专利名称：一种大肠埃希氏菌多重pcr试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是一种大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒及其检测方法，特别是一种鉴定大肠埃希氏菌及其种系发育群的多重PCR试剂盒及其检测方法。
背景技术：
大肠埃希菌(Escherichia, coli, E. coli)属是肠杆菌科中一大群生物学特性极其相似的革兰氏阴性菌，在自然界中广为分布，是人和动物的共生菌之一，但有些菌株常可引起人和动物感染，近年来E. coli感染已位居临床感染病例第一位。此外，E. coli也是食品污染的主要细菌。E. coli种类繁多，菌体表面结构复杂，且致病菌与非致病菌之间不易区别，采用传统的生物学鉴定方法不但复杂、准确性差，而且费时；采用血清学方法鉴定，不但血清型种类繁多，鉴定时必须有标准血清，而且血清型与致病性没有必然联系。近年来对E. coli进行种系发育进化研究分析将大肠埃希氏菌划归到四个种系发育群(八31，82和0)， 肠外感染的强毒株主要属于B2群,肠出血性菌株属于D群,大多数共生菌株属于A群,动物感染菌株主要属于B1群。但由于肠杆菌科至少有12个属，E. coli与其他11个属之间的生物学特性也极为相近，难以区别，至今尚缺少快速、简便、特异的鉴定方法。因此，建立一种准确、简单、快捷、既能区别E. coli与不同属成员，又能区别E. coli不同种系发育群(即致病性还是机会致病性或共生性大肠埃希氏菌)的检测鉴定方法，是E. coli鉴定和疾病诊断实践中急需解决的问题。Clermont O等采用chuA, yjaA和TSPE4. C2三个基因片段对大肠埃希氏菌种系发育群进行鉴定(Rapid and simple determination of the Escherichiacoli phylogenetic group.,Clermont 0,Bonacorsi S,Bingen E.,Appl EnvironMicrobiol. 2000 Oct; 66 (10) : 4555-4558.)。因为 chuA 存在于 B2 群和 D 群，而在 A 群和 B1群中不存在；同时，7」&八在B2群中为阳性，而在D群中为阴性，因此可将B2群和D群区别开来；TSPE4. C2存在于B1群中，但不存在于A群中，因此可用于区分B1群和A群。同时，由于大肠埃希氏菌均带有ompT基因，且通过对四群12株大肠埃希氏菌的ompT全基因克隆测序结果分析得到该基因具有高度保守性，同源率超过98%以上，因此，该基因可用于区分大肠埃希氏菌与其他菌的标志性基因。本发明正是基于以上原理，建立一种能够快速、准确的鉴定是否有大肠埃希氏菌以及属于哪个种系发育群的PCR试剂盒以及检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒，在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4. C2基础上引入E. coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，解决目前尚无一种既能快速区别E. coli与不同属成员，又能区别E. coli中不同种系发育群的检测试剂盒。本发明的另一目的是提供利用大肠埃希氏菌多重PCR试剂盒的检测方法。本发明通过以下技术方案来实现
一、一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括10XPCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，所述的引物为(I)检测ompT基因的引物上游引物序列5'-GCATAATTGAGTTGTGTATCAGGGT-3' (SEQ ID No. I)上游引物序列5'-GAACACTATGACCCAGGAAAAAGAA-3' (SEQ ID No. 2)(2)检测chuA基因的引物上游引物序列5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' (SEQ ID No. 3)上游引物序列5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' (SEQ ID No. 4)(3)检测yjaA基因的引物上游引物序列5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' (SEQ ID No. 5)上游引物序列5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' (SEQ ID No. 6)(4)检测TSPE4.C2基因的引物上游引物序列5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' (SEQ ID No. 7)上游引物序列5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3' (SEQ ID No. 8)。