专利名称：可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-dna复合物及其制备方法和在检测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA的检测技术领域，尤其涉及一种可用于DNA检测的复合物及其制备方法和在DNA检测中的具体应用。
背景技术：
发展一种便携式传感器，用于快速、低成本并且能够在住所或事发地实时定量地检测目标物(例如离子、小分子、DNA、蛋白质、病毒等)，是人们长期以来的梦想。此类产品的开发对于科学研究、环境监测、疾病的诊断均具有重要意义。近年来，便携式检测仪器的研究取得了重大进展，尿酸仪和血糖仪等便携式检测仪器已经商业化，基本满足了大众对于某些疾病，在个人疾病诊断和预防方面的需求，改善了数以万计疾病患者的生活。血糖仪和尿酸仪的巨大成功，正体现了人们对于发展便携式传感器的迫切需求。 尿酸为嘌呤代谢的终产物，各种嘌呤氧化后生成的尿酸随尿排出，因溶解度较小，体内含量过多时会形成尿路结石或痛风，另外白血病、肾病、多发性骨髓瘤、恶性肿瘤、真性红细胞增多症等都会在临床上反应出尿酸含量升高。因此，对体内尿酸含量的灵敏检测具有重要的意义(成人体内尿酸的正常含量范围90 420 μ M)，尿酸仪就是应这一需求而发展起来的一种家庭便携式检测仪器。然而，现有的尿酸仪作为一种便携式的尿酸检测仪器，目前仅用于血液中尿酸的检测。另一方面，DNA的检测方法也开始越来越多地受到人们的重视和关注，在生物学领域有着广阔的应用前景。作为被广泛使用的检测DNA的方法，有PCR (聚合酶链反应)和DNA探针法，这两种方法虽然都可以实现对目标DNA的灵敏检测，但是都需要昂贵的专业仪器设备，且必须在专业实验室内进行。如果能够开发一种利用常见的便捷式检测仪器即可实现DNA检测的方法，这对于本领域技术人员而言，将是一项具有重要意义的革新。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物及其制备方法和在目标DNA检测中的应用，以达到对目标DNA进行便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高的检测目的。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物为长链式分子结构，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子一端为黄嘌呤氧化酶，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于待检测目标基因上的辅助探针，所述黄嘌呤氧化酶和辅助探针之间是通过4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(Ν-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。上述的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物中，优选的,所述黄嘌呤氧化酶上含有氨基,所述辅助探针上修饰有巯基。更进一步的，所述4-(Ν_马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环I号位上通过羰基与所述黄嘌呤氧化酶上的氨基相连，所述辅助探针通过其上修饰的巯基连接至所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤(a)将O. 5mM 2mM的辅助探针(巯基修饰的辅助探针)溶液、O. 75M 2M的磷酸盐缓冲液和15mM 60mM的磷酸三(β-氯乙基)酯混合，室温下充分孵育(孵育的时间优选控制在Ih 2h)，再使用超滤离心管反复离心(优选至少在3次以上)；(b)将lmg/mL 5mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液与4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)振荡混合(二者混合时，要保证4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，二者摩尔比可以控制在I : (100 1000)，室温下振荡反应完全(振荡反应的时间优选为Ih 5h)，然后用超滤离心管反复离心(优选至少在3次以上)，得到sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液；
