一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及4-乙烯基愈创木酚的制备技术领域，尤其涉及一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法。
【背景技术】
[0002]4-乙稀基愈创木酸(4-Vinyl guaiacol)，学名2_甲氧基_4_乙稀基苯酸(2-Methoxy-4-vinyl phenol)，又名对乙稀基愈创木酸(4-Hydroxy-3-methoxystyrene)，其分子式为C9H1Q02，密度1.11X103 kg/m3，熔点26°C ~29°C，沸点100°C /667Pa。常温常压下为无色或淡黄色油状液体，呈发酵香气，略带甜味，微带酚的气息。天然4-乙烯基愈创木酚主要存在于玉米酒精发酵的挥发物中，具有类似丁香类芳香气味，是决定酒类、酱油、茶叶、咖啡、干酪等食品品质的主要香味成分，也是日化、医药、香精合成等行业较为常用的高档香料之一，其商业价值是阿魏酸的40倍，因此具有广泛的应用价值和发展前景。
[0003]市场上的4-乙烯基愈创木酚多为化学法合成，需要较多的前体物质，有些还需要较为剧烈的条件。4-乙烯基愈创木酚很大一部分用于香精，医药及食品工业，而化学合成品用于这些方面有很大的不安全性，所以，寻找一条快速，高效生产这种物质的生物合成途径是很有必要的。目前已有利用一些菌株通过利用阿魏酸(Ferulic acid)生成4-乙稀基愈创木酸的报道，如汉逊德巴氏酵母(Debaryomyces hansenii)，假丝酵母(GenusCandida)，香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)，肠杆菌(Enterobacter)等，其中
4-乙烯基愈创木酚的市场价格约为底物阿魏酸的40倍左右。但底物阿魏酸或产物4-乙烯基愈创木酚对大多数菌株都有毒性，浓度过高会抑制菌株的生长，从而导致4-乙烯基愈创木酚产量的降低及生产效率低下，这对工业化大生产来说是极其不利的。
[0004]随着生活水平的提高，人们对天然绿色产品的需要也越来越高。与化学合成相比，生物法合成4-乙烯基愈创木酚具有反应条件温和，副产物少，提取步骤简单，生产清洁，环境污染低，产品安全可靠等优点，正日益受到人们的重视。
【发明内容】
[0005]发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法，通过在水/有机溶剂两相体系中生物转化阿魏酸生产天然4-乙烯基愈创木酚，具有生产周期短，产物收率高等特点。
[0006]技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法，包括以下步骤:
1)将地衣芽孢杆菌71722接种到LB固体培养基上培养得到成熟的斜面培养物；再将斜面培养物接种到种子液培养基中，培养制得种子培养液；
2)按体积比10%的接种量将种子培养液接种到LB液体培养基中，在菌体量达到OD600=2.0时，加终浓度5mM、pH7.0的阿魏酸诱导培养，在37°C条件下，200rpm振荡培养20h，得到的转化菌液； 3)取转化菌液，在6500rpm离心15min收集菌体lg湿重，并用M9转化培养基重悬清洗3次，得到转化细胞；
4)用M9转化培养基重悬转化细胞，同时加入阿魏酸以及加入总体积50%的有机溶剂，在37°C条件下，150rpm震荡培养，获得富含4-乙烯基愈创木酚的阿魏酸转化液。
[0007]步骤4)中，所述阿魏酸浓度为50~100mM。
[0008]步骤1)中，种子培养液的培养基配方为:酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L ;斜面培养使用的固体培养基是在种子培养液的培养基中添加质量体积比为1.6-2.0%的琼脂获得。
[0009]步骤3)中，M9转化培养基的配方是:磷酸氢二钠4.2mM，磷酸二氢钾2.2mM，氯化钠0.9mM，氯化铵1.9mM，自然ρΗ7.2。
[0010]步骤4)中，震荡培养时间为4~72h。
