专利名称：菲利普孢囊线虫特异性scar标记及其快速pcr检测方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记全序列、特异性 SCAR标记引物序列及菲利普孢囊线虫SACR特异性快速PCR检测方法。
背景技术：
小麦孢囊线虫(CCN)是温带禾谷作物上的世界性重要病原线虫，自1874年在德国被发现以来，随后在英国、俄罗斯、挪威、澳大利亚、加拿大、日本、印度、美国、新西兰、中国等40多个国家均发生不同程度的危害，严重影响禾谷作物尤其是对麦类作物的产量和质量。我国自1989年彭德良等首次在我国湖北天门县发现禾谷孢囊线虫为害小麦后，目前已发现在湖北、河北、河南、北京、山西、内蒙古、青海、安徽、江苏、山东、甘肃、陕西、宁夏等13 省市都有CCN的分布。CCN已成为严重威胁我国小麦生产的主要病害。小麦禾谷孢囊线虫(CCN)最早是被德国人Kuhn在1874年发现的，起初被认为是甜菜孢囊线虫(Heterodera schachtii)，1934年Filipjev单独建立了一个种H. avenae。目前这些危害禾谷类作物的Heterodera属的孢囊线虫种统一被定义为禾谷孢囊线虫组。在这个组群中对禾谷类作物危害最大的为三个种，禾谷孢囊线虫(H. avenae)，菲利普孢囊线虫(H. filipjevi)和大麦孢囊线虫(H. Iatipons)。菲利普孢囊线虫(H. filipjevi) 1981年首次在塔吉克斯坦发现，目前已经德国、 英国、瑞士、挪威、伊朗、美国等国家发生危害，是国际小麦等禾谷类作物生产中面临的潜在威胁性线虫。2009年彭德良等在我国河南省开展小麦孢囊线虫病发生危害和跨区收割是否传播小麦孢囊线虫病的调查中首次采集和鉴定出菲利普孢囊线虫，目前菲利普孢囊线虫已经在河南省的许昌市，临颍县，卫辉县，延津县等地区发现和危害小麦。菲利普孢囊线虫与禾谷孢囊线虫(H. avenae)非常相似。主要区别在于其阴门锥有明显的下桥结构。目前菲利普孢囊线虫的鉴定多数情况下仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，生理小种和致病性的鉴定主要是用鉴别寄主或寄主植物的不同品种的反应型来确立。但形态学鉴定非常困难，需要许多的技术、耗时、费力且许多表型特征的不稳定性，形态特征测量值有重叠等原因使鉴定时常出现误差。以PCR为基础的分子生物学技术为解决线虫鉴定诊断存在的问题提供了最有力的工具。特异性引物PCR或多重PCR技术是近年来线虫分子诊断取得的重要进展。通过一次PCR测验就可以在混合样品中特异性地检测出一个或多个线虫种。基于核糖体 DNA(rDNA)而构建的线虫特异性引物进展较快，在诊断根腐线虫、根结线虫中取得了突破性进展，形成了特异性诊断4种重要根腐线虫如穿刺根腐线虫P. penetrans、斯克里布根腐线虫P. scribneri、咖啡根腐线虫P. Coffeae和卢赛根腐线虫P. Ioosi的特异性引物，以及3 种根结线虫如戚乌得根结线虫M. Chitwoodi、法拉克斯根结线虫M. fallax和北方根结线虫 M. Hapla(Zi jlstra, C. 1997，Petersen et al.，1997，Williamson et al.，1997)的特异性引物，诊断的水平达到单条幼虫的水平。Mulholland et al. (1996)分别构建了马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的特异性引物，描述了一种基于rDNA-ITS区域特异性等位多重PCR技术检测这两种线虫的方法，能快速鉴定马铃薯白线虫和马铃薯金线虫及其复合种群。与标准的PCR途径不同，这一技术在每个PCR反应中应用了 3个引物，通用引物5. SSrRNA、马铃薯金线虫的特异性引物ITSl-Gr 和马铃薯白线虫的特异性引物ITSl-Gp。Bulman & Marshall (1997)成功应用多重PCR技术快速诊断马铃薯孢囊线虫。在研究了秘鲁和澳大利亚的马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的 rDNA-ITS的序列结构基础上，构建了马铃薯金线虫的特异性引物PITSrf和白线虫的特异性引物PITSp4，通用引物ITS5与PITSrf可以扩增34!3bp马铃薯金线虫的特异性片段，与 PITSp4可以扩增出265bp特异性识别马铃薯白线虫的DNA片段。在一个PCR反应中，使用 PITSr3，PITSp4和ITS5这3个引物，即使复合种群中金线虫DNA的含量仅为白线虫的百分之一，也能从复合种群检测出金线虫。彭德良和SiAbotin等Q001)构建了基于rDNA-ITS区域上的大豆孢囊线虫特异性引物GlyFl，应用两组引物D3A和D!3B及大豆孢囊线虫种特异性引物GlyFl和引物rDNA2 成功地对大豆孢囊线虫进行了分子诊断研究。第一对引物D3A和D!3B是证实PCR扩增的成功性，第二对引物GlyFI和rDNA2是特异性检测大豆孢囊线虫。用这两对引物进行的双倍PCR扩增，从所有52个大豆孢囊线虫群体都扩出了大豆孢囊线虫的特异性DNA片段 (ISlbp)，而在所有测试的其他8种孢囊线虫22群体没有ISlbp片段。大豆孢囊线虫种特异性引物GlyFl灵敏性非常高，能从单条幼虫的微量DNA中扩增出大豆孢囊线虫种特异性片段。Amiri,Subbotin 等 Q002)构建了基于 rDNA-ITS 的甜菜孢囊线虫(H. schachtii) 特异性引物SHF6。将特异性引物SHF6与通用引物AB^引物结合，同时将通用引物D2A和 D3B放在一个PCR反应体系中，从58个孢囊线虫群体中成功地鉴定出甜菜孢囊线虫，从36 个甜菜孢囊线虫群体中扩增200bp特异性片段，而没有甜菜孢囊线虫(H. schachtiDDNA的样品没有200bp的片段。而基于基因组DNA的SCAR标记植物线虫特异性引物进展较慢。但在马铃薯金线虫和马铃薯白线虫的快速分子诊断中取得进展，Fullanodo, A. et. al. (1999)用随机引物 0PG5分别扩增出区分马铃薯金线虫特异性RAPD标记片段为826bp，马铃薯白线虫特异性 RAPD标记片段为llOObp。