专利名称：一种肌内脂肪沉积acl基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种与猪肌内脂肪沉积相关的 ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)基因技术。
背景技术：
目前，我国养猪生产在追求高瘦肉率和低背膘厚的同时，忽略了猪肉品质的下降。 肌内脂肪(intramuscular fat, IMF)含量是猪肉品质的重要影响因素,可影响肉品质的风味、多汁性、嫩度及营养价值等多个方面。因此，提高肌内脂肪含量以改善猪肉品质已成为当前的研究热点。我国的地方品种猪虽然生长速度较慢，但却具有较优良的肉品质。如版纳微型猪是云南优良地方猪种之一，具有体态匀称、迅长迅肥、皮薄骨细、后腿丰满、背膘分布均匀，肌内脂肪丰富等特点，是适合烤乳猪的原料猪。然而，目前对版纳微型猪的生长发育及脂肪沉积的分子机制知之甚少。随着分子生物学相关技术的发展，从分子水平上了解版纳微型猪脂肪沉积的分子基础，发现、开发版纳微型猪与脂肪沉积相关的功能基因，为提高商品猪肌内脂肪含量而改善猪肉品质提供理论基础。在猪肌肉组织中，IMF含量的增加主要是甘油三酯(triacylglycerols, TAG)含量的增加，TAG含量的增加主要依赖于肌内脂肪细胞的分化与增殖。脂肪细胞分化和增殖过程中，TAG的合成主要依赖于脂肪酸的从头合成和转运。因此，肌内脂肪细胞的分化与增殖及其代谢是IMF沉积的基础，调控肌内脂肪细胞分化与增殖及调节脂类代谢的调控因子对 IMF的沉积都有重要影响。葡萄糖是动物体的主要能量来源，当动物体内的葡萄糖供应过剩时，则会转变为脂肪储存。细胞膜的生成以及蛋白质翻译后的调节也离不开依赖于葡萄糖合成的脂类。ATP 柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)是联系糖代谢与脂类合成的关键酶，它能够催化柠檬酸转变成乙酰辅酶A和草酰乙酸。乙酰辅酶A经过乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶催化最后生成脂肪酸。因此，ATP柠檬酸裂解酶是重要的脂肪合成酶之一，与猪的脂肪沉积密切相关。一些资料表明，ATP柠檬酸裂解酶的活性可受到日粮营养及胰岛素的调节。高碳水化合物营养可提高小鼠ATP柠檬酸裂解酶在肝脏的表达，其活性主要在转录水平受到调节。此外还有研究发现，ATP柠檬酸裂解酶可通过调节其合成速度来改变体内脂肪从头合成的状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种肌内脂肪沉积ACL基因，采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现ACL基因参与肌内脂肪细胞脂类代谢过程，并首次从版纳微型猪肌肉组织中克隆了 ACL基因。一种肌内脂肪沉积ACL基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的ATP柠檬酸裂解酶(ACL)基因，基因的⑶S序列全长为3276bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I。并且，CDS核苷酸序列编码1091个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积ACL基因设计引物，进行PCR扩增，检测ACL基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示ACL基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明ACL基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。本发明克隆得到版纳微型猪ACL基因⑶S全序列，全长为3276bp，提交到 Genbank，登录号为JN205459。与Genbank提供的猪ACL基因相比较，发现有五个核苷酸突变位点，其中有三个有义突变，导致氨基酸由丙氨酸突变成缬氨酸、天冬氨酸变为天冬酰胺、 苏氨酸变为蛋氨酸。推测该氨基酸位点的突变可能导致版纳微型猪ACL蛋白质的分子量、 等电点、二级结构、磷酸化位点等特性都有所改变，而这些性质的改变可能与版纳微型猪肉品质优良的特点有关。ACL蛋白在物种间的同源性较高，通过进化树可以看出，猪与牛、羊的亲缘关系更为接近，其次是人、鼠，ACL编码的氨基酸序列与牛、羊、人、小鼠和大鼠的同源性分别为 98%、98%、98%、97%和97%。可见，ACL在不同物种间具有高度保守性，这是它在各个物种中相应的生理特点保持不变的分子基础。另外，ACL基因的RT-PCR表达模式表明，该基因在脂肪组织中高度表达，也证明了它在肌内脂肪沉积方面具有重要作用。本发明采用基因芯片技术和生物信息学分析方法，在对猪肌肉组织和肌内脂肪细胞基因表达谱的研究中发现ACL基因参与肌内脂肪细胞脂类代谢过程，并首次从猪肌肉组织中克隆了 ACL基因。目前有关猪ACL基因及其表达模式的研究还较少。对人、鼠和梅山、 大白猪脂肪组织ACL基因cDNA序列的克隆与表达已有研究，但尚未从版纳微型猪肌肉组织中克隆到该基因。
图I是本发明的PCR扩增ACL基因图示
