专利名称：一种筛选抗蓝耳病猪的usp18分子标记育种方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了一种筛选抗蓝耳病猪的育种方法，通过判断猪USP18基因5'调控区突变位点的多态性来进行选种，并人为地应用该突变位点实现抗蓝耳病猪的育种。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症(Porcine!^productive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)引起的一种病毒性传染病。PRRS导致妊娠母猪严重繁殖障碍，仔猪高死亡率以及各年龄段尤其仔猪的呼吸道疾病。猪的抗病性状属于中等遗传力水平的阈性状，由病毒引起的呼吸道疾病的抗性是可以遗传的。Halbur等首先报道了关于PRRSV在猪品种之间存在着遗传差异(Halburetal.，1998)。感染了 PRRV的杜洛克、皮特兰和长白猪在平均日增重，酶联免疫吸附测定的比值和PRRSV诱导的肺损伤方面都存在着差异Vincent et al.,2005)。Vincen等(2006)利用流式细胞仪测定了外周血单核巨曬细胞对PRRSV感染率的差异，将猪群分为高易感、低易感2个系，于6周龄接种病毒，发现高易感系在接种21d后临床症状更严重，且高易感系血清病毒滴度比低易感系高。Reiner等(2010)比较了德国地方品种小型猪和皮特兰猪感染PRRSV后临床状态，病毒量和血清抗体转换情况，发现皮特猪在感染后6d，病毒量达到最高，感染率为100%，小型猪在感染后12d病毒量达到高峰，感染率为87%，皮特兰猪病毒复制量比小型猪高，小型猪产生更有效的抗体，结果表明这两种猪 对PRRSV反应存在遗传差异。以上结果表明猪对PRRSV的抗性存在遗传差异，地方品种猪抗PRRSV的能力较强。猪不同品种间对PRRSV的抗性存在遗传差异，这为抗蓝耳病猪的育种提供了基础和前提。从蓝耳病的流行病学调查可以看出，易感猪多数为西方瘦肉型猪而我国的地方猪种染病的较少。大蒲莲猪是山东省体型较大的华北型黑猪，具有抗病耐粗、多胎高产、哺育能力强、肉质好等优良特性。调查显示，自2006年以来，在大批西方瘦肉型猪感染蓝耳病死亡的情况下，大蒲莲猪及大蒲莲猪为母本的二元杂交猪均表现出对PRRSV超强的抗病能力。因此如何利用该特性研究对PRRSV超强的抗病能力，成为本领域急需解决的问题。
发明内容
基于上述的原因，本发明通过筛选出猪抗蓝耳病相关的基因标记，建立猪分子标记辅助育种方法，为猪抗蓝耳病品种培育提供基因标记和技术方法。根据现有技术，发明人通过进一步的实验发现攻毒后大蒲莲猪和杜大长杂交猪USP18基因的表达存在显著差异，即攻PRRSV的大蒲莲猪USP18表达显著上调；通过对大蒲莲猪和杜大长杂交猪USP18基因
调控区的对比，发现一 1533位点A到G改变会引起转录因子FOXIla的结合，进而降低了 USP18基因转录的功能，因此可以以一 1533位点为A为分子标记选择USP18高表达的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗蓝耳病特性具有重要的意义，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
USP18 (ubiquitin specific proteasel8)编码去泛素化酶,属于泛素特异性蛋白酶家族中的一员，通过识别干扰素刺激应答元件启动子或与JAK竞争与α -干扰素受体2 (IFNAR2)的结合，负调控α-干扰素调控的信号通路；也是对α -干扰素敏感性及药物诱导细胞凋亡的负调控因子；它的突变导致α/β_干扰素信号通路的超活化并抑制STAT4诱导的Y-干扰素的产生，使小鼠对沙门氏菌易感(Richeretal.，2010);研究证实，去泛素化从细胞生长到先天性免疫反应等很多调控过程中都起着重要的作用，例如癌症、凋亡和疾病的感染(Johnston and Burrows2006)。USP18基因敲除掉小鼠胚胎成纤维细胞干扰素的表达增强，抵抗由VSV和SNV引起的细胞病变，表明USP18在抵抗病毒侵染的免疫反应中具有重要作用(Ritchie et al.，2011)。Zhang等(1999)的研究表明，猪感染PRRSV后，肺和扁桃体中USP18基因的表达显著上调，与发明人观察到的结果一致，表明USP18基因与猪的抗蓝耳病有关。USP18的过表达有降低猪PRRSV复制的作用(Ait-Ali et al.，2009)。本发明的发明人利用基因表达谱芯片及进一步荧光定量PCR验证的结果都表明，攻毒后大蒲莲猪和杜大长杂交猪USP18基因的表达存在显著差异，即攻PRRSV的大蒲莲猪USP18表达显著上调；通过对大蒲莲猪和杜大长杂交猪USP18基因5'调控区的对比，找到4处核苷酸序列的不同。并对一 1533位点存在的A/G多态进行了进一步研究。用TESS软件预测一 1533位点A到G改变引起转录因子FOXIla的结合。