专利名称：一种表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制备方法
技术领域：
本发明一般的涉及乳酸乳球菌制品的制备方法，特别的涉及表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制备方法。
背景技术：
苯丙氨酸(Phenylalanine，Phe)是人体必需的一种氨基酸，正常人从饮食中摄入及体内再循环的苯丙氨酸，除少部分被直接利用外，大部分在肝脏的苯丙氨酸羟化酶 (Phenylalanine hydroxylase,PAH)的作用下转化成为酪氨酸后被利用。患有常染色体隐性遗传病——苯丙酮尿症(Phenylketonuria，PKU)的患者，由于苯丙氨酸羟化酶基因缺陷， 导致肝脏的PAH酶活性降低或缺失，无法将苯丙氨酸转化成为酪氨酸，致使苯丙氨酸通过其他途径转化为苯丙酮酸、苯乙酸、苯乳酸等。这些非正常代谢产物在血、脑脊液和其他组织中大量积累，对各种组织特别是脑组织造成不可逆损伤。PKU患者的主要临床表现是智力低下，癫痫发作和黑色素减少。目前国际上通用的治疗PKU方法是低苯丙氨酸饮食控制疗法。该方法需从患者一出生起即给予低苯丙氨酸含量的特制的或人工合成的奶粉或食物，同时严格限制正常食物的摄入，并且根据各生长发育阶段和个体的差异随时调整饮食控制量，直至智力发育基本成熟的年龄，即17-18岁。由于苯丙氨酸在日常饮食中普遍、大量存在，饮食控制难度极大且控制过程容易造成患儿其它必需氨基酸的摄入不足，从而引起患儿体质下降、生长发育迟滞等副作用。而特制的人工合成的低苯丙氨酸食品品种少、口感差、价格昂贵，实际应用中更使患者由于常年无法食用正常饮食而极其痛苦，因此少有患者能坚持此种饮食从而控制苯丙氨酸摄入量达十几年者，因此极大地影响了治疗效果。国际上于上世纪80年代初开始研究酶法治疗PKU，主要是采用逆转录病毒和重组腺病毒载体介导的方法，来实现PAH 在PKU模型小鼠的肝细胞中的表达。但这一方法的主要问题是转移效率低，转移物免疫原性强，外源基因在细胞中只能短期表达，同时存在安全性隐患，因此至今未见用于临床的报道。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)广泛存在于各种绿色植物和少数微生物中，它可以催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，因此有希望口服该酶治疗PKU。由于植物和酵母等生产的天然PAL量极少，提取成本很高，因此通过基因工程方法获取大量 PAL成为研究的重点。《中国病理生理杂志》2000年16卷第1期第12页公开了一种水稻PAL基因在大肠杆菌BL21DE3中的表达方法，PAL主要以包涵体形式存在，诱导7小时后其表达量达到峰值，占菌体总蛋白量的35. 43%。但该菌超声破碎后提取的粗酶比活力很低，仅为0. 46U/g， 原因是PAL在生物体外极不稳定。利用该文献报道的方法，一方面无法提取得到体外稳定存在的PAL纯品，另一方面表达PAL所用的大肠杆菌为人体致病菌，不能直接口服应用，因此利用该方法表达的PAL无法在临床治疗PKU中使用。中国专利02117216. 1公开了一种治疗PKU的药物的制备及使用方法，该方法将PAL基因转入肠道正常菌中，通过口服该菌，利用其表达的PAL酶在消化道内将苯丙氨酸转化为肉桂酸，从而降低食物来源中的苯丙氨酸进入血液的量，以达到治疗PKU的同时保持较正常饮食的目的。《生物工程学报》2002年18卷第6期第713页公布了利用上述专利方法在乳酸乳球菌(L. lactis)NICE系统中表达欧芹PAL的方法，其使用翻译融合型载体ρ (NZ8048-PAL)工和转录融合型载体P (NZ8048-PAL) 2在乳酸乳球菌中表达欧芹PAL，表达量分别占总蛋白的 5. 16%和2. 76%。该方法的明显缺陷在于乳酸乳球菌的发酵量和乳酸乳球菌中表达产物的含量均很低，造成最终发酵获得的PAL总水平低，因此成本极高，限制了其实际临床应用。本申请人在之前的中国发明专利申请200810098008. 0中公开了一种治疗PAL的乳酸乳球菌制品的制备方法。该方法在生物工程学报公开方法的基础上进一步对乳酸乳球菌的发酵培养基进行了优化，采用这样的发酵培养基发酵培养较采用传统的Μ17培养基发酵培养时菌体密度提高了 3. 02倍，PAL比活性提高了 1. 