专利名称：豌豆孢囊线虫特异性rapd标记和scar标记快速分子检测方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记全序列、特异性SCAR标记引物序列及豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法。
背景技术：
豌豆孢囊线虫(H. goettingiana Liebscher, 1892),是欧洲一些国家中侵染豌豆的主要病害。目前已在欧洲、非洲、前苏联和地中海地区有分布，美国也有报道，但是相关分布范围较小。豌豆孢囊线虫在我国的分布和传播正在调查中，目前在青海，湖北，四川等地均有为害大豆的发现。豌豆孢囊线虫的寄主主要为豆科的豌豆(PisumsativumL.),蚕 豆(Viciafaba)JHl5_M (Viciaspp.),大豆(Glycines max),小扁豆(Lens sculenta)等(Winslow R D.Provisional lists of host plants of some root eelworm(Heteroderaspp.). Annals of Applied Biology 1954，41:591-605),此外还可寄生野草寄主，寄主范围相对较窄。通常进行3-6年轮作就可降低豌豆孢囊线虫种群水平不对寄主构成危害，但必须严格控制野草寄主(Di Vito M, Greco N. The pea cyst nematode. In:Lamberti, F. &Taylor, C. E. (Eds). Cyst nematodes. New York & London, Plenum Press 1986,321-332)。被侵染的豌豆植株会矮化，叶片变黄，根部分支减少，不能开花或者花过早脱落，同受大豆孢囊线虫侵染的大豆一样，豌豆的根部发育不良。豌豆孢囊线虫完成一代大约需要3-15周，时间随着土壤温度的改变而变化。含有卵的孢囊即使在无寄主的条件下也能存活12年。豌豆孢囊线虫侵染后，豌豆开花期表现出矮缩黄萎，豌豆孢囊线虫抑制豌豆根瘤的形成和固氮作用，从而使豌豆产量降低，同时还可导致植株对土壤中一些对根部为害的菌类敏感，从而造成线虫与菌类的复合侵染。目前豌豆孢囊线虫的鉴定大部分仍然依赖于传统的形态学鉴定方法，豌豆孢囊线虫的孢囊与其近缘属种的孢囊形态类似，形态学鉴定耗时、需要很熟练的技术作为基础，并且需要专门从事分类的人员来完成，因此豌豆孢囊线虫传统的形态学鉴定方法不适用于大规模的样品检测且不能有效的调查豌豆孢囊线虫的分布和扩散。为了弥补形态学鉴定的不足，快速、准确的对农作物孢囊线虫进行鉴定和检测，分子检测技术迅速发展。20世纪80年代后期发展成功的DNA多聚酶链式反应(PCR技术)，使得直接扩增DNA成为可能，在PCR基础上还产生了各种新的分子标记技术，例如RFLP，RAPD, AFLP, Real-time PCR, SSR等。这些分子标记和检测技术都成功的应用到植物寄生线虫特别是农作物孢囊线虫的分类鉴定和检测过程中。各种分子标记检测技术各有利弊，在这些分子标记中，RAPD标记(RandomAmplified Polymorphism DNA)的优点在于所需DNA量极少，要求设备也相对简单。在植物寄生线虫的分子检测中应用也越来越广泛。RAPD标记由Wi 11 iams等和Welsh等两个研究小组在1990年发现。随着RAPD技术的应用，RAPD的缺点也凸显出来，由于RAI3D引物非常短，只有十个碱基，退火温度也较低，如果PCR体系变化，或者仪器变化，重复性会变差，而且易产生非特异性的条带。为了弥补这一不足，Paran和Michelmore于1993年提出可以将其转为 SCAR (sequence characterized amplified region)标记(Paran I, MichelmoreR W. Development of reliable PCR—based markers linked to downy mildew risistencegenes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics 1993，85:985-993.)，并应用到了快速分子检测中。在抱囊线虫的RAPD 检测实例方面，Edward P. CaswelI-Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj Valerie M，Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphicDNA analysis of Heterodera cruciferae and H. schachtii populations. Journal ofNematology 1992，24(3) :343-351)运用 RAPD 标记区分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用10个不同的随机引物扩增燕麦孢囊线虫的不同种群的DNA，产生了 78条清晰的谱带。1995 年 Lopez-Braiia I 等(Lopez-Braiia I，Romero M D，Delibes A. Analysis ofHeterodera avenae populations by the random amplifiedpolymorphic DNAtechnique.Genome 1995，Vol. 39:1996)对禾谷孢囊线虫群体做了 RAPD分析。1996年，Jianbo Li等 (Jianbo Li，Jamal Faghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA asmarkers for virulence characteristics in soybean syst menatode. Fundamental AndApplied Nematology 1996，19 (2) : 143-150)用RAPD标记技术研究了大豆抗性品种与大豆孢囊线虫的致病型之间的关系。