专利名称：一种禾谷孢囊线虫lamp快速检测方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种禾谷孢囊线虫LAMP快速检测方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术：
禾谷抱囊线虫(Heteroderaavenae Wollenweber, I 924),即 Cereal cystnematode (简称CCN，又名燕麦孢囊线虫)，是全世界范围内分布的禾谷类作物重要病原线虫。该线虫自1874年在德国被发现以来，目前在全世界40多个国家均有发生和危害，其中中国、澳大利亚、欧洲、印度、中东等地区的禾谷孢囊线虫病危害严重并遭受了巨大的经济损失。例如在澳大利亚禾谷孢囊线虫的危害面积达到了 200万公顷，一般产量损失23-50%，严重时损失73-89%，年经济损失约7200万澳元(Brennan J P, Murray GM.Aust ralian w heat disease assessing their economic import ance[J]. Agric.S c1.，1988，52(2) :176 一 183)。在欧洲主要的禾谷作物种植区，大约有50%以上的地块受到禾谷孢囊线虫的侵染，每年由禾谷孢囊线虫造成的经济损失约300万欧元(AlexanderH M, Julie M N,Nematode parasites of cereals. Plant parasitic nematodes insubtropical and tropical agriculture[M]. Second edition. CAB international2005:1 3 1-1 9 I);在印度，禾谷孢囊线虫引起小麦和大麦的“Molya”病害，小麦产量损失达 47. 2 %、大麦损失高达 87. 2 % (RivoalR. , Cook, R. , Nematode pests of cereals.1n:Plant Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. [B].Evaan K. et al. , Eds.Walling ford Press, UK, 1993，259-303)。在我国，禾谷孢囊线虫自1989年在湖北天门县矮黄麦株上首次发现以来[陈品三，王明祖，彭德良·我国小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae wollenweber)鉴定研究[J]·植物病理学报，1992，22(4) : 339-343]，目前在我国小麦主产区的河北、河南、北京、山西、内蒙古、青海、湖北、安徽等16省、市和自治区均有发生和分布，危害面积达400万hm2以上，且有逐渐蔓延之势 ，目前已成为危害我国麦类作物的重要病原线虫(彭德良等，我国小麦孢囊线虫的新发生分布地区.中国线虫学研究第二卷，2008，2:344-345;黄文坤，叶文兴，王高峰，龙海波，欧师琪，彭德良，宁夏地区禾谷孢囊线虫的发生与分布.华中农业大学学报，2011, 30(1) :74-77)。据调查，一般病田可减产20%_40%，严重地块减产达70%以上[彭德良，张东升，齐淑华，陈品三等，我国小麦孢囊线虫(Heterodera avenae)发生分布区域和防治初步研究.植物保护研究进展，1995，p53-56.中国科学技术出版社]。禾谷孢囊线虫可寄生禾本科植物的27属34种，对小麦、大麦、燕麦、黑麦等禾谷类作物危害严重[刘维志.病原植物线虫学[M].北京中国农业出版社，1998. 294-303.]。目前小麦禾谷孢囊线虫病已经对我国的麦类作生产构成了严重威胁，严重制约着麦类作物生产的发展，对该线虫做出快速准确的鉴定是当前麦类作物生产急需解决的问题。传统的孢囊线虫检测方法为形态学检测。禾谷类孢囊线虫组(Heteroderaavenae group)包括12个孢囊线虫种，其中禾谷孢囊线虫(H. avenae)和菲利普孢囊线虫(H. filipjevi)形态特征差异较小，主要差异为菲利普孢囊线虫具有明显的下桥(underbrige)结构。传统的形态学鉴定,耗时较多且需要很丰富的专业知识,很难满足目前的高通量快速检测的要求。随着分子生物学的发展，PCR等快速检测技术已经广发运用到植物线虫的快速检测中。目前运用到孢囊线虫的检测技术主要包括ITS-RFLP，PCR，real time PCR等。zheng等(2000)用Hinf I酶切欧洲H. avenae (A型)和印度群体(B型)后的结果与中国禾谷孢囊线虫均不相同，称其为“C型” (Zheng, J.，Subbotin S. A.，WaeyenbergeL.，Moens Μ. , Molecular characterization of Chinese Heterodera glycines andH.avenae populations based on RFLPs and sequences of rDNA—ITS regions. RussianJournal ofNematology2000，8:109-113.)。彭德良等(2003)扩增了中国小麦禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因的内转录间隔区，用AluI和RsaI酶切ITS扩增产物证明中国禾谷孢囊线虫ITS属于“B型”，HinfI酶切揭示出中国与摩洛哥禾谷孢囊线虫ITS之间存在明显差异(彭德良，Subbotin S. Α·，M. Moens.小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因(rDNA)限制性片段长度多态性研究.植物病理学报，2003，33 (4): 323-329)。Guiping Yan 和 Richard W. Smiley (2011)运用 rDNA-1TS 区域 RFLP 结合形态学鉴定的方法对美国部分地区的禾谷孢囊线虫进行了检测，该方法釆用6种限制性内切酶能够区分禾谷抱囊线虫和菲利普抱囊线虫(Yan，G. P.