所述的各个组分的终浓度是每对引物的浓度分别为I. O μ mol/L, DNA聚合酶浓度为 O. 25U/ μ L, dNTP 浓度为 2mmol/L。二、一种使用上述的大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒的检测方法，该方法包括以下步骤( I)取待测样品，构建PCR反应体系(2) PCR 扩增，条件为:预变性 94°C 5min ;然后以 94。。40s、50°C 30s,72°C 40s 进行30个循环；最后72 °C 7min结束；( 3 )将扩增产物进行电泳检测；(4)根据ompT基因、chuA基因、yjaA基因、TSPE4. C2基因目标片段的有无，对是否是大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌种系发育群进行鉴定。采用上述技术方案的积极效果本发明在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4. C2基础上引入E. coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，四对引物联合使用，能够对待测样品是否为大肠埃希氏菌以及属于A、B1, B2, D哪个种系发育群进行快速鉴定，特异性高，并对多重PCR反应体系和条件进行了优化；该试剂盒的最低灵敏度为103CFU/mL，可检测出样品中的痕量DNA ;使用范围广，能够用于食品以及疾病诊断治疗应用。
图I是本发明的原理示意图；图2是本发明的试剂盒检测结构图；图中M:DNA Marke，1_4分别为A :大肠埃希氏菌C83919、B1 :大肠埃希氏菌2002-1、B2 :大肠埃希氏菌J96、D :大肠埃希氏菌0157H:7EDL933。图3是本发明的试剂盒特异性实验检测结果图；图中1 :弗氏志贺菌ATCC 12022，2 :肺炎克雷伯菌ATCC 35281，3 :普通变形杆菌ATCC 49027，4 :绿脓杆菌 ATCC 27853，5 :牛巴氏杆菌 CVCC 44702，6 :鸡沙门氏菌 CVCC520，7:奇异变形杆菌CVCC 1969，8 :无乳链球菌CAU 0306，9 :金黄色葡萄球菌ATCC 25923，10 :水，11 =B1 :大肠埃希氏菌2002-1与B2 :大肠埃希氏菌J96混合，M DNAmarker0图4是本发明的试剂 盒敏感性检测结果图。图中1-6 :1 X IO6、I X 105、I X 104、I X 103、I X IO2、I X 101CFU/mL, M =DNAmarker
具体实施例方式本发明中的生物材料来源的说明I、引物检测ompT基因的引物、检测chuA基因的引物、检测y j aA基因的引物、检测TSPE4.C2 基因的引物，分别命名为 ompT-l、ompT-2、chuA-Ι、chuA-2、yjaA-Ι、yjaA-2、TSPE4. C2-1、TSPE4. C2-2，是根据基因序列使用Oligo 6. O及DNAStar引物设计软件进行设计，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。2、菌种大肠埃希氏菌C83919 :购自国家兽医微生物菌种保藏中心；大肠埃希氏菌2002-1 :奶牛乳房炎肠杆菌OmpA的免疫原性分析及对小鼠感染模型的免疫保护效果评估，呼锐，樊自尧，佟春玉，迟佳琦，李闰婷，丁兆凤，陈龙欣，陈亮，于立权，马金柱，宋佰芬，朱战波，崔玉东，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集，2010年，363-366，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；大肠埃希氏菌J96 :尿路致病性大肠杆菌临床株I型菌毛FimH基因检测及分析，尹晓琳，王秀荣，胡洁，冯惠东，魏林，河北医科大学学报，2003年第24卷第03期，136-138页，该菌种由河北医科大学基础医学院魏林老师赠送给本申请人，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；另外，该生物材料还公开在奶牛乳房炎肠杆菌OmpA的免疫原性分析及对小鼠感染模型的免疫保护效果评估，呼锐，樊自売，佟春玉，迟佳琦，李闰婷，丁兆凤，陈龙欣，陈亮，于立权，马金柱，宋佰芬，朱战波，崔玉东，中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集中，2010年，363-366，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；大肠埃希氏菌0157H 