图2是本发明的ACL在不同组织中的表达水平柱3是本发明的ACL基因酶切鉴定图示图4是本发明的进化树分析5是本发明的ACL蛋白质二级结构预测6是本发明的ACL蛋白质磷酸化位点预测7是本发明的ACL蛋白质糖基化位点预测8是本发明的ACL蛋白质疏水性分析图
具体实施例方式一种肌内脂肪沉积ACL基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)基因。基因的CDS序列全长为 3276bp,其⑶S核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. I。并且，⑶S核苷酸序列编码1091个氨基酸，氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2。对上述特征的肌内脂肪沉积ACL基因设计引物，进行PCR扩增，检测ACL基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示ACL基因在脂肪组织中表达量最闻，初步表明ACL基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。具体为I、肌肉组织中总RNA的提取
采取50kg成年版纳微型猪肌肉组织立即放入液氮中保存备用。利用RNA提取试剂提取版纳微型猪肌肉组织总RNA，具体操作参照试剂盒说明进行。将提取的RNA反转录成 cDNA，_20°C保存，待用。2、PCR引物设计及PCR反应条件
根据GenBank中猪ACL序列信息(GenBank登录号ΝΜ_001105302),利用Primer Premier 5. O设计引物，并合成。为了得到较佳的扩增效果，采用分两段扩增的方法，最后将两段序列拼接在一起。用于克隆的ACL基因的两对引物序列为
上半段，产物长度为2063bp
F:5’ - CCATGTCGGC CAAGGCGATT TT - 3 ’
R:5’ - ATAAACGTGG AGCCGGGGTA - 3，
下半段，产物长度为1337bp
F :5’ - ACAGGTACCC CGGCTCCACG TTTAT - 3’
R:5’ - CCCAGGGGAG GAGTTCTTGT CTTCA - 3’
用于荧光定量的ACL基因的引物序列为
F :5’ - CGAGCAGCAG ACCTATGACT AT -3’
R :5’ - ACTTCTCCCA TCACCCGTAA -3’
内参18S rRNA的引物序列为
F :5’ -CTGCCTCCTT GGATGTG-3’
R:5’ -GCGGCTTTGG TGACTCTA-3’
ACL基因克隆的PCR反应条件为上半段94°C预变性3min ;94°C变性O. 5min、53°C 退火lmin、72°C延伸3min (35个循环)；72°C后延伸IOmin进行扩增；下半段94°C预变性 3min ;94°C变性 O. 5min、55°C退火 O. 5min、72°C延伸 2min(35 个循环);72°C后延伸 7min 进行扩增，反应后于4°C保存。PCR扩增产物经I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测后，确认扩增的产物的长度大小同于目的片段。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。荧光定量PCR的反应条件为94°C预变性3min;94°C变性O. 5min、54°C退火 O. 5min、72°C延伸3min (35个循环);72°C延伸IOmin。数据处理的方法为，检测心、肝、脾、 肺、肾、肌肉、脂肪七个组织中ACL基因的相对表达量，实验数据以18S rRNA作为内参，采用双标准曲线法处理。结果显示，ACL在被检测的7个组织中都有表达，在脂肪中高量表达， 在肝、肺、肌肉上大量表达，在心、肾上是多量表达，在脾上是微量表达。3、ACL基因的克隆及序列分析
按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒书说明书回收特异性条带，产物连接于pMD-18T载体，转化至ToplO感受态细胞，氨苄筛选挑取阳性克隆，分别接种于IOmL LB液体培养基中， 37°C振荡过夜，提取质粒经Ecor I和Hind III双酶切鉴定为阳性，进行测序。克隆鉴定结果如说明书核苷酸和氨基酸序列表。4、测序结果
所得的两段扩增序列经过测序，并用DNAMAN软件进行拼接，获得版纳微型猪ACL基因⑶S编码区全序列。⑶S全长3276bp，核苷酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ.ID. NO. I所示，并提交到Genbank数据库，登录号为JN205459。⑶S序列编码1091个氨基酸，其氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表SEQ. ID. NO. 2所示。