(c)将经上述步骤(a)处理后的辅助探针溶液和步骤(b)制得的SUlf0-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液混合，混合时辅助探针与黄嘌呤氧化酶的摩尔比控制在(5 20) : 1，室温下反应完全(反应时间优选为36h 54h)，再用超滤离心管反复离心(优选至少在3次以上)，即得到黄嘌呤氧化酶-DNA复合物。上述的制备方法，所述步骤(a)中使用的超滤离心管优选为3K超滤离心管。所述步骤(b)、(c)中使用的超滤离心管均优选为30K超滤离心管。所述超滤离心管反复离心时用到的缓冲液A优选为O. IM NaCl和O. IM磷酸盐配制成的pH值为7. 5的缓冲液。由于反应的基本原理和基本规律相同，本发明的合成方法可适用于各种序列的辅助探针，相应的可以制备得到各种目标序列的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种利用尿酸仪检测目标DNA的方法，包括以下步骤( I)取一金膜，对其表面进行清洗并吹干，然后在金膜表面铺上已打孔的硅橡胶片，形成反应室；(2)在所述反应室内加入针对目标DNA设计的捕获探针溶液，温育(温育时间优选为Ih 4h)后再用巯基己醇溶液使所述捕获探针上的非特异性结合位点封闭(封闭时的温育时间优选为O. 5h 2h)，构建得到可用于检测目标DNA的传感器；(3)继续向所述反应室内加入待测目标溶液，杂交反应后(杂交反应的时间优选控制在O. 5h 4h)用低盐缓冲液反复洗涤；然后加入上述方法制得的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的溶液，杂交反应后(杂交反应的时间优选控制在O. 5h 4h)，用低盐缓冲液反复洗涤；(4)继续向所述反应室内加入黄嘌呤溶液，充分反应后，用尿酸仪对反应后的产物进行检测；如果尿酸仪显示的结果为Lo，则表明待测目标溶液中不含目标DNA或目标DNA的含量过少(即被捕获在金膜表面的黄嘌呤氧化酶的量过少，不足以催化产生足够强的信号值);如果尿酸仪上显示有信号数值，则表明待测目标溶液中含目标DNA ;根据尿酸仪上信号数值的大小可以进一步判断待测目标溶液中DNA的浓度值。上述检测方法是通过“三明治”杂交方法将目标DNA和黄嘌呤氧化酶-DNA复合物依次捕获在金膜表面，被捕获在金膜表面的黄嘌呤氧化酶会催化后续添加的黄嘌呤溶液其生成尿酸，最后通过尿酸仪可实现信号的检测。上述的检测方法，所述步骤(2)中，捕获探针溶液的浓度优选为I μ M 2 μ M，所述巯基己醇溶液的浓度优选为O. 5mM 2mM。上述的检测方法，所述步骤(3)中，待测目标溶液优选是由缓冲液B稀释配制而成，所述缓冲液B是由O. 5M O. 9M NaCl和O. 06M O. 09M柠檬酸三钠配制成的pH值为7. O 7. 5的缓冲液。上述的检测方法，所述步骤(3)中，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的溶液优选是所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物分散于缓冲液A后配制而成，所述缓冲液A为O. IM O. 3MNaCl和O. IM O. 5M磷酸盐配制成的pH值为7. O 7. 5的缓冲液。上述的检测方法，所述步骤(3)中，所述反复洗涤用的低盐缓冲液优选为IOmM IOOmMNaCl和IOmM 50mM Tris-HCl配制成的pH值为7. O 8. O的缓冲液。上述的检测方法，所述步骤(4)中，黄嘌呤溶液的浓度优选为4mM 12mM，所述催化反应的时间75min 135min。上述的检测方法，所述各个步骤的操作过程均控制在室温下进行(特别优选为25。。)。本发明的上述技术方案利用黄嘌呤氧化酶-DNA复合物与目标DNA、捕获探针形成的“三明治”杂交结构，实现了将待测目标DNA与黄嘌呤氧化酶之间的联系，从而为利用尿酸仪检测目标DNA开辟了有效可行的途径。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明提供了一种新颖的信号获取方式，其不需要大型、复杂、昂贵的检测仪器和设备，利用简单、低成本的尿酸仪即可实现对目标DNA的有效检测，具有便携、简单、操作方便、灵敏度高、选择性高等优点，可以真正实现在事故地点或其他场合进行简便、实时的检测。由于本发明中利用的酶催化底物具有专一性、高效率等特点，其可明显地增强检测信号，从而实现对目标DNA高灵敏、高选择性地检测。由于本发明利用尿酸仪这样一种已经广泛商业化的产品实现了对DNA的有效检测，其在今后的DNA检测领域将具有广泛的应用前景。
图I为本发明实施例I中黄嘌呤氧化酶-DNA复合物合成的原理示意图。图2为本发明实施例I中黄嘌呤氧化酶-DNA复合物SDS-PAGE电泳表征图。图3为本发明实施例2、实施例3中检测方法的检测原理示意图。图4为本发明实施例2中尿酸仪的检测结果。图5为本发明实施例2中目标DNAl与传感器的杂交孵育时间的优化结果。图6为本发明实施例2中催化底物反应时间的优化结果。图7为本发明实施例2中催化底物浓度的优化结果。图8为本发明实施例2中对检测时操作温度的优化结果。图9为本发明实施例2中对检测特异性的考察结果。图10为本发明实施例2中对检测灵敏度的考察结果。图11为本发明实施例3中对检测灵敏度的考察结果。 图12为本发明实施例3中对检测特异性的考察结果。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例I :一种本发明的可用于尿酸仪检 测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物(参见图