1997年，Blok V. C.等(Blok V C，Philips，Harrower BE. Comparison of British populations of potato cyst nematodes with populationsfrom continental Europe and south America using RAPDs. Genome 1997,40:286-293)通过RAPD技术研究马铃薯金线虫和马铃薯白线虫两个群体的线虫致病型之间的遗传关系ORAH)标记与SCAR标记的联合应用后，在孢囊线虫的分子检测方面也取得了—定进展，例如 Fullanodo，A. et. al (Fullaondo A，Barrena Ej Viribay M，BarrenaI,Salazar A，Ritter E.Identification of potato cyst nematode species Globoderarostochiensis and G. pallida by PCR using specific primer combinations.Nematology 1999，1:157-163)用随机引物0PG5分别扩增出区分马铃薯金线虫和马铃薯白线虫特异性RAH)标记片段，转化成SCAR标记后，分别扩增出了 315bp的马铃薯金线虫片段和 798bp 的马铃薯白线虫片段。Ou，S.Q.，Peng D. L (Ou S Qj Peng D L，Li Y，MoensM.Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region (SCAR) primers. Nematology 2008，10(3) : 397-403)米用 RAPD 技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，构建的特异性SCAR标记引物扩增出500bp大豆孢囊线虫的特异性SCAR片段，选用核糖体引物D2A和D3B作为内标与上述特异性引物SCNFl和SCNRl相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫，在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了 500bp的特异性SCAR标记片段和800bp片段。在其他线虫的检测方面，RAH)和SCAR标记也有不少应用，例如Meng Qing-peng等(Meng Qingpengj Long H，Xu J H. PCR assays for rapid and sensitive identificationof three majorroot-knot nematodes,Meloidogyne incognita, M. javanica andM. arenaria. Acta Phytopathologica Sinica 2004, 34 (3) : 204-210)成功地将南方根结线虫和爪哇根结线虫特异的随机扩增多态性DNA片段转化为SCAR标记。Adam Μ. A. M.等(Adam M A M，Phillips M S，Blok V C. Molecular diagnostic key for identificationof single juveniles of seven common and economically important species ofroot-knot nematode (Meloidogyne spp.). Plant Pathology 2007，56:190-197)运用 SCAR标记技术区分了根结线虫属的七种线虫。国内外虽然有关于豌豆孢囊线虫核糖体DNA的ITS区域的研究报道，但在我国，豌豆孢囊线虫的报道较少，并且国内外尚未见基于基因组DNA的RAPD和SCAR标记特异性分子检测豌豆孢囊线虫的报道。
发明内容
针对上述技术领域的空白，本发明提供豌豆孢囊线虫特异性RAro标记的全长序列，同时设计SCAR标记特异性引物将RAPD标记转化为更加稳定的SCAR标记，提供豌豆孢囊线虫特异性RAPD和SACR标记的快速分子检测方法，为制定线虫的快速分子检测、豌豆孢囊线虫病的早期诊断和制定线虫病害综合治理对策服务。 豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。根据豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。优选该特异性引物HgoFl和HgoRl，其序列为HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有上述特异性引物HgoFl和HgoRl。所述反应体系反应体系总体积为25μ 1，其中2.5μ I IOXPCR含Mg2+的Buffer ；2. Ομ IdNTP ；1. Ομ I 引物 HgoFl (O. I μ g/μ 1)；1. Ομ I 引物 HgoRl (O. I μ g/μ I)；O. 25 μ I Taq DNA聚合酶(5U/μ I) ；1.0μ I模板DNA (豌豆孢囊线虫及其它孢囊线虫群体提取的基因组DNA) ;(1(1!120补足2541。所述PCR 的扩增程序为94°C预变性 5min，然后 94°C 30S，56°C 30S，72°C Imin 循环35次，72°C延伸lOmin，保存在4°C条件下。本发明利用RAPD技术，获得了基于豌豆孢囊线虫基因组DNA的特异性RAPD标记，经克隆测序后，设计SCAR标记引物，将RAPD标记转换成SCAR标记，利用该SCAR标记的特异性引物，可检测出目标线虫。本发明构建了特异性SCAR标记的特异性引物HgoFl和HgoRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用此特异性引物，在PCR扩增条件下，所有豌豆孢囊线虫群体都获得了544bp的特异性SCAR标记片段，而其它线虫类则没有544bp的特异性SCAR标记片段。本发明构建的特异性引物HgoFl和HgoRl，特异性强，准确，灵敏。本发明应用特异性SCAR标记PCR检测技术检测目标线虫，与重复性较差的RAPD技术(RAPD-PCR)、核糖体DNA限制性内切酶技术(RFLP-PCR)检测方法相比，能够更省时、准确、灵敏，更能建立快速、准确的豌豆孢囊线虫检测技术。该技术可应用于对豌豆孢囊线虫发生的大豆田间土壤样品及豌豆孢囊线虫病发生的早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