，SmileyR. W.，Distinguishing Heteroderafilipjevi and H. avenae Using Polymerase Chain Reaction-Restriction FragmentLength Polymorphism and Cyst Morphology. Nematology2010, 3:216-224. )。Fu 等对我国黄淮海麦区的禾谷孢囊线虫进行了 ITS和RFLP分析(Fu Boj Ian T. RileyiLi Honglianj etal. Molecular characterisation of cereal cyst nematodes in winter wheat on theHuang-Huai floodplain of China using RFLP and rDNA-1TS sequence analyses.Australasian Plant Pathol2011，40:277285)。在孢囊线虫模式线虫甜菜孢囊线虫的检测中，Amiri等通过对H. betae、H. cicer1、H. gly cines 和 H. medicaginis、H. schachti1、H. trifolii 的 ITS 序列进行分析，筛选出特异性引物SHF6，将此引物与AB28 (或ri)NA2)引物结合，构建了甜菜孢囊线虫一步双重 PCR 的检测方法(Amiri S.，Subbotin S. A.，Moens Μ·，An efficient meth od foridentification of the Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR withspecific primers. Nemato1. medit. 2001，29:241-246)。Subbotin S A, Peng D Lj Moens M_ (2001)运用双重PCR检测大豆孢囊线虫的方法，在一个PCR反应体系中同时运用通用引物D3A和D3B以及特异性引物GlyFl和ri)NA2，从52个大豆孢囊线虫群体中均扩增出两个DNA片断(181bp and345bp)，检测的敏感度高达单个抱囊、单头二龄幼虫的微量 DNA(Subboton S. A.，Peng D L，Moens Μ·，A rapid methodforthe identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines usingduplex PCR. Nematology 2001，vol. 3 (4) : 365-371 )。0u，S. Q.和 Peng D. L 釆用 RAPD 技术，获得了基于大豆孢囊线虫基因组DNA的特异性SCAR标记，同时和D2A和D3B相结合，发明了一步双重PCR方法检测大豆孢囊线虫。在PCR扩增条件下，大豆孢囊线虫群体都获得了 500bp 的特异性 SCAR 标记片段和 800bp 片段(0u S. Q.，Peng D. L，Li Y.，MoensM.，Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region (SCAR)primers. Nematology2008, 10(3):397-403)。
亓晓莉等采用RAPD的方法，研究出禾谷孢囊线虫特异性SCAR分子标记，该方法能够特异的将禾谷孢囊线虫与菲利普孢囊线虫、大麦孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和豌豆孢囊线虫区分开，检测灵敏度高达1/80条2龄幼虫(亓晓莉，彭德良，彭焕，龙海波，黄文坤，贺文婦.基于SCAR标记的小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)快速分子检测技术.中国农业科学，2012,45(21) :4388-4395)。同时，Ophel-Keller等开发出虫土壤中直接检测禾谷孢囊线虫的real time PCR检测技术,灵敏度达I个卵/lg(Ophel_Keller Kathy,McKayAlan, Hartley Di，Herdina and Curran, John. Development of a routine DNA—basedtesting servicefor soilborne diseases in Australia. Australian Plant Pathology,2008，37 :243-253)。以PCR为基础的分子鉴定方法一定程度上弥补了传统形态鉴定上的缺陷。但PCR检测需要PCR仪、凝胶电泳和成像系统(紫外仪)等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂，且需要分子生物学专业实验人员操作，以上检测只能在实验室条件下才可以检测，需要较长的时间，限制了 PCR检测方法在生产中的推广应用，在禾谷孢囊线虫发生分布调查中，迫切需要一种简便快捷的检测手段。循环恒温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification of DNA, LAMP)是2000年日本荣研株式会社Notomi等人开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。(NotomiT,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T, Watanabe K, Amino N and Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification ofDNA [J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28 (12) : e63.),该技术通过识别靶序列上6个特异区域的引物和利用具有链置换功能的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下能特异、高敏、快速地扩增靶序列。