专利名称：微生物胶发酵液菌胶分离的一种方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域中细菌发酵液预处理的改良方法，具体涉及细菌代谢产物胶与细胞分离的方法及装置。
背景技术：
微生物胶也称微生物代谢胶，是指微生物在生长代谢过程中合成的一种生物聚合物，其组成通常为杂多糖。这种代谢产物胶粘附在微生物细胞表面或以不定形粘液状分泌到培养液中，对微生物起到保护作用。微生物产生的聚合物除了对其自身的生物学意义之夕卜，由于它具有安全无毒、理化性质独特、生产周期短、不受季节和地理环境条件的限制，具有较强的市场竞争力和广阔的发展前景。一些生物聚合物已经成为重要的生物技术产品，例如黄原胶、结冷胶、沃仑胶等已作为增稠剂、稳定剂、乳化剂和胶凝剂，广泛应用于石油、化工、制药和食品等多个领域。随着分子生物学的迅猛发展，微生物合成代谢胶的分子机理得到了充分认识，许多代谢胶的合成基因簇已解析，越来越多的研究者尝试利用基因工程的方法提高微生物胶产量，或者控制胶的分子组成从而提高微生物胶的性能。但微生物胶合成菌的基因工程改造存在转基因效率低的问题，其主要原因是细胞表面被代谢胶包裹从而阻碍外源DNA的进入。在微生物胶发酵液中，由于产物胶的分子量大，发酵液粘度高，微生物细胞会聚集形成含有几百至几万个细胞的巨大片层，而且产物胶与细胞紧密结合，用稀释和离心的方法无法脱除细胞表面的代谢胶，酸水解或高温加热的方法虽然能使菌胶分离，但同时破坏了细胞结构，从而导致细菌死亡。为了提高基因工程操作中转基因的效率，需要一种高效易行的方法，可脱除微生物胶发酵培养过程中紧密包裹在细胞表面的代谢胶，进而获得一种便于外源DNA进入的培养状态。
发明内容
本发明的目的是提供一种在不影响代谢胶合成菌存活的前提下，实现菌胶分离的方法和装置，适用于黄原胶、结冷胶、温轮胶和鞘氨醇胶Ss等微生物胶发酵液中细胞与细菌代谢胶的分离。微生物胶降解菌的富集驯化方法。降解菌驯化培养基A (g/L):微生物胶2.0,葡萄糖5.0,磷酸氢二铵1.0,酵母粉0.5。降解菌驯化培养基B (g/L):微生物胶5.0，葡萄糖1.0，磷酸氢二铵1.0，酵母粉
0.5。降解菌驯化培养基C (g/L):微生物胶10.0，磷酸氢二铵1.0，酵母粉0.5。取好氧活性污泥法城市污水处理厂的曝气池污泥，静置30min后，去掉上层清液，使污泥的挥发性悬浮固体(MLVSS)达5000mg/L以上，将此污泥样品按10%接种量接入驯化培养基A中，37°C摇床培养7 12天，至培养液的粘度< 50mpa.s将此培养液接种于驯化培养基B，相同条件下培养至粘度< 30mpa.s ;然后转接于培养基C中，并反复传代，直至富集到的降解菌能在3天内将I %的微生物胶溶解水化至粘度< IOmpa.S。本发明所述微生物胶发酵液的菌胶分离反应器。分离反应器由微生物胶发酵液培养罐和降解液培养罐两部分组成，整个反应器置于恒温培养箱内。降解液培养罐由磁力搅拌子实现溶液的均勻混合，在罐底部的空气分布器通过连接管与设于降解液培养罐外部的转子流量计和空气压缩机连接，曝气量由转子流量计控制；在罐顶部设有进料管和排气管，罐壁上设有I个补料口，通过补料管向罐内流加微生物胶溶液，流加速度由蠕动泵控制。微生物胶发酵液培养罐通过磁力搅拌实现溶液混合，在罐底部的空气分布器通过连接管先与一个0.22 μ m规格的的空气过滤器连接，然后接转子流量计和空气压缩机；在罐顶部设有进料管和排气管，罐壁上设有I个取样口，取样管一端置于液面下，一端延伸至罐外。微生物胶发酵液培养罐和降解液培养罐用0.22 μ m规格的微孔滤膜分隔，连接后用密封条和固定螺栓进行密封固定。本发明所述微生物胶发酵液的菌胶分离方法。安装完成整套菌胶分离反应器后，通过进料口向装置中加入相应的培养基，装料系数为50%，121°C 30min灭菌后，自然冷却至培养温度；向微生物胶发酵液培养罐中接入微生物胶合成菌，接种量为2%，搅拌曝气培养；向降解液培养罐中接入驯化成功的降解菌群，接种量为10 %，然后通过蠕动泵向降解液培养罐中流加微生物胶液，诱导产生代谢胶水解酶；水解酶通过两个培养装置间的滤膜，进入微生物胶发酵液培养罐，并降解脱除微生物胶合成菌表面的胶层；而降解菌细胞被滤膜阻挡无法进入另一侧的培养装置，因此不会污染微生物胶合成菌。分别控制上述2个培养装置的曝气量，以及微生物胶液的流加方式，实现发酵液中菌胶的有效分 离。本发明所述菌胶分离效果的测定方法。在分离装置运行过程中，通过微生物胶发酵液培养罐的取样管定时取样，结晶紫染色后，镜检观察微生物胶发酵液中细胞表面的胶层是否完全消失。同时向微生物胶发酵液中加入提取剂，观察是否有微生物胶沉淀析出。