I)，黄嘌呤氧化酶-DNA复合物为长链式分子结构，黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子一端为黄嘌呤氧化酶，黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于待检测目标基因上的辅助探针，黄嘌呤氧化酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。本实施例中黄嘌呤氧化酶和辅助探针之间通过连接臂连接的具体连接方式为黄嘌呤氧化酶上含有氨基，辅助探针上修饰有巯基，位于连接臂处的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环I号位上通过羰基与黄嘌呤氧化酶上的氨基相连，辅助探针则通过其上修饰的巯基连接至4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。本实施例的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的制备方法如图I所示，包括以下步骤(a)将30 μ L O. 5mM辅助探针、2 μ L IM磷酸盐缓冲液(ρΗ=5. 5)和2 μ L 15mM磷酸三氯乙基)酯(TCEP)混合，室温下孵育Ih;超滤离心管(3Κ)并使用Buffer A反复离心(3次以上)；(b)将400 μ L lmg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液与Img sulfo-SMCC振荡混合5min,并保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，然后放置在振荡恒温金属浴上室温下振荡Ih ;澄清的溶液再用超滤离心管(30K，BufTerA)反复离心(3次以上)，得到sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液；(c)将上述步骤(a)处理后的辅助探针溶液和步骤(b)制得的sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液混合(混合时辅助探针与黄嘌呤氧化酶的摩尔比控制在5 20 I即可)，室温下反应48h后，用超滤离心管(30K)反复离心(3次以上)，即可得到黄嘌呤氧化酶-DNA复合物。将制得的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物分散在BufferA中，4°C保存，备用。经实验验证，本发明方法合成的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物同时具有酶的催化能力与DNA的特性。本实施例中通过变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳对合成的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物进行了表征，结果如图2所示。本实施例中所采用的分离胶的浓度为12%，其中第一条泳道是Marker ;第二条泳道是本实施例制得的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物；第三条泳道是O. 5mM辅助探针+5mg/mL黄嘌呤氧化酶的混合物；第四条泳道是5mg/mL的黄嘌呤氧化酶。从图2中可以看出，单纯的黄嘌呤氧化酶、或者黄嘌呤氧化酶与辅助探针的简单混合物这两个样品在胶板上处于同一个位置，而本实施例的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的那个条带则处于黄嘌呤氧化酶的上方，这说明有黄嘌呤氧化酶-DNA复合物生成。上述的表征手段是以客观的反应原理和反应规律为前提，直接反应的是分子量的一个变化。在图I所示的合成路线中仅示出了一分子黄嘌呤氧化酶只与一条DNA结合形成复合物的情形，但实际上一分子黄嘌呤氧化酶可能存在10 20几个带有氨基的残基，因此并不能确定一分子黄嘌呤氧化酶上到底结合上了几条DNA，相应的，在电泳图上显示出的是一个相对较宽的带状条带。因此，即使一分子黄嘌呤氧化酶通过连接臂连接多条DNA时得到的复合物，同样在本发明的保护范围内。