该技术技术有如下特点1)特异性强、灵敏度高。LAMP反应正针对靶基因序列的6-8个特异性位点设计出4-6条引物，相比普通其他分子检测方法具有更强的特异性。2)扩增反应时间短、设备要求简单。LAMP反应具有极高的扩增效率，30-90分钟内可将靶基因扩增IO9-1Oltl,同时扩增过程无需专业的PCR仪等设备，简单的水浴即可完成反应。3)检测结果可以肉眼直接观察，简便快捷。由于该检测方法具有特异性强，灵敏度高，快速简便等特点，目前已广泛引用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测中。但在植物病原线虫检测中的运用刚刚起步，2008年日本科学家首次利用LAMP技术建立了从病木中直接检测松材线虫LAMP检测的方法(Kikuchi T, AikawaT,OedaY, Karim N, Kanzaki N. A Rapid and Precise Diagnostic Methodfor Detectingthe Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated IsothermalAmplification. Nematology, 2009，12:1365-1369)。2011 年 Niu et al 等建立了南方根结线虫LAMP检测技术，能够从土壤和根结中检测出南方根结线虫(Niu J H, Guo Q X，JianH,Chen C L, Yang D,Liu Q, Guo Y D. Rapid detection of Meloidogyne spp.by LAMPassay in soil and roots. Crop Protection, 2011，8:1063-1069)和象耳豆根结线虫(NiuJ H, Jian H, Guo Q X, Chen C L, Wang X Y,Liu Q, Guo Y D. Evaluation of loop-mediatedisothermal amplification(LAMP)assays based on5S rDNA_IGS2regionsfor detectingMeloidogyne enterolobi1. Plant Pathology, 2011，02562. x)。2012 年彭德良首次以象耳豆根结线虫ITS为靶标，建立了象耳豆根结线虫LAMP快速检测技术，检测灵敏度达到1/200000 条幼虫(专利号201110034960)。2012 年彭焕等(Peng H, Peng D L, Hu X Q, He XF，Wang Q, Huang W K, He W T. Loop-mediated isothermal amplification for rapid andprecise detection of the burrowing nematode, Radopholus similis, directly fromdiseased plant tissues. Nematology, 2012, 14 (8) :977-986.)研究出从摧病植物组织中用LAMP快速和特异性检测香蕉穿孔线虫的方法，检测极限达1/20000条幼虫，灵敏度比常规PCR检测高100倍。除此之外，LAMP检测技术在禾谷孢囊线虫上尚无相关报道，本发明首次建立了禾谷孢囊线虫LAMP快速检测方法。
发明内容
本发明的目的是建立循环恒温扩增技术(LAMP)检测禾谷孢囊线虫的LAMP快速检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性强等特点，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。一种禾谷孢囊线虫LAMP快速检测方法，其特征在于其中LAMP反应体系所使用的引物是①HA5-F3 :5' -TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5' -TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGCTTCATTTGAGAACAATG-3' ;④HA5-FIP :5' -ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCATGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB :5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3' ;其中的LAMP反应体系包括 I)引物混合液外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L,内引物HA5-FIP和HA5-BIP 各1. 4 μ mol/L,环引物 HA5-LB 为 O. 4 μ mol/L ;2)反应混合液3.2mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/LKCl, 3mmol/LMgS04, lOmmol/L (NH4)2S04, 0. l%Triton x-100，8U Bst DNA 聚合酶大片段;3) I μ IDNA 模板；加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。其中LAMP反应条件如下将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入I μ IDNA模板，61 65°C保温 30 90min，85°C保温 lOmin。LAMP反应的最终产物中加入显色剂，轻甩离心管后观察。