65倍，两者的乘积也即发酵获得 PAL的总活性提高了 4. 99倍。但是上述优化发酵培养基发酵表达PAL的乳酸乳球菌的方法还有进一步改进的余地，以进一步提高乳酸乳球菌的发酵量和乳酸乳球菌中表达产物的含量，从而进一步降低患者临床使用的成本，有利于该活性乳酸乳球菌制品的推广应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种表达PAL的活性乳酸乳球菌制品的高效低成本的制备方法。可在现有技术的基础上进一步提高乳酸乳球菌的发酵量和乳酸乳球菌中表达产物的含量，从而进一步降低患者临床使用该活性乳酸乳球菌制品的成本，有利于该活性乳酸乳球菌制品的推广应用。为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下1)获得表达PAL的基因；2)构建重组表达载体将表达PAL的基因与适于转化乳酸乳球菌的表达载体相连接形成重组表达载体；3)构建工程菌将重组表达载体转化感受态的乳酸乳球菌；4)筛选获得高效表达PAL的乳酸乳球菌菌株；5)发酵乳酸乳球菌并诱导表达PAL ；6)干燥发酵收获的菌体，其中在5)的发酵时使用的培养基由体积比4 6-6 4的配制中间培养基与 Μ17肉汤培养基混合得到，并将ρΗ值调节到6. 5-7. 5，所述的配制中间培养基每IL中含有蛋白胨 5-30g，酵母提取物 2. 5-15g，乳糖或葡萄糖 5-30g, MgSO4. 7Η200· 2-0. 5g，MnSO4. H2O 0. 05-0. lg, NaAc. 3H20 3. 3g, KH2P042g, Tween-800. 5_5ml。在上述技术方案的获得表达PAL的基因过程中，可以人工合成编码PAL的基因，也可以从其它表达PAL的动植物或微生物中提取总RNA经反转录得到编码PAL的cDNA。其中在人工合成编码PAL的基因时优选用乳酸乳球菌翻译偏爱密码子合成编码PAL的基因，在提取反转录得到编码PAL的cDNA时优选从植物或红酵母中提取总RNA经反转录得到编码 PAL的cDNA，并更优选从欧芹中提取总RNA经反转录得到编码PAL的cDNA。
在上述技术方案的构建重组表达载体时，所述的适于转化乳酸乳球菌的表达载体包括但不局限于pET23b、pMG36e、pNZ8048、pNZ8149等。连接可采用本领域技术人员公知的方法，选择相同的限制性内切酶对上述表达载体与储存表达PAL基因的载体分别进行酶切后将分别得到的酶切表达载体与表达PAL的基因在T4DNA连接酶的作用下进行连接。在上述技术方案的构建工程菌时，应首先制备感受态的乳酸乳球菌，优选用电穿孔法制备感受态乳酸乳球菌，具体方法可参见文献的报道。之后用将重组表达载体转入感受态乳酸乳球菌。在上述技术方案的筛选获得高效表达PAL的乳酸乳球菌菌株时，可选择本领域技术人员公知的菌落PCR鉴定法、酶切图谱法或PAL酶活性检测法。其中菌落PCR鉴定法的原理是特异性PCR引物分别位于插入PAL基因的两端，直接将少量菌体加入到PCR反应液中，可判断是否有PAL基因的插入。酶切图谱法的原理是根据质粒酶切电泳图谱上条带的数目和位置判断有无插入片段及其大小。PAL酶活性检测法的原理是将适量菌液、苯丙氨酸与高氯酸混合反应过夜，过滤离心后进行高效液相色谱(HPLC)分析，根据有无特异性的 PAL催化产物肉桂酸可判断重组工程菌有无PAL表达活性。上述发酵过程在主要发酵条件方面，发酵温度应维持在25_40°C，发酵时间控制在 6-30小时。为减少外源基因PAL过早表达对乳酸乳球菌生长的不利影响，优选当发酵液光密度OD值达到0. 3-0. 6时进行诱导，诱导剂优选乳链菌素(Nisin)，诱导剂优选终浓度为 3. 75_50ng/mlo在上述技术方案的干燥发酵收获的菌体时，为保持乳酸乳球菌的活菌率并同时有利于PAL酶活的保存，优选将收获的菌体高速离心脱水并用适当的缓冲液洗涤后再进行烘干处理。所述的适当的缓冲液优选PH值为7. 5-8. 8的缓冲液，并更优选磷酸盐或硼酸盐缓冲液；为在保证洗涤效果的基础上减少洗涤所造成的收获菌体的损失，所述的洗涤次数优选2-3次；所述的干燥温度优选25-60°C，时间优选6-72小时。通过实施上述的技术方案可使获得的乳酸乳球菌活菌数和其中PAL的比活力大幅提高，其中前者可达到1012CFU/ml以上，后者可达到80U/g以上。