对扩增出的马铃薯金线虫和白线虫的RAPD标记片段进行全序列分析，将RAPD标记转化成SCAR标记，设计出马铃薯金线虫FullGrf和FullGrr以及马铃薯白线虫的SCAR特异性标记引物Ful IGpf和Fu 1 IGpr，用Ful IGrf和Ful IGrr扩增出了 315bp 马铃薯金线虫的特异性片段，用FullGpf和FullGpr扩增出798bp的马铃薯白线虫的特异性片段。Ou, S. Q. Peng D. L.(欧师琪彭德良等200 采用RAPD技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建了特异性SCAR标记的特异性引物SCNFI和SCNRI， PCR扩增出500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D!3B作为内标与上述特异性引物SCNFl和SCNRl相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，在 PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了 500bp的特异性SCAR标记片段和SOObp片段。国内外虽然有关于菲利普孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域研究报道，但是没有关于菲利普孢囊线虫特异性引物的报道，更没有关于基于基因组DNA的菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物检测菲利普孢囊线虫的研究报道。
发明内容
针对上述技术领域的空白，本发明提供菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的全长序列，同时提供了特异性SCAR标记的特异性引物。本发明还提供菲利普孢囊线虫SACR特异性快速PCR检测方法，为制定线虫的快速分子检测、菲利普孢囊线虫病的早期诊断和制定线虫病害综合治理对策服务。菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于具其如SEQ ID NOl所示的核苷酸序列。根据菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段的设计的特异性引物。优选特异性引物为HfFl和HfRl，其序列为HfFl :5’ -AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3，，HfRl 5' -ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3’。菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述引物HfFl禾口 HfRl。所述PCR反应体系中还含有通用引物。所述通用引物序列为TW81:5’ -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3 ’，AB28 :5， -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3，。所述PCR检测为一步双重PCR检测。本发明利用RAPD技术，获得了基于菲利普孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记，将RAPD标记转换成SCAR标记，经克隆测序后获得了特异性SCAR标记的全长序列SEQ IDN01，根据该特异性SCAR标记，可以设计出其特异性引物，用于菲利普孢囊线虫的快速 PCR检测。本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HfFl和HfRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用菲利普孢囊线虫特异性引物HfFl和HfRl，在PCR扩增条件下，所有菲利普孢囊线虫群体都获得了 313bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有313bp的特异性 SCAR标记片段。为防止假阴性反应，可以在PCR反应体系中加入通用引物作内标。本发明选用核糖体引物TW81和AB^与上述特异性引物HfFl和HfRl相结合，利用一步双重PCR 方法检测菲利普孢囊线虫，在PCR扩增条件下，菲利普孢囊线虫群体都获得了 313bp的特异性SCAR标记片段和IOOObp片段，而其它线虫类则没有31!3bp的特异性SCAR标记片段，只有IOOObp片段，增加了可靠性。本发明构建的特异性引物HfFl和HfRl，其特异性强，准确， 灵敏。本发明应用特异性SCAR标记及核糖体基因相结合的一步双重聚合酶链式反应 PCR检测技术检测目标线虫，与重复性较差的RAPD技术(RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性内切酶技术(RFLP-PCR)检测方法相比，更能够省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的菲利普孢囊线虫检测技术。该技术可应用于对菲利普孢囊线虫田间土壤样品及菲利普孢囊线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