[0011]所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，采用高效液相色谱法检测4-乙烯基愈创木酚的浓度。高效液相色谱的流动相为35%甲醇:65%千分之一乙酸，高效液相色谱的检测条件为:柱温30°C，流速0.8mL/min，进样量5uL，阿魏酸和4-乙稀基愈创木酸的检测波长分别为320nm和255nm。
[0012]有益效果:与现有的技术相比，本发明的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，采用由水相和水不溶性有机溶剂组成的两相反应体系，在这个反应体系中，4-乙烯基愈创木酚会选择性的进入有机相而阿魏酸却会保留在水相中，从而提高产物的产量以及转化率。同时，地衣芽孢杆菌71722转化高浓度阿魏酸高效制备4-乙烯基愈创木酚的方法有条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单等优点，具有很大应用前景。
【附图说明】
[0013]图1是底物阿魏酸浓度为50mM时的转化关系图；
图2是底物阿魏酸浓度为65mM时的转化关系图；
图3是底物阿魏酸浓度为85mM时的转化关系图；
图4是底物阿魏酸浓度为lOOmM时的转化关系图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0015]以下实施例中使用的地衣芽孢杆菌(SaciWiAs.licheniformis) 71722 (以下简称地衣芽孢杆菌71722)为本申请人之前已经获得的专利菌株(CN103255084B)。
[0016]实施例1
一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法，包括以下步骤:
1)斜面培养:将地衣芽孢杆菌71722接种到LB固体培养基上，在50°C、pH7条件下，静置培养20h，得到成熟的斜面培养物；
2)制备种子培养液:用步骤1)所得到的斜面培养物，接种到种子液培养基中，在50°C条件下，200rpm振荡培养20h，连续转接1?3次，制得种子培养液；
3)转化细胞培养:使用步骤2)所得的种子培养液，按体积比10%的接种量接种到LB液体培养基中，在菌体量达到0D_=2.0时，加终浓度5mM、pH7.0的阿魏酸诱导培养，在37°C条件下，200rpm振荡培养20h ；
4)收集转化细胞:使用步骤3)得到的转化菌液，在6500rpm离心15min收集菌体lg湿重，并用M9转化培养基重悬清洗3次，得到转化细胞；
5)转化:使用步骤4)所得的转化细胞，用M9转化培养基重悬，倒进特氟龙培养瓶，同时加入终浓度50mM阿魏酸以及加入总体积50%的有机溶剂，在37°C条件下，150rpm震荡培养4小时后，有机相和水相分别取样得到阿魏酸转化液；
6)4-乙烯基愈创木酚浓度检测:阿魏酸转化液样品经高效液相色谱检测，结果如图1所示，最终4-乙烯基愈创木酚浓度为41.02mM，摩尔转化率为81.55%。
[0017]在上述利用地衣芽孢杆菌71722转化阿魏酸高效制备4_乙烯基愈创木酚的方法中，种子培养液的培养基配方为:酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L ;斜面培养使用的固体培养基是在此培养基基础上添加质量体积比为1.6%~2.0%的琼脂；制备M9转化培养基的配方是:磷酸氢二钠4.2mM，磷酸二氢钾2.2mM，氯化钠0.9mM，氯化铵1.9mM，自然ρΗ7.2ο
[0018]实施例2:
地衣芽孢杆菌71722在用5mM阿魏酸诱导培养20h后收集菌体lg湿重接种到转化培养基中，加入终浓度65mM阿魏酸，同时加入等体积的正辛烷，在37°C条件下，150rpm震荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例1。
[0019]4h后有机相和水相分别取样测定4-乙烯基愈创木酚的浓度，经高效液相色谱检测，结果如图2所示，最终4-乙烯基愈创木酚浓度为52.25mM，摩尔转化率为79.53%。
[0020]实施例3
地衣芽孢杆菌71722在用5mM阿魏酸诱导培养20h后收集菌体lg湿重接种到转化培养基中，加入终浓度85mM阿魏酸，同时加入等体积的正辛烷，在37°C条件下，150rpm震荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例1。