7EDL933 :大肠杆菌0157噬菌体的分离鉴定及其初步应用，杜崇涛，硕士论文，授予单位吉林大学，导师冯书章，发表时间2008年；该菌种由吉林大学畜牧兽医学院杜崇涛老师赠送给本申请人，并由申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；弗氏志贺菌ATCC 12022，肺炎克雷伯菌ATCC 35281，普通变形杆菌ATCC 49027，绿脓杆菌ATCC 27853，金黄色葡萄球菌ATCC 25923均购自中国药品生物制品鉴定所；牛巴氏杆菌CVCC 44702，鸡沙门氏菌CVCC 520，奇异变形杆菌CVCC 1969，无乳链球菌CAU 0306，均购自国家兽医微生物菌种保藏管理中心。3、作为感受态细胞的DH-5a购自博美科生物技术有限公司。下面结合实施例和试验例对本发明做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制。实施例I
I、根据NCBI数据库已发表的序列号为AE014075的大肠埃希氏菌ompT基因序列，应用01igo6. O及DNAStar引物设计软件进行设计，上游引物位于基因的1-24位，下游引物位于938-954位反向互补。并在上、下游引物Y末端分别设计引入BamH I和Sal I限制性酶切位点，两端各加上保护性碱基。设计完的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下，下划线为酶切位点。ompT Forward Primer(Pf) 5/ ~GGCGTCGACTTAAAAGGTGTACTTAAGACCAGC~3; (SEQID No. 9)ompT Reverse Primer(Pr) 5 ' ~CGGGATCCATGCGGGCGAAACTTCT~3 ' (SEQ IDNo. 10)2、对大肠埃希氏菌C83919、大肠埃希氏菌2002-1、大肠埃希氏菌J96、大肠埃希氏菌0157H 7EDL933进行PCR扩增，以9种菌为对照，验证ompT基因是E. coli特异性基因并在大肠埃希氏菌中广泛存在。PCR反应条件为94°C预变性5min;94°C 45s,60°C 45s,72°C I. 5min，30个循环；72°C IOmin0 PCR反应结束后，各PCR产物分别取3 μ L PCR在1.0% 琼脂糖凝胶上进行电泳。紫外灯下观察结果，用凝胶成像系统照相。结果四个菌群的大肠埃希氏菌都具有ompT基因，并且9种对照菌PCR结果均未见目的条带。可见，ompT基因为大肠埃希氏菌的特异性基因。PCR产物进行回收纯化，连接到PMD18-T载体上，转化到大肠埃希氏菌DH-5a的感受态细胞中；提取重组质粒；采用PCR和BamH I、sal I双酶切方法对重组质粒进行鉴定；把鉴定为阳性的pMD18-T/ompT重组克隆菌，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。应用用DNAStar软件对测序结果进行比对分析。结果是该基因具有高度保守性，同源率超过98%以上。3、根据上述对四群ompT序列DNAStar软件比对分析结果,选取ompT中内部保守性高又与其它菌株有高度特异性的区域，采用01igo6. O及DNAStar软件设计引物，并送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。ompT Forward Primer(Pf) 5 ' -GCATAATTGAGTTGTGTATCAGGGT-3 ' (SEQ IDNo. I)ompT Reverse Primer(Pr) 5 ' -GAACACTATGACCCAGGAAAAAGAA-3 ' (SEQ IDNo. 2)4、对四株大肠埃希氏菌(大肠埃希氏菌C83919、大肠埃希氏菌2002-1、大肠埃希氏菌J96、大肠埃希氏菌0157H:7EDL933)和9株其他对照菌(弗氏志贺菌ATCC 12022、肺炎克雷伯菌ATCC 35281、普通变形杆菌ATCC 49027、绿脓杆菌ATCC 27853、牛巴氏杆菌CVCC44702、鸡沙门氏菌CVCC 520、奇异变形杆菌CVCC 1969、无乳链球菌CAU 0306、金黄色葡萄球菌ATCC 25923)提取全基因组DNA作为模板进行PCR扩增。