨基]-1-氧代丙基]八氢-1H-吲哚-2-羧酸。
[0047] 本发明将借助于以下的实施例阐述，但不受其限制。
【具体实施方式】
[0048] 实施例
[0049] 在PAL活性的测试中使用以下克隆。
[0050]
[0051]
[0052] 通过PCR扩增具有上文给定的核酸序列的基因，并使用Xi克隆方法将经纯化 的PCR产物与载体pSE420(InvitrogenCorp.CAUSA)的Ncol和Bglll位点融合。通过 使用该方法，在克隆基因后将Ncol位点破坏。形成的质粒被转化至E.coliTOP10细胞 (Invitrogen)，并通过限制性分析和琼脂糖凝胶电泳检查正确的插入，给出克隆上文给定 的克隆编号（clonenumber)。
[0053] R.glutinis的PAL基因由GenscriptCorporation,ScotchPlains,USA根据 RhodosporidiumtoruloidesATCC10788的PAL的蛋白质序列合成，其序列在NCBI的蛋白 质数据库中在编号CAA31209下列出。针对在E.coli中的表达对合成的PAL基因的密码子 进行最优化。通过Genscript将合成的基因连接在pUC57的Smal位点中，得到pUC57_PAL 构建体。将冻干的质粒（5μg)(得自Genscript)溶于50μ1MilliQ水中，并根据供应商 的方案使用1μ1该溶液转化E.coliDH5α化学感受态细胞（Invitrogen，Breda，荷兰） 的小份试样。
[0054] 制备细朐和无细朐提取物
[0055] 培养含有PAL的E.coli
[0056] 在补充有羧苄青霉素（100μg/ml)的各20ml2xTY培养基（16g/l胰蛋白胨；10g/ 1酵母提取物，7g/lNaCl)中接种含有相应质粒的E.coli，并在28°C孵育过夜。使用这些 培养物接种更大体积的培养基（250μ1预培养物用于250ml培养基）。将细胞在37°C培养 直至0D达到~1。用IPTG(0.5mM终浓度）诱导Shewanellaoneidensis(克隆编号1)、 Idiomarinaloihiensis(克隆编号 2)、Fibrobactersuccinogenes(克隆编号 3)、Vibrio vulnificus(克隆编号 4)的PAL克隆。用IPTG(lmM终浓度）诱导Rhodotorulaglutinis 的PAL克隆。孵育后将培养物在28°C下振动过夜。
[0057]通过离心（4°C下8000RPM)收获细胞（~2g/250ml培养基），并将其重悬于pH8. 8 的0. 1MTris/HCl缓冲液中（1ml缓冲液/0. 5g细胞）。将细胞悬浮液分为0. 2ml的小份试 样，并离心。弃去上清液，将细胞沉淀物（每份约0. 1克）储存于-20°C。
[0058] 蛋白质泖丨定，SDSPage,CFE的制备
[0059] 将0·lg细胞重悬于pH8. 8的1ml0· 1MTris/HCl缓冲液中，并通过超声处理破碎 细胞。对一部分经超声的细胞进行离心，并倾析出无细胞的提取物（CFE)。通过Bradford 所述的方法来测定不同级分中的蛋白质浓度。
[0060] 为了测定表达水平，将25μg无细胞提取物和总细胞提取物的蛋白质应用到 NuPAGE凝胶上。
[0061]
[0062] ++++>50%的总蛋白质；
[0063] +++ = 30-50% 的总蛋白质；
[0064] ++= 10-30%的总蛋白质。
[0065] 该分析显示PAL基因在E.coli中良好表达。未形成包涵体。克隆2(Idiomarina loihiensis)显示在E.coli中的最高表达水平。
[0066] dH9. 25下的初始活件
[0067] 通过在30°C下用硫酸将10wt%氨溶液调节至pH9. 25制备反应溶液。
[0068] 在氨溶液中制备10mM反式-2-溴-肉桂酸溶液。将4. 8ml底物溶液加热至30°C。 将100mg细胞沉淀物悬浮于100ml相应的氨溶液中，并添加至反应混合物中。反应即时进 行。通过HPLC分析测定形成的（L)-2-溴-苯丙氨酸。
[0069] 在反应的最初30-60分钟中，测量相对初始活性（与含有R.glutinisPAL的 E.coli细胞的活性比较）。
[0070]
[0071] 表1 :与R.glutinis的PAL相比，个体PAL克隆的相对初始活性。
[0072] 如表1中所示，在测试的条件下，较之从R.glutinis克隆的基因，从 S.oneidensis、I.loihiensis、F.succinogenes和V.vulnificus克隆的基因的活性均要高 得多。
[0073] 测宙底物抑制
[0074] 对pH11下的反应：将4.8ml100mM、50mM、20mM和10mM反式-2-溴-肉桂酸在 13wt%氨水中的溶液（在30°C下用硫酸调节至pH11)加热至30°C。