[0021]4h后有机相和水相分别取样测定4-乙烯基愈创木酚的浓度，经高效液相色谱检测，结果如图3所示，最终4-乙烯基愈创木酚浓度为53.65mM，摩尔转化率为62.45%。
[0022]实施例4
地衣芽孢杆菌71722在用5mM阿魏酸诱导培养20h后收集菌体lg湿重接种到转化培养基中，加入终浓度lOOmM阿魏酸，同时加入等体积的正辛烷，在37°C条件下，150rpm震荡培养。其中种子培养和转化细胞培养使用的培养基配方同实施例1。
[0023]12h后有机相和水相分别取样测定4-乙烯基愈创木酚的浓度，经高效液相色谱检测，结果如图4所示，最终4-乙烯基愈创木酚浓度为55.37mM，摩尔转化率为55.37%。
【主权项】
1.一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)将地衣芽孢杆菌71722接种到LB固体培养基上培养得到成熟的斜面培养物；再将斜面培养物接种到种子液培养基中，培养制得种子培养液； 2)按体积比10%的接种量将种子培养液接种到LB液体培养基中，在菌体量达到.OD600=2.0时，加终浓度5mM、pH7.0的阿魏酸诱导培养，在37°C条件下，200rpm振荡培养20h，得到的转化菌液； 3)取转化菌液，在6500rpm离心15min收集菌体lg湿重，并用M9转化培养基重悬清洗.3次，得到转化细胞； 4)用M9转化培养基重悬转化细胞，同时加入阿魏酸以及加入总体积50%的有机溶剂，在37°C条件下，150rpm震荡培养，获得富含4-乙烯基愈创木酚的阿魏酸转化液。2.根据权利要求1所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，步骤4)中，所述阿魏酸浓度为50~100mM。3.根据权利要求1所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，步骤1)中，种子培养液的培养基配方为:酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L ;斜面培养使用的固体培养基是在种子培养液的培养基中添加质量体积比为1.6-2.0%的琼脂获得。4.根据权利要求1所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，步骤3)中，M9转化培养基的配方是:磷酸氢二钠4.2mM，磷酸二氢钾2.2mM，氯化钠0.9mM，氯化铵1.9mM，自然pH7.2。5.根据权利要求1所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，步骤4)中，震荡培养时间为4~72h。6.根据权利要求1所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，采用高效液相色谱法检测4-乙烯基愈创木酚的浓度。7.根据权利要求6所述的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，其特征在于，高效液相色谱的流动相为35%甲醇:65%千分之一乙酸，高效液相色谱的检测条件为:柱温30°C，流速.0.8mL/min，进样量5uL，阿魏酸和4-乙稀基愈创木酸的检测波长分别为320nm和255nm。
【专利摘要】本发明公开了一种制备4-乙烯基愈创木酚的方法，以地衣芽孢杆菌71722为生物催化剂，以高浓度阿魏酸为底物，通过水/有机溶剂两相体系高效制备4-乙烯基愈创木酚。本发明的制备4-乙烯基愈创木酚的方法，采用由水相和水不溶性有机溶剂组成的两相反应体系，在这个反应体系中，4-乙烯基愈创木酚会选择性的进入有机相而阿魏酸却会保留在水相中，从而提高产物的产量以及转化率。同时，地衣芽孢杆菌71722转化高浓度阿魏酸高效制备4-乙烯基愈创木酚的方法有条件温和，环境污染小，产物得率高，副产物少，生产步骤简单等优点，具有很大应用前景。
【IPC分类】C12P7/22, C12R1/22
【公开号】CN105238821
【申请号】CN201510748054
【发明人】丁少军, 李璐璐, 施季森, 周燕威
【申请人】南京林业大学
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月6日