图1是微生物胶发酵液的菌胶分离反应器。在图1中，I为空气压缩机，2为转子流量计，3为取样口，4为空气过滤器，5为排气管，6为进料口，7为磁力搅拌转子，8为空气分布器，9为密封条，10为过滤膜，11为固定螺栓，12为补料口。
具体实施例方式实施例1 本发明提供的微生物胶样品的制备。
取一定量的黄原胶、结冷胶、温轮胶和鞘氨醇胶Ss粉末，加入水使胶溶液达到设定浓度，充分搅拌使之分散均匀，4°C溶胀过夜，恢复至室温待用。
实施例2本发明提供的微生物胶降解菌驯化培养基的配制。按实施例1的方法配制0.4%、1.0%、2.0%的微生物胶溶液，充分溶胀后，按照培养基配方将葡萄糖、磷酸氢二铵和酵母粉溶解于相同体积的水中，两者混合并搅拌均匀，无需灭菌，即可用作驯化培养基。实施例3本发明提供黄原胶发酵液的菌胶分离方法。 通过进料口向微生物胶发酵液培养罐中加入培养基，其组成为(g/L):可溶性淀粉20.0，蛋白胨2.0，牛肉粉1.0，酵母粉1.0 ;向降解液培养罐中加入的培养基组分为(g/L):蛋白胨2.0，牛肉粉1.0，酵母粉1.0。分别接种后，一次性向降解液培养罐中流加0.4%的黄原胶溶液，使降解液培养罐的装料系数达到70% ;控制黄原胶发酵培养的通气量为
0.3vvm,降解液培养的通气量为0.6vvm ;30°C恒温培养24h后，以0.lmL/min的流速向降解液培养罐中流加黄原胶溶液。培养36h后,每隔4h取样一次,每次取样体积为20mL,镜检观察细菌细胞周围胶层的脱除情况，加入3倍体积的90%乙醇溶液，应无黄原胶沉淀现象；整个培养周期为52 60h。实施例4本发明提供结冷胶发酵液的菌胶分离方法。微生物胶发酵液培养罐中加入的培养基组成为(g/L):葡萄糖15.0，硝酸钠3.0，磷酸氢二钾0.5，酵母粉0.5 ;降解液培养罐中加入的培养基组分为(g/L):硝酸钠3.0，磷酸氢二钾0.5，酵母粉0.5。分别接种后，一次性向降解液培养罐中流加0.5%的结冷胶溶液，使降解液培养罐的装料系数达到70%;控制结冷胶发酵培养的通气量为0.4vvm,降解液培养的通气量为0.5vvm ;30°C恒温培养24h后，以0.lmL/min的流速向降解液培养罐中流加结冷胶溶液。培养24h后，每隔4h取样一次，每次取样体积为20mL，镜检观察细菌细胞周围胶层的脱除情况，加入3倍体积的90%乙醇溶液，应无结冷胶沉淀现象；整个培养周期为48h左右。实施例5本发明提供温轮胶发酵液的菌胶分离方法。微生物胶发酵液培养罐中的培养基组成为(g/L):蔗糖20.0，蛋白胨2.0，硫酸铵0.9，酵母粉0.2 ;降解液培养罐中的培养基组分为(g/L):蛋白胨2.0，硫酸铵0.9，酵母粉0.2。分别接种后，一次性向降解液培养罐中流加0.3%的温轮胶溶液，使降解液培养罐的装料系数达到70% ;控制温轮胶发酵培养的通气量为0.2vvm,降解液培养的通气量为
0.6vvm ;30°C恒温培养30h后，以0.lmL/min的流速向降解液培养罐中流加温轮胶溶液。培养42h后，每隔4h取样一次，每次取样体积为20mL，镜检观察细菌细胞周围胶层的脱除情况，加入2.5倍体积的90%乙醇溶液，应无温轮胶沉淀现象；整个培养周期为60 72h。实施例6本发明提供鞘氨醇胶Ss发酵液的菌胶分离方法。微生物胶发酵液培养罐中的培养基组成为(g/L):糊精18.0，蛋白胨2.0，牛肉粉
0.5，酵母粉0.5 ;降解液培养罐中加入的培养基组分为(g/L):蛋白胨2.0，牛肉粉0.5，酵母粉0.5。分别接种后，一次性向降解液培养罐中流加0.5%的鞘氨醇胶Ss溶液，使降解液培养罐的装料系数达到70%;控制鞘氨醇胶Ss发酵培养的通气量为0.3vvm,降解液培养的通气量为0.5vvm ;30°C恒温培养24h后，以0.1mL/min的流速向降解液培养罐中流加鞘氨醇胶Ss溶液。培养24h后，每隔4h取样一次，每次取样体积为20mL，镜检观察细菌细胞周围胶层的脱除情况，加入2mo1/L的盐酸溶液将发酵液的pH调节至3.0，应无鞘氨醇胶Ss沉淀现象；整个培养周期为48 56h。