所述显色剂为SYBRgreen I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1:9。所述DNA模板的提取方法为挑取单个禾谷孢囊放入装有10 μ IddH2O的0. 2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用灭菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8 μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷冻30min。将离心管取出，在65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于 LAMP 和 PCR 反应，所述 LB 溶液为 500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT, 4. 5%Tween20,等体积混勻，过滤灭菌。上述任一检测方法在诊断植物、土壤的禾谷孢囊线虫感染情况或鉴别禾谷孢囊线虫中的应用。本发明利用循环恒温扩增技术(Loop-mediated isothermalamp Ii feat ion, LAMP)建立针对禾谷孢囊线虫的检测方法。本方法具有多条引物的扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于LAMP反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，荧光剂显色后可以用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条件下检测工作的使用，也适合在实验条件不足的室外检测。本发明的方案具体实施步骤如下1.线虫DNA提取试剂配制I) LB (Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCI, 10mmo I /I, Tris-HCl, 1 Smmol /I,MgCl2,1. Ommol/L DTT, 4. 5%Tween20,等体积混勻，过滤灭菌。2)蛋白酶 K :600 μ g/ml 蛋白酶 K。2. DNA 的提取挑取单个禾谷孢囊放入装有10 μ I ddH20的O. 2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用灭菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷冻30min。将离心管取出，在65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。3.禾谷孢囊线虫RAPD扩增及序列分析应用SCAR 标记弓丨物 0PD13-HaFl(5'-TGACGAGAACATATGATGGGGATGAT-3')和0PD13-HaRl (5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT—3')扩增禾谷孢囊线虫 SCAR 片段。PCR 扩增反应体系为50μ 1，PCR反应体系为10 X Buffer (含Mg2+) 5 μ I, IOmM dNTP4 μ 1，引物0PD13-HaFl 和 0PD13_HaRl (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) 0. 5μ I,模板DNA5y 1，灭菌(1(1!120补足至5(^ I。PCR扩增条件为95°C预变性5min，59°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ;35个循环；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR扩增后，取5 μ I扩增产物加I μ I加样缓冲液在1. 5%琼脂糖 凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。4.禾谷孢囊线虫LAMP引物设计根据禾谷孢囊线虫RAPD测序结果为模板，设计以下5条引物，序列如下①HA5-F3 :5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG-3' ;④HA5-FIP :5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCA TGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB 5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3' ;5. LAMP反应体系配置外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L,内引物HA5-FIP和 HA5-BIP 各1. 4 μ mol/L,环引物 HA5-LB 为 0. 4 μ mol/L, 3. 2mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 8)，I Ommol/L KCl, 3mmol/L MgSO4, I Ommol/L (NH4)2S04, 0. l%Triton x-100 和8U Bst DNA聚合酶大片段，I μ IDNA模板，用灭菌双蒸馏水补足25 μ I。6. LAMP反应扩增条件将以上混合液置于65°C恒温水浴中等温扩增75min，再85°C保温lOmin，反应结束后加入I μ I配制好的显色剂混匀后观察结果。7. LAMP结果检测结果可以采用以下两种检测方法I)将上述反应完的体系中加入I μ I的显色剂。轻晃混匀，即可观察；2)取3 μ I扩增产物在2%琼脂糖凝胶电泳中电泳可观察到梯形带；本发明所提供的禾谷孢囊线虫LAMP快速检测方法具有以下优点一、灵敏度高。