实施例2 本实施例中将用到以下的引物序列(所有DNA序列均购自上海生工生物工程技术有限公司)目标 DNA 1:5' -GGTTGTGAGGCGCTGCCCAAGCGA-3 '；捕获探针I :5 ' -CGCCTCACAACCAAAAAA-SH-3 ;；辅助探针I :5’ -HS-AAAAAAAAAAAATCGCTTGGGCAG-3'；单碱基错配DNAl (smDNAl) 5 ; -GGT TGT GAG GCG GTG CCC AAG CGA-3 ;；双碱基错配DNAl (dmDNAI) 5 ; -GGT AGT GAG GCG GTG CCC AAG CGA-3 ;； 三碱基错配DNAl (tmDNAI) 5 ; -GGTAGT GAG GCG GTG CCC TAG CGA-3 ;；随机序列DNAl (ranDNAI) 5 ; -TAC CAG TTGAGAACC CTGAAT CCG-3 ;。如图3所示，一种本发明的利用尿酸仪检测目标DNA的方法，包括以下步骤(I)将金膜表面分别用丙酮、乙醇、水清洗，然后用氮气吹干，铺上已打好孔的硅橡胶片PDMS，形成阵列式的反应室；(2)在每个反应室内进行以下的反应首先加入20 μ L2 μ M捕获探针，室温下孵育2h,用BufferA清洗后，每个反应室中加入20 μ LlmM的巯基己醇，室温下孵育30min后用BufferA清洗表面，构建得到可用于检测目标DNA的传感器；(3)继续向各个反应室内分别加入20 μ L不同浓度的待测目标溶液(包括含目标DNAl浓度为0ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、400ηΜ、800ηΜ的待测目标溶液)，各待测目标溶液用BufferB配制，室温下分别杂交60min，用Buffer D低盐缓冲系统反复洗涤；然后再分别加入20 μ L黄嘌呤氧化酶-DNAl复合物的溶液(该复合物是由黄嘌呤氧化酶和辅助探针I按照实施例I的合成方法生成的复合物)，室温下分别杂交Ih,用Buffer D反复洗漆去除未杂交的部分；(4)最后向各个反应室内分别加入I. 5mM的黄嘌呤溶液,经过90min的催化反应后，分别移取3. 3 μ L液体到尿酸试纸条上，用尿酸仪对信号进行获取。尿酸仪的检测结果如图4所示，当待测目标溶液中不存在目标DNAl时,尿酸仪显示的结果是Lo ;随着目标DNAl浓度的增加，尿酸仪上显示的数值不断增大。这充分说明，随着目标DNAl浓度的增力口，捕获在金膜表面的黄嘌呤氧化酶越多，其催化能力越强，因此在尿酸仪上显示的数值也相应增大。因此，通过尿酸仪上显示的数值可以间接定性、定量地反应待测目标溶液中目标DNAl的浓度，这充分验证了本发明检测方法的可行性。对目标DNAl与传感器的杂交孵育时间进行考察上述检测方法的步骤(3)中，将目标DNAl与金膜表面DNA传感器的杂交时间分别调整为20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min和90min进行实验,其余的操作步骤不变(选用的目标DNAl的浓度为400nM)，结果如图5所示，由图5可见，随着杂交时间的增加，尿酸仪的数值增大，并逐渐趋向平稳。当杂交时间为60min时,黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤达到最大值,因此,本发明中优选60min作为目标DNAl与传感器的杂交孵育时间。对催化底物反应时间的考察将底物黄嘌呤溶液的催化反应时间分别调整为45min、60min、75min、90min、105min、120min和135min,其余的操作步骤不变(选用的目标DNAl的浓度为400nM)，结果如图6所示，由图6可见，随着催化反应时间的增加，产生的尿酸越多，尿酸仪测出来的数值越大，但是当催化反应时间为90min时，基本达到最大值，因此本发明中优选采用90min作为黄嘌呤氧化酶催化反应的时间。对催化底物浓度的考察将底物黄嘌呤溶液的浓度分别调整为O. 5mM、lmM、
I.5mM、5mM、8mM、10mM、12mM (选用的目标DNAl的浓度为400nM)，其余的操作步骤不变，结果如图7所示，由图7可见，当黄嘌呤的浓度为5mM时达到平台期，此时尿酸仪的信号值最佳，因此本发明中选取5mM作为催化底物反应的最佳浓度(与上述实施例2中的浓度稍有不同)。
对反应温度的考察将构建好DNA传感器后的实验操作温度定依次调整为15°C、25°C、35 °C，其余操作步骤不变，催化底物的浓度定为5mM，催化反应时间定为90min，结果如图8所示，由图8可见，选取25°C作为检测操作的最佳温度。以上实施例2的检测操作也均是在25°C温度下进行。对检测特异性的考察我们还将上述待测目标溶液中用到的目标DNAl分别换成smDNAl、dmDNA K tmDNA I 以及 ranDNAl，四种基因序列浓度均配制为 O. 01ηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、400nM、800nM，其余步骤与实施例2中的检测操作步骤相同，结果如图9所示。由图9可以看出，dmDNA K tmDNA I以及ranDNAl基本没有响应；对smDNAl而言，随着浓度的增加，尿酸仪采集数据略有增加，但远小于同浓度的目标DNAl引起的信号，这说明本发明的检测方法具有很好的选择性和专一性。对检测灵敏性的考察在上述优化后的工艺条件下对浓度在IOpM I μ M范围内的目标DNAl进行检测，其结果如图10所示。由图10可知，目标DNAl的浓度与尿酸仪采集