图1 用随机引物0PC06扩增菲利普孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、大豆孢囊线虫和 Heterodera Iatipons等线虫群体的RAPD的特异性DNA片段结果，M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2, 000) ； 1-6分别为菲利普孢囊线虫(编码为HfOl，Hf02, Hf07, HflO, Hf 11，Hf 12)，7-8分别为禾谷孢囊线虫群体(编码为HaOl， Ha02)，9-ll分别为大豆孢囊线虫群体(编码为HgOl，Hg02，Hg03) ； 12为Heterodera Iatipons群体(编码为H101) ；13为阴性对照；图2 用菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物(HfFl和HfRl)扩增菲利普孢囊线虫的结果，M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2, 000) ；1-11分别为菲利普孢囊线虫不同群体(编码为 HfOl, Hf02, Hf03, Hf04, Hf05, Hf06, Hf07, Hf08, Hf09, HflO, Hfll) ；12 为禾谷孢囊线虫群体(编码为HaOl) ；13为大豆孢囊线虫群体(编码为HgOl) ；14为阴性对照；图3 菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(TW81和AB28)结合一步双重PCR检测结果，M为标准DNA分子标记(DNA marker DL 2, 000) ；1-11分别为菲利普孢囊线虫 (HfOl, Hf02, Hf03, Hf04, Hf05, Hf06, Hf07, Hf08, Hf09, HflO, Hfll) ；12 为阴性对照；图4 菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记引物与通用引物(TW81和AB28)结合一步双重PCR检测5种孢囊线虫的结果，M为标准DNA分子标记(DNA marker IOObp) ;1_4为菲利普孢囊线虫群体HfOl， Hf02, Hf07, HflO ；5-12 为禾谷孢囊线虫群体 HaOl，Ha02, Ha03, Ha04, Ha05, Ha06, Ha07, Ha08 ；13为大豆孢囊线虫群体HgOl ；14为马铃薯腐烂茎线虫群体DdOl ；15为香蕉穿孔线虫群体 RsOl ；16 为 Heterodera Iatipons 群体 HlOl ；17 阴性对照
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。本发明的实验选用的材料12个菲利普孢囊线虫群体为本实验室长期从河南省许昌市，临颍县，卫辉县，等地收集保存的孢囊线虫种群，8个禾谷孢囊线虫群体为本实验室从北京、河北、河南等省市收集保存。3个大豆孢囊线虫群体，1个豌豆孢囊线虫群体，1个旱稻孢囊线虫群体，1个马铃薯腐烂茎线虫群体，1个香蕉穿孔线虫群体为本实验保存(见表1、表2)。上述线虫本实验室均有保存，可以对公众发放。表1菲利普孢囊线虫样品代码及群体来源
权利要求
1.菲利普孢囊线虫特异SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具其SEQID NOl所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的特异性引物为HfFl和HfRl，其核苷酸序列为HfFl 5' -AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3，，HfRl :5，-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3，。
4.菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有权利要求2所述的特异性引物。
5.菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述的特异性引物为HfFl和HfRl， 其核苷酸序列为HfFl 5' -AATCCTTACACCGTTGTTTATTA-3，，HfRl :5，-ATTCTTCCTCCTTCTCCCACTAT-3，。
6.根据权利要求4或5所述的菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述PCR 反应体系中还含有通用引物。
7.根据权利要求6所述的菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述通用引物序列为TW81 5' -GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3，，AB28 :5’ -ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3，。
8.根据权利要求7所述的菲利普孢囊线虫SCAR标记快速PCR检测方法，所述PCR检测为一步双重PCR检测。
全文摘要
本发明为“菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记及其快速PCR检测方法”，属生物技术领域。菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段，其特征在于该DNA片段具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根据菲利普孢囊线虫特异性SCAR标记的DNA片段设计的引物HfF1和HfR1，在PCR快速检测菲利普孢囊线虫的方法中，可扩增出313bp的片段，同时还可以在PCR反应体系中加入通用引物TW81和AB28作为内标，能同时扩增出1000bp的片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在菲利普孢囊线虫检测和菲利普孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK102329793SQ20111033865
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月31日 优先权日2011年10月31日
发明者亓晓莉, 彭德良, 彭焕, 贺文婷, 黄文坤 申请人:中国农业科学院植物保护研究所