对禾谷孢囊线虫的检测极限可达到1/200000条幼虫水平，比常规PCR检测禾谷孢囊线虫的检测灵敏度高100倍，也说明本发明设计的引物特异性非常好。二、特异性强。所用的特异引物根据禾谷孢囊线虫的RAro片段六个不同区域设计出5条引物，特异性比常规PCR要强。三、检测时间短。I小时左右可获得检测结果，比常规PCR检测缩短2 4h。四、不需要PCR仪。对仪器设备要求低，不需要任何PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个水浴锅或者保温瓶就可以完成检测。五、操作简单、结果明显。整个检测过程不涉及复杂仪器和设备，一般技术人员即可完成检测，结果容易辨别，通过不同颜色，肉眼即可观察结果，不需要繁琐的电泳和紫外观察。六、对人和环境友好。检测过程不需要使用EB等有毒试剂，对人和环境非常安全。综上所述，本发明具有比现有PCR技术检测禾谷孢囊线虫的方法具有更高的特异性、灵敏度和便携性。可以在实际生产中现场应用检测。该技术可应用于对禾谷孢囊线虫田间土壤样品及小麦孢囊线虫病的发生早期快速分子检测，具有实际的应用价值。
图1为禾谷孢囊线虫RAPD序列的LAMP弓丨物设计示意图，图2为禾谷孢囊线虫LAMP方法检测，
A为加荧光染料检测结果，1:阳性结果，具有绿色荧光，2 :阴性对照，为红褐色。B检测结果为电泳图，M:D2000DNA标准分子量(Takara)1:阳性结果，为LAMP扩增梯形条带，2 :阴性对照，无扩增产物。图3为禾谷孢囊线虫LAMP检测方法特异性检测结果图A为LAMP加荧光染料检测结果图，I为阳性，2 11为阴性，B为LAMP检测结果电泳图，图4为禾谷孢囊线虫灵敏度检测结果A为LAMP加荧光染料检测结果图，I 7分别为:单头线虫，10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和阴性对照。B为LAMP检测结果电泳图，M :D2000DNA标准分子量(Takara)，I 7分别为单头线虫，10-1、10_2、10_3、I O-4、I O-5、10_6 和阴性对照。C为普通PCR法检测结果电泳图，M D2000DNA标准分子量(Takara)，I 7分别为单头线虫，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、阴性对照。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。所述试剂均为市售，所用禾谷孢囊线虫本申请人实验室均有保存，可以免费向公众发放。主要试剂Taq DNA聚合酶购自天根公司；DNA marker购自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技术有限公司合成；pGEM_T EasyVector购于美国promega Pro K(蛋白酶K)购自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段购自New England Biolabs公司；SYBR green I购自 Invitrogen 公司。
实施例1禾谷孢囊线虫DNA的提取、RAPD扩增及序列分析1.1禾谷孢囊线虫DNA的提取挑取单个禾谷孢囊放入装有10 μ IddH2O的O. 2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用无菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷冻30min。将离心管取出，在65°C下温育90min，95°C反应IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应。1. 2禾谷孢囊线虫RAPD扩增及序列分析应用SCAR 标记引物 0PD13-HaFl(5'-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-GAT-3')和0PD13-HaRl (5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3' )扩增禾谷孢囊线虫特异性 SCAR 片段。PCR扩增反应体系为50 μ 1，PCR反应体系为10XBuffer (含Mg2+) 5 μ l,10mMdNTP4y 1，引物 0PD13-HaFl 和 0PD13-HaRl (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) O. 5 μ 1，模板DNA5y 1，灭菌ddH20补足至50 μ I。PCR扩增条件为95°C预变性5min，59°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ;35个循环；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR扩增后，取5 μ I扩增产物加I μ I加样缓冲液在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相回收、克隆和测序，序列测定由北 京六合华大基因科技有限公司完成。实施例2LAMP技术检测禾谷孢囊线虫方法的建立2.1LAMP 引物设计根据禾谷孢囊线虫 RAH)扩增序列测序结果，设计并筛选下述LAMP引物(见图1)，引物交上海生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下①HA5-F3 :5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP :5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG—3' ;④HA5-FIP :5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCA TGGCAAAGA—3' ;⑤HA5-LB :5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG—3' ;2. 