[0075] 对pH9. 25下的反应：将固体反式-2-溴-肉桂酸悬浮于4. 8ml8wt%氨水（在 30°C下用硫酸调节至pH9. 25)中，得到50mM、20mM和10mM的终浓度。将反应混合物加热 至30°C。为了起始反应，添加lOOmg细胞沉淀物在100ml相应氨溶液中的悬浮液。反应即 时进行。通过HPLC分析测定形成的（L)-2-溴-苯丙氨酸。
[0076] 不同底物浓度下13%ΝΗ3ρΗ11中的初始活性（相对于R.glutinis的PAL克隆而 s)：
[0077]
[0078] 不同浓度下8%ΝΗ3ρΗ9· 27中的初始活性（相对于R.glutinis的PAL克隆而言）：
[0079]
[0080] *nd:由于在这些条件下活性非常低，所以未检测到活性。~
[0081] 注意：在高于20mM的浓度下，与8%氨水pH9. 27的反应是衆体（slurry)。
[0082] 从上述结果可以看出，所有的PAL都显示比R.glutinisPAL更少的底物抑制。从 I.loihiensis克隆的PAL显示对高底物浓度的异常耐受，甚至在底物溶解度高的高pH值下 也是如此。
【主权项】
1. 制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述工艺通过用相应的肉桂酸在 存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时与氨基供体反应来实现，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQID NO. 4具有至少50%的序列同一性。2. 根据权利要求1的工艺，其中所述苯丙氨酸化合物是式（1)的化合物或其盐，(1) 其中Y表示径基、具有1-10个碳原子的取代的或非取代的烷氧基、取代的或非取代 的芳氧基、或胺残基，并且其中，Z代表芳基上的一个或多个取代基，其选自氨、径基、具有 1-10个碳原子的任选地被取代的环状或非环状脂肪基、具有1-10个碳原子的任选地被取 代的脂肪族杂环基、任选地被取代的（杂）芳基、具有1-10个碳原子的任选地被取代的烧 氧基、面素原子、胺基、硝基、簇酸、簇酸醋、簇酸酷胺、腊或Ξ氣甲基。3. 根据权利要求1的工艺，其中所述苯丙氨酸化合物是式（2)的化合物或其盐，P) 其中Z代表芳基上的一个或多个取代基，其选自氨、径基、具有1-10个碳原子的任选地 被取代的环状或非环状脂肪基、具有1-10个碳原子的任选地被取代的脂肪族杂环基、任选 地被取代的（杂）芳基、具有1-10个碳原子的任选地被取代的烷氧基、面素原子、胺基、硝 基、簇酸、簇酸醋、簇酸酷胺、腊或Ξ氣甲基，且其中Y代表径基、具有1-10个碳原子的取代 的或非取代的烷氧基、取代的或非取代的芳氧基、或胺残基，且其中X代表离去基团，例如 选自面素、甲横酸、间硝基苯横酸、甲苯横酸、Ξ氣甲横酸、棚酸、硝基等等。4. 根据权利要求3的工艺，其中X代表氯化物或漠化物，Y代表径基，Z代表氨。5. 根据权利要求4的工艺，其中式（1)的化合物是（S)-2-氯苯丙氨酸或（S)-2-漠苯 丙氨酸。6. 根据权利要求1-5中任一项的工艺，其中所述氨基供体是NH3或NH40H。7. 根据权利要求1-6中任一项的工艺，其中所述立体选择性苯丙氨酸氨裂解酶具有如 沈QIDNO. 2、SEQIDNO. 4、SEQIDNO. 6 或沈QIDNO. 8 所示的氨基酸序列。8. 根据权利要求3-7中任一项的工艺，其还包括下述步骤：在低于约140°C的溫度下对 对映异构体富集的手性邻位-X-取代的根据式（2)(2) 的苯丙氨酸化合物或其盐进行环化，其中Y和Z如上文定义且X为离去基团，从而形成 对映异构体富集的根据式（3)(3) 的吗I噪嘟-2-簇酸化合物。9.用于生产活性药物成分的工艺，所述工艺包括权利要求1-8中任一项的工艺。
【专利摘要】本发明涉及使用源自Idiomarina？loihiensis的苯丙氨酸解氨酶从肉桂酸衍生物生产光学活性苯丙氨酸化合物的方法。本发明涉及制备对映异构体富集的苯丙氨酸化合物的工艺，所述工艺通过在存在立体选择性苯丙氨酸解氨酶时用相应的肉桂酸与氨基供体反应来实现，所述苯丙氨酸解氨酶与SEQ？ID？NO.4(来自Idiomarina？loihiensis的PAL的氨基酸序列)具有至少50％的序列同一性。
【IPC分类】C12P13/22
【公开号】CN105238825
【申请号】CN201510536561
【发明人】阿斯玛 弗里斯科·伯纳德·简·范, 纳特斯卡·斯里尼吉
【申请人】DPx控股有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2007年9月12日
【公告号】CN101517089A, DE602007004678D1, EP2069518A1, EP2069518B1, WO2008031578A1