权利要求
1.一种微生物胶发酵液的菌胶分离反应器，适用于黄原胶、结冷胶、温轮胶和鞘氨醇胶Ss，其特征在于包括微生物胶发酵液培养罐和降解液培养罐。
所述降解液培养罐由磁力搅拌子实现溶液的均匀混合，在罐底部的空气分布器通过连接管与设于降解液培养罐外部的转子流量计和空气压缩机连接，曝气量由转子流量计控制；罐顶部设有进料管和排气管；罐壁上设有I个补料口，通过补料管向罐内流加微生物胶溶液，流加速度由蠕动泵控制。
微生物胶发酵液培养罐通过磁力搅拌实现溶液混合，在罐底部的空气分布器通过连接管先与一个0.22 μ m规格的的空气过滤器连接，然后接转子流量计和空气压缩机；在罐顶部设有进料管和排气管，罐壁上设有I个取样口，取样管一端置于液面下，一端延伸至罐外。
微生物胶发酵液培养罐和降解液培养罐用0.22 μ m规格的微孔滤膜分隔，连接后用密封条和固定螺栓进行密封固定。
2.生物胶降解菌的富集驯化方法，包括以下步骤: 将挥发性悬浮固体(MLVSS)达5000mg/L以上的活性污泥，按10%接种量接入驯化培养基A中，37°C摇床培养7 12天，至培养液的粘度< 50mpa.s ;将此培养液接种于驯化培养基B，相同条件下培养至粘度< 30mpa.s ;然后转接入培养基C中，并反复传代，直至富集到的降解菌能在3天内将I %的微生物胶溶解水化至粘度< IOmpa.S。
3.按权利要求2所述的微生物胶降解菌的富集驯化中，其特征在于驯化培养基每升溶液中的组分和浓度为:降 解菌驯化培养基A(g/L):微生物胶2.0，葡萄糖5.0，磷酸氢二铵1.0，酵母粉0.5 ;降解菌驯化培养基B(g/L):微生物胶5.0，葡萄糖1.0，磷酸氢二铵1.0，酵母粉0.5 ;降解菌驯化培养基C(g/L):微生物胶10.0，磷酸氢二铵1.0，酵母粉0.5。
4.生物胶发酵液的菌胶分离方法，包括以下步骤:其特征在于向微生物胶发酵液培养罐中接入产胶菌种，搅拌曝气培养；向降解液培养罐中接入驯化成功的降解菌群，并流加微生物胶液，诱导产生代谢胶水解酶；降解菌细胞被滤膜阻挡，由其产生的水解酶通过两个培养装置间的滤膜，进入微生物胶发酵液培养罐，降解脱除微生物胶合成菌表面的胶层。
5.按权利要求4所述的微生物胶发酵液的菌胶分离方法中，其特征在于黄原胶菌胶分离步骤中，向降解液培养罐中流加的黄原胶溶液浓度为0.4%。黄原胶发酵培养的通气量为0.3vvm,降解液培养的通气量为0.6vvm。
6.按权利要求4所述的微生物胶发酵液的菌胶分离方法中，其特征在于结冷胶菌胶分离步骤中，向降解液培养罐中流加的结冷胶溶液浓度为0.5%。结冷胶发酵培养的通气量为0.4vvm,降解液培养的通气量为0.5vvm。
7.按权利要求4所述的微生物胶发酵液的菌胶分离方法中，其特征在于温轮胶菌胶分离步骤中，向降解液培养罐中流加的温轮胶溶液浓度为0.3%。温轮胶菌发酵培养的通气量为0.2vvm,降解液培养的通气量为0.6vvm。
8.按权利要求4所述的微生物胶发酵液的菌胶分离方法中，其特征在于鞘氨醇胶Ss菌胶分离步骤中，向降解液培养罐中流加的鞘氨醇胶Ss溶液浓度为0.5%。鞘氨醇胶Ss发酵培养的通气量为0.3vvm,降解液培养的通气量为0.5vvm。
全文摘要
微生物胶发酵液菌胶分离的一种方法及装置，属于微生物技术领域。本发明包括一种微生物胶降解菌富集驯化方法，以及利用降解菌群的作用实现发酵液中细菌代谢胶与细胞分离的方法及装置，适用的微生物胶包括黄原胶、结冷胶、温轮胶和鞘氨醇胶Ss。反应装置由微生物胶发酵液培养罐和降解液培养罐两部分组成，分别设有曝气、搅拌、进料和排气装置。在降解液培养罐中流加相应的微生物胶，诱导降解菌产生代谢胶水解酶，水解酶通过两个培养装置间的滤膜进入发酵液培养罐，并降解脱除微生物胶合成菌表面的胶层；同时降解菌被滤膜阻挡无法进入另一侧的培养装置，因此不会污染微生物胶合成菌。
文档编号C12M1/02GK103087897SQ201110338699
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者黄海东, 韩孝强, 周吉东 申请人:天津农学院