图I :用12个Operon系列的含10个碱基的随机引物对豌豆孢囊线虫HgoOl进行扩增的扩增结果，M 为标准 DNA 分子标记(DNA marker DL 2，000);1_12 :随机引物 OPAtl2, OPA06, OPA09，OPA13, OPA18, OPB15, OPC06, OPD13, OPG06, OPG08, OPG10, OPK16; 13 :阴性对照。(代码见表 I 和表 2)图2 :用随机引物OPAtl6扩增豌豆孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、大麦孢囊线虫、香蕉穿孔线虫、马铃薯腐烂茎线虫等的RAH)的特异性DNA片段结果，M 为标准 DNA 分子标记(DNA marker DL 2，000)；l-9:Hgo01, Hgo02, Hgo03, Hgo04,Hgo05, Hgo08, Hgo09, HgolO, Hgol2; 10-20:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, HgOI, Hg03, HeOl, He04, H101,Rs01,Dd01;21 :阴性对照。(代码见表I)图3 :用豌豆孢囊线虫特异性SCAR标记引物(HgoFl和HgoRl)扩增6种孢囊线虫 和2种非孢囊线虫的结果，M 为标准 DNA 分子标记(DNA marker DL 2，000);l_12:Hgo01，Hgo02, Hgo03, Hgo04，Hgo05, Hgo06, Hgo07, Hgo08, Hgo09, HgolO, Hgol 1，Hgol2; 13-23:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, Hg
01,Hg03, HeOl, He04, H101, RsOl, DdOl; 24 :阴性对照。(代码见表 I)
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。本发明的实验选用的材料供试线虫包括19个禾谷孢囊线虫群体，11个菲利普孢囊线虫群体，3个大豆孢囊线虫群体，12个豌豆孢囊线虫群体，5个旱稻孢囊线虫群体，I个大麦孢囊线虫群体,I个马铃薯腐烂茎线虫群体，I个松材线虫群体，I个香蕉穿孔线虫群体，共计54个线虫群体。如表I所示。所述供试线虫样品可以对公众发放。表I供试线虫样品代码及群体来源
权利要求
1.豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.根据权利要求I所述的豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段的保守序列设计的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的特异性引物为HgoFl和HgoRl，其序列为HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。
4.豌豆孢囊线虫SCAR标记快速分子检测方法，其特征在于PCR反应体系中含有权利要求2或3所述的特异性引物。
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述的特异性引物为HgoFl和HgoRl，其序列为HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。
6.根据权利要求5所述的检测方法，所述反应体系总体积为25μ1，其中2. 5μ I10 X PCR 含 Mg2+的 Buffer ;2·0μ I dNTP ；1. Ομ I 浓度为 O. I μ g/μ I 的引物 HgoFl ；1. Ομ I浓度为O. I μ g/ μ I的引物HgoRl ；0. 25 μ I浓度为5U/ μ I的Taq DNA聚合酶；1. O μ I模板DNA ;ddH20 补足 25 μ I。
7.根据权利要求6所述的检测方法，所述PCR的扩增程序为94°C预变性5min，然后940C 30S,56°C 30S,72°C Imin 循环 35 次，72°C延伸 lOmin，保存在 4°C条件下。
全文摘要
本发明为“豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记和SCAR标记快速分子检测方法”，属生物技术领域。豌豆孢囊线虫特异性RAPD标记的DNA片段，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根据该豌豆孢囊线虫特异性RAPD扩增片段，设计特异性引物HgoF1和HgoR1，将其转化为更加稳定的SCAR标记片段，在SCAR标记快速分子检测豌豆孢囊线虫的方法中，可扩增出544bp的特异性片段。本发明提高了分子检测灵敏度并且快速准确，在豌豆孢囊线虫检测以及豌豆孢囊线虫病的早期诊断方面，具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/11GK102690825SQ201210200468
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者丁中, 亓晓莉, 彭德良, 彭焕, 贺文婷, 黄文坤 申请人:中国农业科学院植物保护研究所