具体实施例方式实施例1 利用乳酸乳球菌偏爱密码子人合成PAL基因构建表达PAL的乳酸乳球菌工程菌人工合成文献“人工合成苯丙氨酸脱氨酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达”(贾兴元，陈星，苏畅等，中华微生物学和免疫学杂志2006年1月第26卷第1期23-26页)中
图1所示的采用乳酸乳球菌偏爱密码子的PAL基因序列，标记为PALart,连接到T载体后DNA 测序进行验证。该PALart在5，端和3，端分别有XbaI和NcoI酶切位点。NcoI和XbaI双酶切含PALart片段的T载体后得到完整的PALart基因片段，然后在T4DNA连接酶的作用下与由NcoI和XbaI双酶切pNZ8149所得的线性质粒连接。连接体用电穿孔法转化感受态乳酸乳球菌NZ3900，具体条件为在EquiBio Easyject细胞打孔仪上进行，参数设定为2. 5kv，25 μ F，400 Ω。其中ρΝΖ8149与ΝΖ3900均购自荷兰NIZO food research。
5
实施例2 =PALart重组表达质粒的筛选和鉴定分别采用酶切图谱法和PAL酶活性检测法进行筛选和鉴定。酶切图谱法采用NcoI和^CbaI双酶切，电泳结果显示重组质粒被切成2. 8kb和 1. 9kb的两条带，而质粒pNZ8149则被切为约1. 9kb和650bp的两条带，与预期的条带数目和大小位置相符，可确定重组质粒有2. 2kb的PALart片段插入。PAL酶活性检测法取400μ 1菌液加等量5%高氯酸与lOmmol/L苯丙氨酸， 0. lmol/L硼酸盐缓冲液调节pH为8. 8，30°C反应1小时，12000rpm离心后取上清用0. 22 μ m 针头滤膜过滤，HPLC自动进样20μ 1进行分析。流动相为含体积浓度为0. 的乙酸的甲醇/水(50/50)溶液，流速为1. Oml/min,分离柱为4. 6mmX 25cm的C18反相柱，检测波长为 ^Onm。同样色谱条件下上肉桂酸标准品，记录肉桂酸的保留时间。两次HPLC保留时间比对结果显示特异性的PAL催化反应产物肉桂酸的峰，表明该重组质粒有PALart表达活性。实施例3 利用欧芹PAL基因构建表达PAL的乳酸乳球菌工程菌从受机械损伤的欧芹茎叶中用常规方法提取总RNA，用RT-PCR技术制备PAL的 cDNA，其中所用的特异性引物为上游引物T1 5 ‘ -TACGATATCAGGAACTTGGTAACAAT-3 ‘，下游引物T2 5 ‘ -CTAAGATCTCATGCATFTCAGTTAACA-3 ‘。用EcoRV和BglII酶切得到的cDNA片段，得到具有粘性末端的PAL cDNA片段。然后用EcoRV和BglII酶切表达载体pNZ8149，并将酶切得到片段在T4DNA连接酶的作用下与 PAL cDNA片段连接得到重组质粒pNZ8149-PAL。参照实施例1的电转化条件将重组质粒PNZ8149-PAL转化到感受态乳酸乳球菌 NZ3900中。PNZ8149-PAL重组表达质粒的筛选和鉴定方法同实施例2。实施例4 表达PAL的基因工程乳酸乳球菌发酵培养分别配制如表1的培养基并调节pH到6. 5-7. 5用于发酵培养，其中配制过程中使用的M17肉汤培养基可按微生物学相关教科书上给出的配制方法配制，也可从商业途径获得，例如从BD公司购买。将实施例1获得的表达PAL的乳酸乳球菌菌种按常规方法进行活化后按1 50比例分别接种上述培养基，于30°C进行半厌氧发酵培养(静置不搅拌但也不封发酵容器口)，发酵时间为18小时，发酵过程中控制pH为6. 5-7. 5之间。当发酵液光密度OD值达到0. 4时用乳链菌素进行诱导，诱导剂终浓度为7. 5ng/ml。发酵结束后将发酵液经高速离心(SOOOrpm/分，离心20分钟)脱水并用pH8. O的 0. lmol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，收集菌体，60°C烘干，4°C密封避光保存。实施例5 干燥菌体中PAL酶比活力与菌体存活情况检测1)干燥菌体中PAL酶活力的检测取400 μ 1菌液加等量5 %高氯酸与lOmmol/L苯丙氨酸，0. lmol/L硼酸盐缓冲液调节PH为8. 8，30°C反应1小时，12000rpm离心后取上清用0. 22 μ m针头滤膜过滤，HPLC 自动进样20μ1进行分析。流动相为含体积浓度为0.1%的乙酸的甲醇/水(50/50)溶液，流速为1. Oml/min,分离柱为4. 6mmX 25cm的C18反相柱，检测波长为^Onm。同样色谱条件下上不同浓度的肉桂酸标准品，根据分别测定得到的峰面积对肉桂酸浓度绘制工作曲线，将菌液酶解苯丙氨酸样品测定得到的肉桂酸峰的峰面积值代入工作曲线计算可得到样品中肉桂酸的含量。