PCR扩增条件为94°C预变性 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s, 30 个循环；72°C 7min。PCR 结束后，分别取 3 μ L PCR产物用I. 0%的琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察。ompT片段检测结果实验室四株大肠埃希氏菌和其它9种对照菌株的PCR检测结果与ompT全基因检测结果一致。实施例2取本发明试剂盒中的混合液，用蒸馏水做10倍稀释，稀释后取18 μ I加入PCR中，加入灭菌牙签挑取的菌落或者2μ I菌种DNA，即将待测菌煮沸离心后取得的上清液，构成PCR反应体系；其中，各个组分的终浓度是每对引物的浓度分别为I. Oymol/UDNA聚合酶浓度为O. 25U/yL，dNTP浓度为2mmol/L，其余为IOXPCR反应缓冲液。弓丨物为(I)检测ompT基因的引物上游引物序列5'-GCATAATTGAGTTGTGTATCAGGGT-3' (SEQ ID No. I)上游引物序列5'-GAACACTATGACCCAGGAAAAAGAA-3' (SEQ ID No. 2)(2 )检测chuA基因的引物上游引物序列5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' (SEQ ID No. 3)上游引物序列5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' (SEQ ID No. 4)(3)检测yjaA基因的引物上游引物序列5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' (SEQ ID No. 5)上游引物序列5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' (SEQ ID No. 6)(4 )检测TSPE4. C2基因的引物上游引物序列5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' (SEQ ID No. 7)上游引物序列5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3' (SEQ ID No. 8)将加样后的PCR管按以下反应条件在PCR仪上进行扩增预变性94°C 5min ;然后以 94°C 40s,50°C 30s,72°C 40s 进行 30 个循环；最后 72°C 7min 结束；将扩增后的产物在1%琼脂糖凝胶O. 5 X TBE或TAE缓冲液中电泳，经Goldview或EB染色后用凝胶成像系统分析记录结果； 如图I所示，观察电泳图中354bp的ompT基因片段、279bp的chuA基因片段、21 Ibp的yjaA基因片段、152bp的TSPE4. C2基因片段的有无，判定待检菌是否是大肠埃希氏菌并属于A、BpB2、D那个种系发育群。如果有ompT基因片段，说明该菌是大肠埃希氏菌；有ompT基因片段、chuA基因片段和yjaA基因片段属于大肠埃希氏菌B2亚群；有ompT基因片段、chuA基因片段、无yjaA基因片段属于大肠埃希氏菌D亚群；有ompT基因片段、无chuA基因片段，有TSPE4. C2基因片段的属于大肠埃希氏菌B1亚群；有ompT基因片段、无chuA基因片段，无TSPE4. C2基因片段的属于大肠埃希氏菌A亚群；无ompT基因片段的不属于大肠埃希氏菌。实施例3选用A :大肠埃希氏菌C83919、B1 :大肠埃希氏菌2002_1、B2 :大肠埃希氏菌J96、D :大肠埃希氏菌0157H:7EDL933作为实验对象，实验过程同实施例I。如图2所示，PCR扩增后，可扩增到354bp的ompT基因片段、279bp的chuA基因片段、211bp的yjaA基因片段、152bp的TSPE4. C2基因片段的清晰条带。试验例I本发明的试剂盒特异性试验分别对9种照菌株(弗氏志贺菌ATCC 12022、肺炎克雷伯菌ATCC 35281、普通变形杆菌ATCC 49027、绿脓杆菌ATCC 27853、牛巴氏杆菌CVCC 44702、鸡沙门氏菌CVCC 520、奇异变形杆菌CVCC 1969、无乳链球菌CAU 0306、金黄色葡萄球菌ATCC 25923)进行扩增，同时设B2群大肠埃希氏菌标准株基因组混合DNA模板作为阳性对照、以灭菌双蒸水为模板作为阴性对照以检验该方法的特异性。如图3所示，采用所建立的多重PCR方法对BI、B2代表株DNA混合物进行扩增可获得大小分别为354bp、279bp、211bp和152bp的4条清晰的目的条带，但阴性对照灭菌双蒸水和9种对照菌弗氏志贺菌ATCC 12022、肺炎克雷伯菌ATCC 35281、普通变形杆菌ATCC 49027、绿脓杆菌ATCC 27853、牛巴氏杆菌CVCC 44702、鸡沙门氏菌CVCC 520、奇异变形杆菌CVCC 1969、无乳链球菌CAU0306、金黄色葡萄球菌ATCC25923均未能扩增出任何条带。说明本发明的多重PCR试剂盒特异性非常高，不会扩增出非目的片段。试验例2本发明的试剂盒敏感性试验分别将BI、B2群大肠埃希氏菌标准株菌液经菌落平板计数后分别稀释成I X 108、