500 6 V
数据成一定关系，其满足如方程^ = 198.1 + ——-，其中y表示尿酸仪采集的数据，X表示
59.7 + X
目标DNAl的浓度。由图10可知，本发明优选后的检测方法其检测下限为ΙΟρΜ。实施例3 本实施例中将用到以下的引物序列(所有DNA序列均购自上海生工生物工程技术有限公司)目标 DNA2 5 ; -TGG GAG GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGG TTAAAG GT-3 ;；捕获探针2 5 ; -TC CCC CAA CTC CTC CCA TTT TTT-SH-3 ;；辅助探针2 :5 ' -SH-TTT TTT TTT TTT ACC TTT AAC CTA ATC TCC-3 ;；单碱基错配DNA2(smDNA2):5' -TGG GAG GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGA TTAAAGGT-3 ;；双碱基错配DNA2 (dmDNA2) 5 ; -TGG GAG GAG TTG GGG GAGAAGATTAGATTAAAGGT-3 ;；三碱基错配DNA2(tmDNA2):5' -TGG GAG GAA TTG GGG GAG AAG ATT AGA TTAAAGGT-3 ;；随机序列DNA2(ranDNA2):5 ; -AAT TCA CAC CTG GGG GAG TAT TGC GGA GGAAGGTG-3 ;。如图3所示，一种本发明的利用尿酸仪检测目标DNA的方法，除了将实施例2中的目标DNAl替换为目标DNA2、捕获探针I替换为捕获探针2、辅助探针I替换为辅助探针2夕卜，其余的各步操作均与实施例2的操作步骤相同。由于辅助探针发生变化，实施例2中相应制得的黄嘌呤氧化酶-DNAl复合物也替换为黄嘌呤氧化酶-DNA2复合物。在工艺参数及条件的控制上，主要工艺参数选用实施例2优化后的工艺参数，检测操作的温度同样设定为25°C，催化底物黄嘌呤溶液的浓度同样定为5mM，催化反应的时间同样定为90min，目标DNA2与传感器的杂交孵育时间同样定为60min，其余工艺参数和条件与实施例2相同，在前述工艺步骤和工艺条件下，同样是分别对浓度为O I μ M的含目标DNA2的待测目标溶液进行检测。本实施例同样考察了对目标DNA2检测的灵敏度和选择性，其灵敏度的考察结果如图11所示。由图11可知，在4ρΜ ΙμΜ范围内，目标DNA2的浓度与尿酸仪采集数据成
一定关系，满足如方程
权利要求
1.ー种可用于尿酸仪检测目标基因的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，其特征在于所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物为长链式分子结构，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子一端为黄嘌呤氧化酶，所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的分子另一端为可杂交于待检测目标基因上的辅助探针，所述黄嘌呤氧化酶和辅助探针之间是通过4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐作为原料反应后生成的连接臂进行连接，所述连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。
2.根据权利要求I所述的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，其特征在于所述黄嘌呤氧化酶上含有氨基，所述辅助探针上修饰有巯基，所述4- (N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的脂肪环I号位上通过羰基与所述黄嘌呤氧化酶上的氨基相连，所述辅助探针通过其上修饰的巯基连接至所述4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团的五元杂环的3号位上。
3.ー种黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的制备方法，包括以下步骤 Ca)将O. 5mM 2mM的辅助探针溶液、O. 75M 2M的磷酸盐缓冲液和15mM 60mM的磷酸三氯こ基)酷混合，室温下充分孵育，再使用超滤离心管反复离心； (b)将lmg/mL 