6
根据国际酶学生化学会委员会规定1个酶活力(U)，是指在特定条件下，1分钟内能将1 μ mol底物转化为产物所需的酶量，或是转化底物中1 μ mol的有关基团的酶量；酶的比活力可用活力单位/毫克蛋白(U/mg)表示，也可用单位/克(U/g)或单位/ml(U/ml)制剂表示。由上述肉桂酸含量测定结果与国际酶学生化学会委员会的规定可得到干燥菌体中PAL比酶活力。2)干燥菌体存活情况检测将干燥处理后的菌体在琼脂肉汤M17固体培养基(LM17)中划线，30°C恒温培养72 小时后进行菌落计数。实施例6 不同培养基发酵培养的方法及结果不同发酵培养基组成及用其发酵培养的结果如下表1和表2所示，其他发酵培养条件如实施例4。表1不同发酵培养基组成及用其发酵培养的结果
权利要求
1.一种表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制备方法，按顺序包括如下步骤1)获得表达苯丙氨酸解氨酶的基因；2)构建重组表达载体将表达苯丙氨酸解氨酶的基因与适于转化乳酸乳球菌的表达载体相连接形成重组表达载体；3)构建工程菌将重组表达载体转化感受态的乳酸乳球菌；4)筛选获得高效表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌菌株；5)发酵乳酸乳球菌并诱导表达苯丙氨酸解氨酶；6)干燥发酵收获的菌体，其特征是在5)的发酵时使用的培养基由体积比4:6-6:4的配制中间培养基与M17 肉汤培养基混合得到，并将PH值调节到6. 5-7. 5，所述的配制中间培养基每IL中含有蛋白胨 5-30g,酵母提取物 2. 5-15g，乳糖或葡萄糖 5-30 g，MgSO4. 7H20 0. 2-0. 5g，MnSO4. H2O 0. 05-0. lg, NaAc. 3H20 3. 3g, KH2PO4 2g, Tween-80 0. 5_5mL·
2.如权利要求1的制备方法，其特征是利用乳酸乳球菌偏爱密码子人合成所述的表达苯丙氨酸解氨酶的基因。
3.如权利要求1的制备方法，其特征是所述表达苯丙氨酸解氨酶的基因提取自欧芹。
4.如权利要求1的制备方法，其特征是所述的适于转化乳酸乳球菌的表达载体是 PNZ8149。
5.如权利要求1的制备方法，其特征是所述的感受态的乳酸乳球菌是NZ3900。
6.如权利要求1的制备方法，其特征是当发酵液光密度OD值达到0.3-0. 6时进行诱导，诱导剂为乳链菌素，终浓度为3. 75-50ng/mL·
7.如权利要求1的制备方法，其特征是所述发酵温度为25-30°C，发酵时间为6-30小时。
8.如权利要求1的制备方法，其特征是在所述干燥发酵收获的菌体前采用高速离心脱水收集菌体并用PH在7. 5-8. 8之间的缓冲液洗涤2-3次收集菌体。
9.如权利要求1的制备方法，其特征是所述干燥发酵收获的菌体采用25-60°C的干燥温度与6-72小时的干燥时间。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌制品的制备方法，按顺序包括如下步骤1)获得表达苯丙氨酸解氨酶的基因；2)将表达苯丙氨酸解氨酶的基因与适于转化乳酸乳球菌的表达载体相连接形成重组表达载体；3)将重组表达载体转化感受态的乳酸乳球菌；4)筛选获得高效表达苯丙氨酸解氨酶的乳酸乳球菌菌株；5)发酵乳酸乳球菌并诱导表达苯丙氨酸解氨酶；6)干燥发酵收获的菌体，其中在步骤5)的发酵时使用的培养基由体积比4∶6-6∶4的配制中间培养基与M17肉汤培养基混合得到，并将pH值调节到6.5-7.5。采用本发明的技术方案可使获得的乳酸乳球菌活菌数和其中苯丙氨酸解氨酶的比活力大幅提高，其中前者可达到1012CFU/ml以上，后者可达到80U/g以上。
文档编号C12N1/21GK102358890SQ20111033961
公开日2012年2月22日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者刘金毅, 周敏毅, 牛春, 程永庆 申请人:北京三元基因工程有限公司, 北京毕艾欧科技发展有限责任公司