5、测序结果与Genbank中提供的序列比对登录 http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/ 进行版纳微型猪 ACL 基因的 Q)S 核苷酸序列，以及CDS编码的氨基酸序列与Genbank提供的猪ACL基因信息(登录号为 NM_001105302)进行比较，发现⑶S的核苷酸序列有五个突变位点第1117位C变为T、第 1941位T变为C、第2790位T变为C、第2911位G变为A、第3077位C变为T。其中第 1117位、第2911位和第3077位是有义突变，引起第373位氨基酸由丙氨酸突变成缬氨酸、 第971位氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺、第1026位氨基酸由苏氨酸变为蛋氨酸。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。6、ACL基因核苷酸与氨基酸序列同源性分析
登录http://www. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/,以版纳微型猪ACL基因测序结果与牛(登录号为NM_001037457)、羊(登录号为NM_001038622)、人(登录号为NM_001096)、小鼠 (登录号为NM_001199296)和大鼠(登录号为NM_016987)⑶S序列进行同源性比较。版纳微型猪ACL基因的⑶S序列与牛、羊、人、小鼠和大鼠的同源性分别为93%、92%、91%、89%和 89%。版纳微型猪CDS序列所编码氨基酸序列与牛、羊、人、小鼠和大鼠的同源性分别为98%、 98%、98%、97%和97%。如说明书核苷酸和氨基酸序列表。7、ACL基因的进化树分析
利用Meg4软件的邻近(Neighbor-joining)方法构建版纳微型猪、牛、人、小鼠、大鼠以及羊ACL基因的系统进化树，结果显示版纳微型猪与牛和羊的亲缘性较近，其次是人、小鼠、大鼠。8、ACL蛋白分子量、等电点预测分析
使用ExPASy的在线软件Compute pi/MW分析版纳微型猪ACL蛋白的等电点(pi)为
7.12、理论分子量(pW)为 119843. 23 Da。9、ACL蛋白质二级结构预测分析
登陆http://bioinf. cs. ucl. ac. uk/psipred/,对各物种ACL蛋白质二级结构进行预测，结果显示，共有299个螺旋、173个延伸和628个卷曲结构。10、ACL蛋白质磷酸化位点预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,对猪 ACL 蛋白质憐酸化位点进行预测，结果显示，共有39个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点有19个、苏氨酸磷酸化位点有9个、酪氨酸磷酸化位点有11个。11、ACL蛋白质糖基化位点预测
登陆 http://www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/,对猪 ACL 蛋白质憐酸化位点进行预测，结果显示，共有三个糖基化位点，分别在第75位、第346位和第440位。12、ACL蛋白质疏水性分析
登陆http://web. expasy. org/protscale/,对ACL蛋白质疏水性进行分析，结果显示为亲水性蛋白。
权利要求
1.一种肌内脂肪沉积ACL基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, ACL)基因，其特征在于基因的CDS 序列全长为3276bp，其⑶S核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I，并且，⑶S核苷酸序列编码1091个氨基酸，氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2。
2.根据权利要求I所述一种肌内脂肪沉积ACL基因，其特征在于对上述特征的肌内脂肪沉积ACL基因设计引物，进行PCR扩增，检测ACL基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示ACL基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明ACL基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
全文摘要
本发明公开一种肌内脂肪沉积ACL基因，是从版纳微型猪肌肉组织中分离、克隆的与肌内脂肪沉积相关的ATP柠檬酸裂解酶(ATPcitratelyase,ACL)基因，基因的CDS序列全长为3276bp,其CDS核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1。并且，CDS核苷酸序列编码1091个氨基酸，氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2。检测ACL基因在猪心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪七个组织的组织表达谱，结果显示ACL基因在脂肪组织中表达量最高，初步表明ACL基因在脂肪细胞中调控脂肪沉积的功能。
文档编号C12Q1/68GK102604978SQ201110339150
公开日2012年7月25日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者刘维全, 朱宝利, 潘洪彬, 王聪, 王静, 赵素梅, 高士争, 黄英 申请人:云南农业大学