5mg/mL的黄嘌呤氧化酶溶液与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烧_1_羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐振荡混合，并保证4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐充分过量，室温下振荡反应完全，然后用超滤离心管反复离心，得到sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液； (c)将经上述步骤(a)处理后的辅助探针溶液和步骤(b)制得的sulfo-SMCC活化的黄嘌呤氧化酶溶液混合，混合时辅助探针与黄嘌呤氧化酶的摩尔比控制在(5 20) 1，室温下反应完全，再用超滤离心管反复离心，即得到黄嘌呤氧化酶-DNA复合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中，充分孵育的时间控制在Ih 2h ;所述步骤(b)中，振荡反应的时间为Ih 5h ;所述步骤(c)中，室温下反应的时间为36h 54h。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中使用的超滤离心管为3K超滤离心管；所述步骤(b)、(c)中使用的超滤离心管为30K超滤离心管；所述超滤离心管反复离心时用到的缓冲液A为O. IM NaCl和O. IM磷酸盐配制成的pH值为7. 5的缓冲液；所述超滤离心管反复离心时的重复离心次数至少在3次以上。
6.ー种利用尿酸仪检测目标DNA的方法，包括以下步骤 (1)取一金膜，对其表面进行清洗井吹干，然后在金膜表面铺上已打孔的硅橡胶片，形成反应室； (2)在所述反应室内加入针对目标DNA设计的捕获探针溶液，温育后再用巯基己醇溶液使所述捕获探针上的非特异性结合位点封闭，构建得到可用于检测目标DNA的传感器； (3)继续向所述反应室内加入待测目标溶液，杂交反应后用低盐缓冲液反复洗涤；然后加入含权利要求2所述的或者权利要求3 5中任一项制备方法制得的黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的溶液，杂交反应后，用低盐缓冲液反复洗涤； (4)继续向所述反应室内加入黄嘌呤溶液，充分的催化反应后，用尿酸仪对反应后的产物进行检测；如果尿酸仪显示的结果为Lo，则表明待测目标溶液中不含目标DNA或目标DNA的含量过少；如果尿酸仪上显示有信号数值，则表明待测目标溶液中含目标DNA ;根据尿酸仪上信号数值的大小可以进一歩判断待测目标溶液中DNA的浓度值。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，捕获探针溶液的浓度为I μ M 2 μ M，修饰捕获探针时的温育时间为Ih 4h，所述巯基己醇溶液的浓度为O. 5mM 2mM，巯基己醇溶液封闭时的温育时间为O. 5h 2h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，待测目标溶液是由缓冲液B稀释配制而成，所述缓冲液B是由O. 5M O. 9M NaCl和O. 06M O. 09M柠檬酸三钠配制成的PH值为7. O 7. 5的缓冲液；所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的溶液是所述黄嘌呤氧化酶-DNA复合物分散于缓冲液A后配制而成，所述缓冲液A为O. IM O. 3M NaCl和O. IM O. 5M磷酸盐配制成的pH值为7. O 7. 5的缓冲液；加入待测目标溶液后的杂交反应时间以及加入黄嘌呤氧化酶-DNA复合物的溶液后杂交反应的时间均控制在Ih以上；所述反复洗涤用的低盐缓冲液为IOmM IOOmM NaCl和IOmM 50mM Tris-HCl配制成的pH值为7. O 8. O的缓冲液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，黄嘌呤溶液的浓度为4mM 12mM,所述催化反应的时间为75min 135min。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法的操作过程均是在室温下进行。
全文摘要
本发明公开了一种黄嘌呤氧化酶-DNA复合物，其分子一端为黄嘌呤氧化酶，另一端为辅助探针，二者是通过sulfo-SMCC作为原料反应后生成的连接臂进行连接，连接臂包括4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷基团。该复合物的制备方法是先将辅助探针、缓冲液等混合、孵育，然后将黄嘌呤氧化酶与sulfo-SMCC振荡混合反应，最后将得到的辅助探针溶液和黄嘌呤氧化酶溶液混合。本发明的复合物可通过尿酸仪来检测目标DNA，其方法是取金膜预处理后加入捕获探针构建传感器；再加入待测目标溶液杂交后洗涤，加入复合物溶液杂交后洗涤；最后加入黄嘌呤，并用尿酸仪对反应产物进行检测。本发明的优点体现在操作方便、灵敏度高且选择性高。
文档编号C12N15/10GK102703596SQ20121020041
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者刘芳, 朱红志, 王柯敏, 王青, 羊小海, 翦立新 申请人:湖南大学