研究表明突变USP18基因一 1533位点的FOXIla结合位点(A突变为G)后，荧光素酶报告基因活性显著降低，提示FOXIla可能有增强USP18基因转录的功能。而USP18基因的高表达与对猪对蓝耳病的抗性有关。发明人认为通过分子标记筛选含有A等位基因的猪群进行育种，可以获得USP18闻表达的个体，对于提闻猪群的抗监耳病特性具有重要意义。因此通过分子标记选择CYP3A88低表达的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗病性具有重要的育种意义。据此本发明提供了一种筛选抗蓝耳病猪的育种方法，该方法是通过检测猪基因组中USP185'调控区一 1533位点的基因型实现的，所述的一 1533位点的基因为A的猪即为筛选出的目标。其具体步骤如下:(I)犾得待检测猪的基因组DNA ；(2)以上述猪基因组DNA为模板，利用引物USP18BF，其序列如Seq IDNo:5所示和USP18BR，其序列如Seq IDNo:6所示，扩增获得含有一 1533位点的USP185'调控区片段；(3)检测上述USP185,调控区片段内一 1533位点多态性；(4)选择USP185'调控区片段内一 1533位点的基因为A的猪即为筛选出的目标。筛选出的含有一 1533位点且一 1533位点的基因为A的USP185'调控区片段，其序列如Seq IDNo:8所示。综上所述，本发明人通过进一步的实验发现猪USP185'调控区一 1533位点A到G改变会引起转录因子FOXIla的结合，进而降低了 USP18基因转录的功能，因此可以以一1533位点为A为分 子标记选择USP18高表达的猪只组建基础群进行育种，对于提高猪群体的抗蓝耳病特性具有重要的意义，可见检测与突变相关联的分子标记不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
图1为USP18PF和USP18PR引物PCR扩增猪USP18启动子片段电泳图；图中，泳道I均为DLlOOOOmarker，泳道2为目的条带；图2大蒲莲猪和杜大长杂交猪荧光素酶活性比较结果示意图；图3为构建删除载体，转染Marc-145细胞荧光素酶检测结果示意图；图4为突变FOXIla位点后荧光素酶系统检测载体的表达变化示意图。
具体实施例方式在本说明书的上下文中，除非特别指明否则本说明书所用的任何术语具有本领域技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。实施例1猪USP185'调控区序列的克隆基因组提取:取大蒲莲猪和商品猪耳组织，按照TIANamp genomic DNA (天根)试剂盒说明书进行基因组DNA提取。根据NCBI(NCBI Reference Sequence:NC_010447.4)设计如下引物 USP18PF基因序列如Seq IDNo:1所示,USP18PR基因序列如Seq IDNo: 2所示,它包含了从转录起始位点下游22bp到上游246 Ibp的范围。
权利要求
1.一种筛选抗蓝耳病猪的育种方法，其特征在于:该方法是通过检测猪基因组中USP185'调控区一 1533位点的基因型实现的，所述的一 1533位点的基因为A的猪即为筛选出的目标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:具体步骤如下: (1)犾得待检测猪的基因组DNA； (2)以上述猪基因组DNA为模板，利用引物USP18BF，其序列如SeqIDNo:5所示和USP18BR，其序列如Seq IDNo:6所示，扩增获得含有一 1533位点的USP185'调控区片段； (3)检测上述USP185'调控区片段内一1533位点多态性; (4)选择USP185'调控区片段内一1533位点的基因为A的猪即为筛选出的目标。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:筛选出的含有一1533位点的USP185'调控区片段，其序列如Seq IDNo:8`所示。
全文摘要
本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及了猪USP18基因5′调控区突变位点的分子标记方法及其在猪抗蓝耳病育种中的应用，发明人发现在大蒲莲猪和杜大长杂交猪中USP185′调控区存在多处差异，其中－1533位点处存在有A到G突变，通过荧光素酶报告基因系统发现，将－1533位点A定点突变成G后其启动子活性显著降低，与抗蓝耳病的大蒲莲猪A等位基因频率高且USP18基因的mRNA表达水平高相一致。可见通过检测猪基因组中USP18基因调控区－1533位点的基因型作为与猪抗蓝耳病性状相关联的分子标记，不仅方法简便快速，而且不受环境影响，并可实现早期选种。
文档编号C12Q1/68GK103173539SQ201310019340
公开日2013年6月26日 申请日期2013年1月18日 优先权日2013年1月18日
发明者姜运良, 李艳平, 王鹏飞, 蒋成兰, 康丽, 王力圆 申请人:山东农业大学