2LAMP反应体系配置引物混合液外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L，内引物HA5-FIP和HA5BIP各1. 4 μ mol/L,环引物 HA5-LB 为 O. 4 μ mol/L ；反应混合液3.2mmol/LdNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/LKCl, 3mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04, 0. l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。2. 3LAMP反应扩增条件将以上混合液置于65°C恒温水浴中等温扩增75min，85°C保温lOmin，反应结束后加入I μ I配制好的显色剂混匀后观察结果(图2中Α)。取2 μ I产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外灯下观测并照相，可看到有LAMP的特征性梯形带(图2中B)。实施例3禾谷孢囊线虫LAMP特异性检测收集禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫、豌豆孢囊线虫、大麦孢囊线虫、南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、香蕉穿孔线虫(见表1)，分别提取其DNA作为模板与禾谷孢囊线虫DNA模板一起进行LAMP检测，以检测禾谷孢囊线虫LAMP检测方法的特异性。
表I供试的其它植物线虫群体样品代码及来源
权利要求
1.一种禾谷孢囊线虫LAMP快速检测方法，其特征在于其中LAMP反应体系所使用的引物是①HA5-F3 5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5'-GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG-3';④HA5-FIP 5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCATGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB 5'-CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3'。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中的LAMP反应体系包括1)引物混合液:外引物HA5-F3和HA5-B3各O.2ymol/L,内引物HA5-FIP和HA5-BIP 各1. 4ymol/L,环引物 HA5-LB 为 O. 4 μ mol/L ;2)反应混合液3.2mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8)，IOmmoI/L KCl, 3mmol/L MgSO4, IOmmoVL(NH4)2SO4, 0. l%Triton χ-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段;3)I μ I DNA 模板；加灭菌双蒸馏水补全到25 μ I。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其中LAMP反应条件如下将引物混合液和反应混合液混合均匀后加入I μ I DNA模板，61 65°C保温30 90min，85°C保温lOmin。
4.根据权利要求1-3任一所述的检测方法，LAMP反应的最终产物中加入显色剂，轻甩离心管后观察。
5.根据权利要求1所述的检测方法，所述显色剂为SYBRgreen I与PCR级DMSO的混合物，其体积比为1:9。
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述DNA模板的提取方法为挑取单个禾谷孢囊放入装有10 μ I ddH20的O. 2mL离心管中，液氮冷冻，取出后置于冰上，用灭菌的玻璃棒在离心管中转动至冰融化，将孢囊捅破，释放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的eOOyg/ml 蛋白酶K溶液，然后在-80°C下冷冻30min。将离心管取出，在65°C下温育90min，95°C反应 IOmin处理后上清液作为线虫DNA模板直接用于LAMP和PCR反应，所述LB溶液为500mmol/ L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT，4. 5%Tween20，等体积混匀，过滤灭菌。
7.如权利要求1-6所述的任一检测方法在诊断植物、土壤的禾谷孢囊线虫感染情况或鉴别禾谷孢囊线虫中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种禾谷孢囊线虫LAMP快速检测方法及应用。根据克隆得到的禾谷孢囊线虫RAPD序列，设计筛选5条LAMP引物HA5-F3、HA5-B3、HA5-FIP、HA5-BIP和HA5-LB；配制并优化了LAMP反应体系。通过对禾谷孢囊线虫DNA提取，环介导等温扩增、扩增产物显色和观察，从而快速检测出禾谷孢囊线虫。本发明的检测方法特异性强、灵敏度高、成本低廉、操作简便，在禾谷孢囊线虫快速检测和禾谷孢囊线虫病的早期和田间诊断方面具有很高的应用价值。
文档编号C12Q1/68GK103045751SQ20131002038
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月20日 优先权日2013年1月20日
发明者彭德良, 徐小琴, 彭焕, 亓晓莉, 黄文坤, 贺文婷, 姜道宏 申请人:中国农业科学院植物保护研究所