IX 107、I X IO6、I X 105、I X 104、I X 103、I X IO2、IXIOiUX 10°CFU/mL,取每一稀释度标准株菌液lmL，离心后分别按上述方法制备模板，然后将每个稀释度的两组模板混合后进行多重PCR扩增，以验证该方法的敏感性。如图4所示，敏感性试验结果表明，A、BpB2、D型模板浓度分别大于I X 103CFU/mL时开始出现大小为354、279、211bp和152bp的清晰目的条带，条带亮度随着菌液(模板)浓度的增加而增加。证明本实验所建立的大肠埃希氏菌鉴定及A、BpB2、D亚群分型多重PCR检测方法可检测的最低灵敏度为103CFU/mL，灵敏度高，可检测出 样品中的痕量DNA。
权利要求
1.一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括IOXPCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，其特征在于所述的引物为 (1)检测ompT基因的引物 上游引物序列5' -GCATAATTGAGTTGTGTATCAGGGT-3' (SEQ ID No. I) 上游引物序列5' -GAACACTATGACCCAGGAAAAAGAA-3' (SEQ ID No. 2) (2)检测chuA基因的引物 上游引物序列5' -GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' (SEQ ID No. 3) 上游引物序列5' -TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' (SEQ ID No. 4) (3)检测yjaA基因的引物 上游引物序列5' -TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' (SEQ ID No. 5) 上游引物序列5' -ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' (SEQ ID No. 6) (4)检测TSPE4.C2基因的引物 上游引物序列5' -GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' (SEQ ID No. 7) 上游引物序列5' -CGCGCCAACAAAGTATTACG-3' (SEQ ID No. 8)。
2.一种使用大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于所述的各个组分的终浓度是每对引物的浓度分别为I. O μ mol/L, DNA聚合酶浓度为O. 25U/ μ L，dNTP浓度为 2mmol/L。
3.一种使用大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤 (1)取待测样品，构建PCR反应体系 (2)PCR 扩增，条件为:预变性 94°C 5min ;然后以 94°C 40s,50°C 30s,72°C 40s 进行 30个循环；最后72°C 7min结束； (3)将扩增产物进行电泳检测； (4)根据ompT基因、chuA基因、yjaA基因、TSPE4.C2基因目标片段的有无，对是否是大肠埃希氏菌及大肠埃希氏菌种系发育群进行鉴定。
全文摘要
本发明提供了一种大肠埃希氏菌PCR检测试剂盒，包括10×PCR反应缓冲液，dNTP，引物和DNA聚合酶，其中，引物包括检测ompT基因的引物、检测chuA基因的引物、检测yjaA基因的引物和检测TSPE4.C2基因的引物。本发明在大肠埃希氏菌三个种系发育群判定基因chuA，yjaA和TSPE4.C2基础上引入E.coli特异性基因ompT片段，建立四重PCR扩增体系，四对引物联合使用，能够对待测样品是否为大肠埃希氏菌以及属于A、B1、B2、D哪个种系发育群进行快速鉴定，特异性高，可检测出样品中的痕量DNA，能够用于食品以及疾病诊断治疗应用。
文档编号C12Q1/68GK102690889SQ20121019992
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者佟春玉, 宋佰芬, 崔玉东, 朱战波 申请人:黑龙江八一农垦大学